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Resumo

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Resumo

A incorporação genética de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) através da supressão de códon de parada âmbar é uma técnica poderosa para instalar sondas artificiais e partes reativas para proteínas diretamente na célula viva. Cada ncAA é constituída por um dedicado ortogonais supressor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) par que é importado para o organismo hospedeiro. A eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode extremamente diferentes e insatisfatória, em alguns casos. Ortogonais pares podem ser melhoradas através da manipulação ou da raa ou o tRNA. No entanto, evolução dirigida de tRNA ou AARS usando grandes bibliotecas e métodos de seleção mortos/vivos não são viáveis em células de mamíferos. Aqui, apresenta-se um ensaio facile e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência de pares ortogonais em células de mamíferos. O ensaio permite a seleção de dezenas a centenas de variantes de RAA/tRNA com um esforço moderado e dentro de um prazo razoável. Uso deste teste para gerar novos tRNAs que melhoram significativamente a eficiência do sistema ortogonal Pirrolisina é descrito, juntamente com a aplicação de ncAAs ao estudo da proteína G acoplados receptores (GPCRs), que são difíceis de objetos para o ncAA mutagênese. Em primeiro lugar, incorporando sistematicamente uma foto-reticulação ncAA em toda a superfície extracelular de um receptor, locais obrigatórios de ligantes diferentes no receptor intacto são mapeados diretamente na célula viva. Segundo, incorporando ncAAs de última geração para um GPCR, ultra rápida do receptor livre de catalisador etiquetando com uma tintura fluorescente é demonstrado, que explora o opaco promovido a tensão inversa Diels-Alder cicloadição (SPIEDAC) sobre a célula viva. Como ncAAs pode geralmente ser aplicado para qualquer proteína, independentemente de seu tamanho, o método é de interesse geral para um número de aplicações. Além disso, a incorporação de ncAA não exige qualquer equipamento especial e é facilmente realizada em laboratórios de bioquímica padrão.

Introdução

A incorporação genética de sondas químicas em proteínas é um método poderoso para facilitar a investigação dos aspectos estruturais e dinâmicos da função da proteína diretamente no contexto nativo da célula ao vivo. Hoje em dia, centenas de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) equipados com os mais diferentes grupos químicos podem ser site-specifically incorporadas em proteínas de biossíntese1,2,3,4. Entre eles, reencontra-se foto-sensível ncAAs como crosslinkers-foto5, foto-enjaulado6,7,8,9 e foto-comutável aminoácidos10, 11, ácidos aminados, tendo tensas alcenos e alcinos por catalizador-livre opaco química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos carregando dansyl18, cumarina9,19e prodan20,21 fluorophores e aminoácidos equipados com outras sondas biofísicas como bem como com post modificações translacionais1,2,3,4,22,23,24,25.

A codificação genética de um ncAA é ativada por um dedicado amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) emparelhado com um supressor-tRNA cognato, que incorpora a ncAA em resposta a um codão stop âmbar durante a síntese ribossomal regular. pares de ncAARS/tRNA são projetados para serem ortogonais no organismo hospedeiro, ou seja, não a Cruz-conversa com os pares endógenos. A técnica é bem estabelecida, tanto em procariontes e eucariontes hospedeiros e células facilmente aplicáveis aos mamíferos. Pares para a incorporação da ncAA em células de mamíferos são baseados em três principais sistemas ortogonais: sistema de correntes, que combina o TyrRS de e. coli26 com um supressor de correntes âmbar de b. stearothermophilus27 (CE TyrRS / par deBstYam), o sistema (parCELeuRS/tRNALeuCUA ) Escherichia coli de leucyl6,18,28 e o sistema de pyrrolysyl de Archaea (PylRS/tRNA Pyl par)3, pelo qual o tRNAPyl é um supressor natural de âmbar. Em geral, cada ncAA é reconhecido por um ncAARS especializado. Dependendo da estrutura do ncAA, a ncAARS é obtido através de uma evolução dirigida de LeuRS, TyrRS ou PylRS, embora algumas sintetases podem aceitar mais de um ncAA.

