Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Resumo

Manipulação genética, especificamente no coração significativamente potenciar a investigação de doença cardíaca pathomechanisms e seu potencial terapêutico. Na vivo entrega cardíaco-específicas do gene é comumente conseguida entrega local ou sistêmica. Injeção sistêmica através da veia da cauda é fácil e eficiente em manipular a expressão de gene cardíaco usando vírus adeno-associado recombinante 9 (AAV9). No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor para transdução eficiente e pode resultar na transdução de gene nontarget órgão. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e economia de tempo de injeção Intramiocárdica para na vivo manipulação gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia (sem ventilação), os músculos peitorais maiores e menores foram dissecados sem rodeios, e o coração de rato foi rapidamente exposto pelo manual exteriorização através de uma pequena incisão no quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus, codificação do luciferase (Luc) e receptor de vitamina D (VDR) ou RNA de gancho de cabelo curto (shRNA) segmentação VDR, foi injetado com uma seringa Hamilton o miocárdio. Subsequentes na vivo imagem demonstrou que luciferase foi com êxito Blumental especificamente no coração. Além disso, a análise ocidental do borrão confirmou o sucesso superexpressão ou silenciamento de VDR, no coração do mouse. Uma vez dominado, esta técnica pode ser usada para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais, tais como nanogels no coração do mouse.

Introdução

Doença cardíaca é a principal causa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo^1,2. A falta de estratégias terapêuticas eficazes para doenças cardíacas fatais e incluindo infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca atrai a exploração intensiva de pathomechanisms subjacentes e identificação de opções terapêuticas novela³. Para estas explorações científicas, manipulação genética cardíaco-específicas é amplamente utilizado^4,5. Manipulação genética cardíaca pode ser conseguida editando genoma usando a nuclease efetoras como ativador de transcrição poderoso (TALEN) e agrupados regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) / proteína associada CRISPR 9 (Cas9) ferramentas, ou por entrega de materiais genéticos de gravidez ectópica (por exemplo, vetores de vírus, carregando genes que codificam proteínas de interesse)⁶. Embora a edição do genoma permite modificações precisas e spatiotemporal genoma em ratos vivos, ainda é uma prática demorada e trabalhosa,⁶. Alternativamente, manipulação de gene específico cardíaco pelo vírus vetor ou interferindo pequeno entrega complexa de RNA (siRNA) são rotineiramente realizada⁶.

Entrega de vetor de vírus para o coração de rato adulto é alcançada por aproximadamente duas estratégias: injeção sistêmica ou local. Injeção sistêmica de sorotipo cardiotropic de AAVs como AAV9 é não-invasiva para o gene específico cardíaca manipulação⁷. No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor necessário para transdução eficiente e expressão gênica e pode resultar em significativa transdução do nontarget órgãos tais como o músculo e fígado⁷. Injeção local de vírus é conseguida por injeção Intramiocárdica ou entrega Intracoronário⁷. Intracoronário entrega leva a uma distribuição mais uniforme do vírus dentro do coração em comparação com injeção Intramiocárdica. No entanto, as desvantagens desta técnica são a lavagem rápida fora de vetores virais para a circulação sistêmica e transdução em órgãos nontarget⁸e sua exigência de dispositivos para medição de pressão durante a operação. Por outro lado, permite de injeção Intramiocárdica melhor retenção de vírus no miocárdio, bem como entrega de local específico, mas não consegue distribuir uniformemente viral vector⁷. Para pequenos animais, entrega Intracoronário é tecnicamente difícil de executar, enquanto sistêmica AAV9 injeção e injeção Intramiocárdica são mais comumente praticada^4,5,7. Embora injeção sistêmica é fácil de realizar, injeção Intramiocárdica convencional requer toracotomia e ventilação mecânica, provoca dano tecidual extensa e é demorada.

Neste relatório, nós descrevemos um método fácil, economia de tempo e altamente eficiente para injeção Intramiocárdica. Adenovírus codificação luciferase e VDR ou shRNA alvo VDR, foi injetado para manipular a expressão de gene cardíaca. Uma vez dominado, esse método pode ser usado para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais no coração do mouse.

Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com os institutos nacionais de saúde orientações sobre o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo Comitê de ética Animal do Instituto. Camundongos C57BL/6J machos (8-10 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos. Os ratos foram alojados em condições de livre de patógeno a 24 ° C ± 4 ° C, sob um ciclo claro/escuro de 12-h, com livre acesso à água e comida.