O par ortogonal é importado para as células simplesmente usando um vetor do plasmídeo. Mais comuns e eficientes plasmídeos são bicistronic e codificam para a sintetase e o tRNA formando o par ortogonais29. Um plasmídeo segundo a codificação da proteína de interesse, tendo um códon âmbar no local designado para a modificação é co transfectada. O ncAA é simplesmente adicionado ao meio de crescimento de célula. No entanto, diferentes grupos especializados muitas vezes usam diferentes variantes do plasmídeo construções mesmo para a incorporação do ncAA mesmo. Construções diferem no arranjo dos genes no vetor, tipo da sintetase, uso de códon no gene da sintetase, uso do promotor, variante do tRNA e número de fitas de expressão do tRNA. Além disso, a eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode variar drasticamente devido a eficiência catalítica diferente dos sintetases diferentes, a qualidade do tRNA e outros fatores30. Portanto, é importante ter à mão um método rápido e confiável para avaliar a eficiência de um par de ortogonal, para escolher o sistema mais adequado para uma aplicação desejada e para executar algumas etapas de otimização que melhoram a expressão de proteínas totais rendimentos.

Nós estabelecemos um ensaio simples e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência dos pares ortogonais29 (Figura 1). No ensaio, as células são co transfectadas com o plasmídeo de codificação para o par ortogonal, juntamente com um plasmídeo do repórter bicistronic codificação tanto para a proteína verde fluorescente, tendo um códon âmbar parada em uma posição permissiva (EGFPTAG) e o gene mCherry. Vermelha e verde fluorescência da célula inteira lysates são lidos em canais separados em um leitor de placa em uma placa de 96 poços. A intensidade da fluorescência verde correlaciona diretamente com a eficiência da supressão de âmbar, Considerando que a intensidade da fluorescência vermelha dá uma estimativa direta do tamanho da amostra medida e a eficiência do transfection. No que diz respeito a ensaios semelhantes baseados em fluorescência assistida célula classificação (FACS) ler31,,32, o ensaio dá uma avaliação imediata e abrangente da expressão da proteína da população celular, que é mais representativo das condições experimentais habituais e oferece uma fácil aquisição de dados e processamento com software padrão. Em geral, a principal vantagem do ensaio é que um meio para um grande número de amostras pode ser analisado em paralelo. Usando este ensaio, tem exibido uma biblioteca racionalmente concebida de supressor-tRNAs para melhorar a eficiência do sistema ortogonal Pyl30. Este trabalho descreve o protocolo experimental para executar este ensaio e mostram exemplos de sua aplicação, incluindo a otimização do par ortogonal para a incorporação da foto-reticulação ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e a comparação de eficiências de incorporação de aminoácidos diferentes (Figura 2).

Nos últimos anos, foram comprovadas ferramentas ncAA muito poderosas para investigar estrutural e aspectos funcionais da proteína G acoplados a receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. em humanos, GPCRs formam uma grande família de receptores de membrana (800 membros) em representam os principais alvos para drogas terapêuticas. Caracterização estrutural direta de GPCRs é ainda um desafio e métodos bioquímicos complementares são altamente necessários para sua investigação. Nós temos pioneira no uso de foto-reticulação ncAAs para mapear as superfícies GPCR e descubra ligante vinculação bolsos34. Usando nosso sistema otimizado para incorporação de Azi, incorporamos sistematicamente Azi em todo o domínio de toda juxtamembrane de um GPCR diretamente em células de mamíferos vivas. Após irradiação UV, Azi forma uma espécie de nitrene altamente reativos que capta covalentemente a moléculas vizinhas. Quando o ligante é adicionado ao sistema, Azi serve como uma sonda de proximidade para revelar quais as posições do receptor vem perto do ligante ligado. Desta forma, o modo de ligação do hormônio neuropeptídeo Urocortin (Ucn1) no receptor da classe B GPCR corticotropin-liberando-fator digito 1 (CRF1R)33 foi primeiramente revelado. Ultimamente, nós temos divulgados padrões distintos de ligação dos agonistas e antagonistas sobre o mesmo receptor38. Uma abordagem semelhante foi aplicada por outros para revelar orthosteric e sítios de ligação alostéricos de outros peptídeos e ligantes pequena molécula em outros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito descreve o protocolo experimental aplicado em nosso laboratório para foto-reticulação mapeamento de superfícies GPCR. O método é relativamente rápido, simples e não requer nenhum equipamento especial, para que seja aplicável em laboratórios de bioquímica padrão. Importante, a abordagem fornece uma ferramenta valiosa não apenas para identificar sites de ligação do ligante onde dados estruturais 3D são escassos, mas também para complementar o existente em vitro dados com informações de receptores post-translationally totalmente modificadas na ambiente fisiológico da célula ao vivo.

O desenvolvimento recente do romance ncAAs rolamento sobre os lado da cadeia grupos químicos apropriados para ultra livre de catalisador opaco química abriu a possibilidade de instalar fluorophores de última geração para a imagem latente de super-resolução nas proteínas diretamente sobre o live células2,43. Tais âncoras químicas incluem cyclooctyne tensa em SCOK14, biciclo [6.1.0] nonyne na BCNK12,17e trans-cyclooctenes no TCO * K13,15,17 , entre outros ncAAs abrigando um norbornene16,17,44 ou,ciclopropeno4546 moiety. NcAAs volumosos para opaco química são incorporados por uma variante do PylRS geralmente denotado como PylRSAF (indicando a mutação Y271A e Y349F em M. barkeri PylRS), bem como por outras ad hoc evoluído ncAARSs17 , 44. as âncoras opaco reagem com reagentes de tetrazine47 via cicloadição de Diels-Alder elétron-demanda inversa para dar altos rendimentos rotulagem dentro de alguns minutos,43,48. No entanto, aplicação desta abordagem poderosa para rótulo GPCRs tem sido desafiador devido a uma baixa eficiência global do sistema ortogonal de incorporação da ncAA. Usando o nosso avançado sistema de Pyl, demonstrámos alto rendimento incorporação de tais aminoácidos GPCRs e ultra rápida GPCR rotulagem na superfície de células de mamífero vivo30recentemente. Rotulado de receptores foram ainda funciona, como eles fisiologicamente internalizado em cima ativando o receptor com um agonista. O protocolo experimental para a incorporação de opaco Ancora em GPCRs e etiquetando as etapas a seguir são descritas aqui. Equipar GPCRs com pequenas fluorophores brilhante é o primeiro passo fundamental para o estudo da dinâmica estrutural GPCR na célula ao vivo através de técnicas avançadas de microscopia.

Protocolo

1. baseado em fluorescência triagem das eficiências de incorporação (Figura 1)

  1. Manter as células HEK293 no meio modificado águia de Dulbecco (DMEM; alta glicose, glutamina 4mm, piruvato) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 100 de U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO2.
  2. As células da semente no dia anterior do transfection.
    1. Separe as células por 5 min a 37 ° C em 0.05% tripsina/PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL tripsina/EDTA para um prato de 10 cm. Saciar com 10 volumes de meio completo e ressuspender as células pipetando. Conte o número de células em suspensão usando um hemocytometer49.
    2. Semente 6.0 x 105 HEK293 células por poço de placas 6-poços em 2 mL de meio de crescimento completo. Prepare como muitos poços como o número de amostras e dois poços adicionais para o selvagem-tipo EGFP e uma amostra de simulação-transfectadas, respectivamente.
  3. Controlar a confluência (área ocupada pelas células) sob um microscópio. Transfect células na confluência de ~ 70% usando o reagente de polyethyleneimine (PEI).
    1. 1h antes de transfeccao, adicionar a quantidade apropriada da solução recentemente preparada ncAA todos os poços para uma concentração final de ncAA de 0,25-0,5 mM. Adicione o ncAA a todos os poços, incluindo o controlo positivo do selvagem-tipo e células transfectadas de simulação, para evitar que as diferenças em sinais de fluorescência que podem ser causadas pelos efeitos do ncAA no crescimento celular.
      Nota: Para preparar as soluções, dissolver o ncAA para 0.1-0.5 M usando 0.2-0.5 M de NaOH. No entanto, alguns ncAAs podem exigir inicial solubilização em DMSO e/ou neutralização por quatro volumes de 1m HEPES (pH 7,4) antes do uso. Comumente, o fabricante recomenda um protocolo para preparar uma solução de reserva.
    2. Em um tubo de microcentrifugadora, misture 1 µ g de Plasmideo DNA codificação para o par de ncAARS/tRNA para ser testado com 1 µ g de repórter do DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry). Em tubos separados, prepare um idêntico transfeccao usando a referência de tipo selvagem EGFP e um simulado transfeccao.
      Nota: Número de cópias da fita tRNA incorporado na codificação do plasmídeo para o par de ncAARS/tRNA depende da aplicação. Para facilitar a clonagem, 1 cópia de tRNA é recomendada quando o rastreio tRNAs diferentes, Considerando que 4 cópias são recomendadas (embora não estritamente necessário) quando ncAARS diferentes testes ou a incorporação de diferentes ncAAs pelo mesmo par ortogonal.
    3. Para cada tubo contendo DNA adicionar 100 µ l de solução salina tamponada (LBS) contendo lactato de sódio 20 mM no pH 4.0 e 150 mM NaCl de lactato. Misture rapidamente.
    4. A cada tubo contendo o DNA em LBS adicionar 6 µ l de 1 µ g / µ l PEI em LBS (relação PEI/DNA = 3/1 w/w) e vortex imediatamente. Incube a RT por 10-15 min.
    5. Pegue meio de celular 400 µ l de cada poço e adicioná-lo à mistura de DNA-PEI para neutralizar o pH. Drible a mistura de ADN em células.
      Nota: DMEM geralmente contém vermelho de fenol como indicador de pH. Durante a etapa de neutralização, a cor da mistura adicionada no tubo mudará de amarelo (ácido) para vermelho (neutro). Embora formar os complexos de DNA em libras em pH ácido dá o mais alto de rendimentos do transfection50, complexos DNA-PEI alternativamente podem ser formados diretamente no pH 7,4 (por exemplo em DMEM isento de soro). Se usando DMEM para formar complexos de DNA, ignore a etapa de neutralização 1.3.5. Em qualquer caso, é essencial que não soro está presente na mistura quando formando os complexos.
  4. Colheita do pós-transfection 48 h de células.
    1. Aspire o meio e lave-as células uma vez com 2 mL de PBS pré-aquecido (37 ° C). Acrescente 800 µ l de PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA e incube por 20 min a 37 ° C. Desanexar e suspender as células pipetando para cima e para baixo.
    2. Transferi a suspensão de eritrócitos para tubos de 1,5 mL contendo 200 µ l PBS suplementado com 5 mM de MgCl2.
    3. Centrifugar por 2min a 800 x g e descartar o sobrenadante.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Neste caso, congelam as pelotas no líquido N2 e armazenar a-80 ° C por até um mês. Use sempre óculos de proteção de olho.
  5. Juntar 100 µ l tampão de Lise Tris (pH 50 mM Tris-HCl 8.0, 150 mM de NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA e recém adicionado PMSF) para as pelotas de célula e incubar no gelo por 30 min. Para facilitar a Lise, vórtice cada 5 min.
  6. Spin para baixo os detritos celulares durante 10 minutos a 4 ° C e 14.000 x g e transferir 90 µ l do sobrenadante para pretas placas de 96 poços. Medir a fluorescência EGFP e mCherry usando um leitor de placa equipado com um módulo de fluorescência.
    Nota: Use filtros de excitação e emissão apropriados para EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) e mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Valores medidos EGFP irão abranger um intervalo entre o valor mínimo obtidos de células transfectadas de simulação e um valor máximo, que normalmente é obtido do selvagem-tipo EGFP. Cuida-se de configurar a janela de medição correta no instrumento.
  7. A eficiência da incorporação de ncAA é calculada como o rácio entre a fluorescência da amostra e a fluorescência obtidos de expressão do selvagem-tipo EGFP. Todos os valores são normalizados para fluorescência de mCherry.
    figure-protocol-5782

2. genética incorporação de ncAAs GPCRs para foto-reticulação mapeamento de ligante-GPCR interações (Figura 3)

  1. Manter HEK293T células em DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO2.
  2. Células da semente no dia anterior do transfection.
    1. Separe as células por 5 min a 37 ° C em 0.05% tripsina/PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL tripsina/EDTA para um prato de 10 cm. Saciar com 10 volumes de meio completo e ressuspender as células pipetando para cima e para baixo. Conte o número de células em suspensão usando um hemocytometer49.
    2. Semente 5.0 x 105 293T células por poço em 2 mL de meio de crescimento completo em placas 6-boas. Para cada posição será projectado, prepare 1 bem por ligante mais um bem para o controle de vinculação33,38. Um extra bem a transfected com o receptor do selvagem-tipo (wt) pode ser incluído para verificar o nível de expressão do mutante.
  3. No dia seguinte, controlar confluência (área ocupada pelas células) sob um microscópio. Transfect células na confluência de ~ 70% usando o PEI.
    1. 1h antes de transfeccao, adicionar Azi todos os poços a uma concentração final de 0.5 mM.
      1. Prepare uma solução stock de 0,5 M de Azi. Por placa de 6, pesa 1,2 mg Azi num tubo e dissolvê-lo em 15 µ l 0,5 M NaOH. Diluir a solução-mãe no meio completo de 1,2 mL e adicionar 200 µ l da mistura para cada poço.
        Nota: Prepare uma solução fresca de Azi para cada experimento. A fracção de azida tem uma meia-vida curta em soluções aquosas, especialmente em pH básico, e o AziRS incorpora a intacta, mas também a forma degradada.
    2. Transfect um montante total de 2 µ g DNA por alvéolo: 1 µ g de plasmídeo codificação para GPCR bandeira-marcados tendo um codão TAG na posição desejada e 1 µ g da codificação para o ortogonal par dedicado a Azi (E2AziRS51 e 4 cópias do cognato plasmídeo supressor-tRNA BstYam)33,38.
      Nota: Quando acompanhadas de uma comparação de wt para verificar os níveis de expressão, transfect uma menor quantidade de ADN do plasmídeo para o receptor do wt. Dependendo do GPCR, 0,2-0,5 µ g de plasmídeo codificação os níveis semelhantes de wt receptor rendimento como 1,0 µ g do plasmídeo mutante. Transfect a mesma quantidade de DNA em todos os poços, enchendo o DNA faltando com um mock (por exemplo, um vetor vazio).
    3. Proceda como descrito em 1.3.3-1.3.5.
    4. pós-transfeccao 48 h, prossiga com passo 2.4 para foto-reticulação de ligantes ou vá para a etapa 2.5 para colheita directa e análise para verificar a expressão do receptor.
  4. Foto-reticulação do ligante.
    1. Prepare uma solução stock de ligante de 1.000 x. Dissolva o ligante de peptídeo em uma concentração de 100 µM em DMSO.
      Nota: A concentração de ligante depende da constante de dissociação KD da interação ligante-GPCR. Uma concentração final de 100 x KD é recomendável. Se o ligante de peptídeo é um sal de ácido trifluoroacético (TFA), considere o peso do TFA quando o cálculo do peso molecular (1 x TFA por aminoácidos básicos em peptide). Além disso, considere que os peptídeos são em geral higroscópico. Evitar repetido congelamento de pó do peptide e nunca abrir um contêiner de peptídeo até que não chegou a temperatura ambiente.
    2. Diluir o 1:1,000 de solução estoque de ligante em tampão de ligação consiste em 0,1% BSA, 0,01% Triton X 100, 5 mM MgCl2 no tampão HEPES de dissociação (HDB) contendo ácido de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 12,5 mM 4 (HEPES)-HCl pH 7,4, 140 mM de NaCl e 5 mM KCl. preparar 1 mL por mutante Azi-GPCR. Substitua o meio celular com 1 mL da solução de ligante. Incubar durante 10 minutos a RT.
      Nota: Ajuste o tempo de incubação para GPCR específico, contabilidade para internalização de cinética e receptor ligante. Prolongar o tempo de incubação não melhora rendimentos de reticulação.
    3. A irradiação das amostras por 20 min em uma crosslinker UV a 365 nm, com 5 x 8 W tubos e ~ 5 cm de distância para as células. Separar as células pipetando e transferi-los para um tubo de reação de 1,5 mL. As células para 3 min a 800 x g de pelotas e descartar o sobrenadante.
    4. Dissolva um comprimido de inibidor da protease (PI) cocktail em 1 mL 25 mM EDTA/H2O, tornar-se uma solução stock de 50x. Alíquota do PI solução e armazená-lo a-20 ° C. Diluir o estoque 50 x 01:25 em HDB e ressuspender as pelotas de célula em 50 µ l de 2 x PI em HDB. Congelar as células no líquido N2.
      Nota: Use óculos de proteção de olho. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C por até um mês. Prossiga com a etapa 2.6.
  5. Colheita da pilha direto.
    1. Aspire o meio. Adicione 800 µ l de 0,5 mM EDTA em HDB. Incube durante 10 min no RT ou no gelo.
    2. Separar as células pipetando para cima e para baixo e transferi-los para um tubo de reação de 1,5 mL. Adicione 200 µ l de 5 mM MgCl2 em HDB. As células para 3 min a 800 x g de pelotas e descartar o sobrenadante.
    3. Resuspenda as pelotas de célula em 50 µ l de 2 x PI em HDB e congelamento flash em líquido N2. Use óculos de proteção de olho.
      Nota: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C por até 1 mês.
  6. Lise celular.
    1. Descongele as células em um banho-maria a 37 ° C por 30-45 s e vórtice brevemente. Não deixar amostras de agora em diante. Membranas de pelota em 2.500 x g e 4 ° C por 10 min. desprezar o sobrenadante, que contém a maior parte das proteínas citosólica.
    2. Resuspenda as pelotas em tampão de Lise HEPES 50 µ l contendo pH 50mm HEPES-HCl 7.5, 150 mM NaCl, glicerol 10%, 1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2, 1mm EGTA, 1 milímetro DTT e recém adicionado 2 x PI cocktail. Misture bem. Lise as células 30 min no gelo e vórtice cada 5 min.
    3. Spin para baixo os detritos celulares por 10 min a 14.000 x g e 4 ° C. Imediatamente transferi o sobrenadante para um tubo de reação fresca.
      Nota: Prosseguir com a análise agora mesmo. Os lysates podem ser armazenados a-20 ° C, no entanto, a cada ciclo de congelamento-descongelamento prejudica a qualidade dos resultados.
  7. Análise ocidental do borrão.
    1. Para preparar a amostra, tomar 3 a 5 µ l lisado e preenchê-lo até 7 µ l com H2O. adicionar 2 µ l 1 M DTT e amortecedor da amostra 4 x 3 µ l contendo pH 63 mM Tris-HCl 6,8, SDS 2%, 10% de glicerol e 0,04% bromofenol azul. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
    2. Quando GPCR é glicosilados e bandas de desmaio ou borradas são um problema, amostras de deglycosylate com PNGase F para aumentar a intensidade do sinal e aguçar as bandas. Use 3-5 µ l lisado e deglycosylate em um volume total de 10 µ l, seguindo o protocolo do fornecedor. Adicione 3 µ l 4 x amortecedor da amostra.
      Nota: Proteínas da membrana são frequentemente glicosilados em vários sites e Estados-Membros, o que prejudica a qualidade da resolução em análise de SDS-PAGE. No entanto, que não deglycosylate as amostras para análise do nível de expressão dos mutantes Azi-GPCR usando anticorpos antibandeira, porque é relevante para avaliar a parte o totalmente glicosilados, maduro do receptor na superfície da célula.
    3. Resolver as amostras através de SDS-PAGE padrão e borre a transferência de proteínas para uma membrana PVDF.
      Atenção: Acrilamida é neurotóxica. Use luvas e óculos de proteção.
    4. Bloquear a membrana para 1h no RT ou durante a noite a 4 ° C em 5% leite em pH de 20 mM Tris-HCl contendo TBS-T 7.4, 0.15 M NaCl e 0.1% Tween 20.
    5. Sonda a membrana com um anticorpo antiligante seguido o anticorpo secundário conjugado HRP. Entre lavar com TBS-T. Para detectar o nível de expressão do Azi-GPCR, sonda a membrana com um anticorpo HRP comercial (ver Tabela de materiais).
    6. Realizar a reação de quimioluminescência reforçada (ECL) usando o reagente de ECL caseiro e detectar sinais por 5 min no escuro.

3. ultra rápido opaco rotulagem dos GPCRs em células de mamíferos vivas

Nota: O protocolo é otimizado para as lamelas septadas 4-bem (área bem = 2,2 cm2). Para tamanhos bem diferentes, o protocolo deve ser dimensionado em conformidade.

  1. Revestimento de superfície de lâminas de microscópio. Realizar todo o processo sob uma capa de estéril.
    1. Preparar um hydrobromide poli-D-lisina (MW = 500-550 kDa) solução-mãe (PDL) a uma concentração de 1 mg/mL de tampão de borato de 50 mM (pH 8,5). Armazenar a 4 ° C por até 6 meses. Não congele.
    2. Diluir o PDL solução estoque 01:40 em água ultra-pura estéril para uma concentração final de 25 µ g/mL (solução de trabalho) e, em seguida, filtrar a solução através de um filtro de 0,22 µm estéril.
      Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C por até 3 meses.
    3. Cobrir totalmente o fundo de cada poço do slide microscopia com 500 µ l de solução de trabalho de PDL. Incubar durante 20 min em RT e aspirar a solução de trabalho de PDL.
      Nota: A solução de trabalho de PDL pode ser usada até três vezes. Se a solução precisa ser reutilizado, transferência da solução das lâminas revestidas de para um tubo estéril de fresco e rotular o tubo adequadamente. Nunca misture a solução reciclada com solução fresca.
    4. Lave cada bem 3x com ~ 700 µ l água ultra-pura estéril e deixar secar pelo menos 1 h.
      Nota: É muito importante lavar os poços com precisão, como resíduos da solução PDL são tóxicos para as células. As lâminas revestidas podem ser usadas imediatamente para microscopia ou armazenadas por até uma semana, a 4 ° C.
  2. Manter HEK293T células em DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO2.
  3. Células da semente no dia anterior do transfection.
    1. Separe as células por 5 min a 37 ° C em 0.05% tripsina/PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL tripsina/EDTA para um prato de 10 cm. Saciar com 10 volumes de meio completo e ressuspender as células pipetando. Conte o número de células em suspensão usando um hemocytometer49.
    2. Semente de 1,0 x 105 HEK293T células por poço (área 2,2 cm ²) em 600 µ l corante livre DMEM completa.
      Nota: Para fins de geração de imagens, é muito conveniente trabalhar desde o início em um meio que não contenha qualquer corante. Corante livre DMEM formulações estão disponíveis comercialmente.
  4. Controlar a confluência (área ocupada pelas células) sob um microscópio e transfect as células na confluência de ~ 70% usando um reagente de transfeccao baseada em lipídios.
    1. 1 h antes de transfeccao, prepare uma solução stock de 100mm fresco de TCO * K em 0,2 M de NaOH e DMSO 15% (v/v).
    2. Por bem, misturar 3 µ l do TCO * K solução estoque com 12 µ l de 1m pH HEPES 7,4. Adicionar a solução suavemente nos poços para um TCO final * K concentração de 0,5 mM.
    3. Prepare um montante total de 500 ng DNA por bem. Em um tubo de microcentrifugadora, diluir 200 ng de pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng de codificação para a MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonais par o plasmídeo (quatro fitas de tRNAM15) e 100 ng de pcDNA3.1_Arrestin3 plasmídeo no meio de 50 µ l (corante livre, livre de soro, antibiótico livre).
      Nota: Em geral, co transfeccao de Arrestin não é necessário observar a internalização GPCR. No entanto, co transfecting Arrestin3 acelera internalização da CRF1R, que é muito conveniente quando analisando a internalização de muitos mutantes.
    4. Diluir a 1,25 µ l do reagente de transfeccao baseada em lipídios (2,5 µ l por 1 µ g de DNA) no meio de 50 µ l (corante livre, livre de soro, antibiótico gratuito) e adicionar a solução para a mistura de DNA. Vórtice imediatamente e incubar 5-10 min a complexos de RT. Add DNA-lipídica para as células.
      Nota: Em nossa experiência, a morfologia das células transfectadas usando transfeccao baseada em lipídios parece mais fisiológica em comparação com o de células transfectadas com PEI. Como PEI dá maior eficiência de transfeccao, PEI deve ser preferido para aplicações a jusante como borrão ocidental, considerando transfeccao baseada em lipídios é uma escolha melhor para transfect células para experimentos de imagem.
  5. rótulo de transfeccao pós, 24 h o receptor com corantes fluorescentes.
    1. Prepare uma solução stock de corante-tetrazine de 0,5 mM em DMSO e um 10 mg/mL de DNA solução corante de coloração em ultra-pura H2O.
    2. Transferi o meio de 100 µ l de cada poço em um tubo de reação de 1,5 mL. Adicione 1,8 µ l da solução corante-tetrazine e 0,3 µ l do DNA solução corante de coloração. Transferir o meio contendo os corantes para o bem e incubar durante 5 min a 37 ° C.
      Nota: Tetrazine-laranja-fluorescente tintura tem uma concentração final de 1,5 µM.
    3. Aspire o meio e lave delicadamente as células duas vezes com PBS para remover o excesso de corante. Adicionar 600 µ l de tintura completa médio de crescimento livre pré-aquecido a 37 ° C.
  6. Internalização de microscopia e receptor de fluorescência.
    1. Visualizar os receptores etiquetados abaixo dos 63 x (ou similar) ampliação usando filtros adequados para as boas práticas agrícolas (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), tintura de laranja-fluorescente (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) e DNA coloração tintura (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Tire uma foto com cada filtro antes de ativar o receptor.
    2. Promover a internalização do receptor usando 200 nM de Ucn1.
      1. Prepare uma solução de estoque 1.000 x Ucn1 de 200 µM em DMSO.
        Nota: Dependendo da solubilidade do peptide, você pode ser capaz de preparar o estoque em água pura ou buffer.
      2. Meio de 100 µ l de transferência de um bem em um tubo de reação de 1,5 mL e adicionar 0,6 µ l de solução-mãe agonista do peptide. Transferi a médio de volta dentro do poço.
      3. Observe a internalização sob o microscópio. Tirar fotos após a ocorrência claramente detectável de interiorização (10-15 min a horas, dependendo do receptor e a superexpressão de Arrestins) usando os filtros mencionados anteriormente.

Resultados

O esboço do ensaio da fluorescência é retratado na Figura 1. O ensaio é empregado em três aplicações. Em primeiro lugar, um número de variantes de tRNA para incorporação de Lys(Boc) pelo par Pyl ortogonais é selecionado. Lys(BOC) é um aminoácido estericamente semelhante ao Pyl. Como Pyl não está comercialmente disponível, Lys(Boc) é comumente usado como um substrato padrão para o PylRS. Os tRNAs selecionados baseiam o tRNAPyl. Cad...

Discussão

O protocolo descreve um ensaio simples e confiável para avaliar a eficiência de pares ortogonais para a incorporação de ncAAs proteínas expressado em células de mamíferos. A principal vantagem deste método em relação aos ensaios amplamente utilizados, com base na FACS é que permite a preparação simultânea e medição de um maior número de amostras e fornece dados que facilmente são analisados usando um software comum. A disponibilidade de um rendimento médio método para analisar pares ortogonais em cél...

Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito para declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi fundado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sob bolsas CO822/2-1 (programa de Emmy Noether) e CO822/3-1 ao I.C.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammonium persulfate (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi)BachemF-3075.0001
Boric acidSigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Bovine serum albumine (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) home-made10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher (Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerolCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrüssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-Coumaric acidSigma-AldrichC9008-1G
poly-D-lysine hydrobromideCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Protease InhibitorRoche11873580001
PVDF membrane Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Skim Milk Powder Sigma70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazine-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSThe huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmidsPlasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGSynthesized by Genart (Life Technologies)Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate Sigma-AldrichA8592 monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibodySanta Cruzsc-2004
Rabbit-anti-CRF antibodyhome-madePBL #rC69polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibodyhome-madePBL #5779polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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