1. preparação da solução de adenovírus

1. Após a chegada da solução purificada adenovírus, conservar a solução em um freezer-80 ° C.
   Nota: A injeção de adenovírus foi realizada em ratos viáveis. Para garantir a esterilidade do vetor adenovírus, o vírus adenoide (codificação do luciferase, VDR ou shRNA alvo VDR) foram preparadas e purificado comercialmente^9,10.
2. No dia da operação, retire a solução purificada adenovírus (3 x 10¹⁰ placa formando unidades [pfu] /mL) do congelador a-80 ° C e descongelar a solução do vetor de adenovírus no gelo.
3. Veste uma máscara, luvas estéreis e vestido de estéril.
4. Preparar um 50 µ l seringa Hamilton que foi esterilizada no dia antes da operação.
   Nota: Para a esterilização, a seringa Hamilton foi envolto em gaze e colocada em um esterilizador de pressão de alta temperatura/alta. O modo de "Esterilização para o sólido" foi selecionado e esterilização foi iniciada pressionando o botão "start".
5. Após o descongelamento completo da solução purificada adenovírus, pulverizar o tubo contendo solução de adenovírus com 75% de etanol e mover a solução de adenovírus em uma capa de fluxo laminar estéril.
6. Em uma capa de fluxo laminar estéril, Aspire solução de adenovírus 50 µ l utilizando a seringa Hamilton sem uma agulha, seguida de penhora de uma agulha 30G à seringa Hamilton.
7. Segurar a seringa com a agulha de 30g para cima e empurre suavemente o êmbolo da seringa até que a agulha é preenchida com solução de adenovírus (confirmada pelo aparecimento das primeiras gotas de solução de ponta da agulha).
   Nota: Demora aproximadamente 45 µ l solução para preencher a agulha 30G, então agora quase nenhuma solução é visível na seringa.
8. Use a seringa preparada acima para Aspire cuidadosamente com outra solução de adenovírus 30 µ l e coloque a seringa vagamente tampada no gelo para uso subsequente.

2. anestesia e preparação operativa

1. Adicionar 20 mL isoflurano em um vaporizador de isoflurano e conectar o vaporizador de isoflurano para um tanque de oxigênio.
2. Abra a válvula e deixe o oxigênio fluxo do tanque de oxigênio para o vaporizador de isoflurano. Manter a taxa de fluxo de oxigênio a 2 L/min, através de um monitor de fluxo de oxigênio no vaporizador de isoflurano.
3. Induzi a anestesia do mouse com 4% de isoflurano em 100% de oxigênio (2 L/min) por 2 min em uma gaiola de plástico ligada ao vaporizador de isoflurano.
4. Tirar o mouse anestesiado da jaula de plástico e fixá-lo em uma plataforma de plástico na posição de bruços em uma capa de fluxo laminar estéril e manter a anestesia com isoflurano de 2% em 100% de oxigênio (2 L/min) através de um cone de nariz.
5. Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta de pitada de dedo do pé.
6. Aplique o creme oftálmico estéril para cada olho para proteger as córneas de secagem.
7. Depilar o peito e abdômen superior. Aplicar creme depilatório comercialmente disponível para o site raspado para 1 min. Retire o creme depilatório e restante pele com gazes molhadas.
8. Esterilize o local cirúrgico (parte inferior esquerda do tórax) com 3 batas de anti-séptico à base de iodo-clorexidina (por exemplo, entoiodine). Cobrir o local cirúrgico com um pano estéril.

3. Intramiocárdica injeção de adenovírus no coração de rato

1. Tirar as luvas e colocar um novo par de luvas estéreis.
2. Esterilizar o fórceps, uma pinça hemostática micro-mosquito, um par de tesouras cirúrgicas, e um porta-agulha no dia antes da operação em uma alta temperatura/alta pressão esterilizador (ver nota etapa 1.4).
3. Faça uma incisão de 0,5 cm de pele ao longo da linha que liga o xifoide e axila. Sem rodeios, disse o peitoral maior e peitorais menores músculos com fórceps e uma pinça hemostática micro-mosquito.
4. Expor os espaços intercostais, retraindo o peitoral maior e peitorais menores músculos. Perfurar e abra o quarto espaço intercostal (ou o mais amplo espaço intercostal por observação) com uma pinça hemostática micro-mosquito.
5. Empurre o coração em direção a incisão de exteriorizar o coração com o dedo indicador da mão não dominante, pressionando suavemente contra o lado direito da parede torácica.
6. Secure suavemente o coração exteriorizado com o dedo indicador e o polegar da mão não dominante.
7. Injete um total de solução de adenovírus 30 µ l do miocárdio do ventrículo esquerdo em três locais (parede ventral, dorsal e lateral do ventrículo esquerdo) através da seringa Hamilton repleto de adenovírus (Figura 1) com a mão dominante.
8. Após a conclusão da injeção, coloca imediatamente o coração volta para o espaço intratorácicos.
9. Manualmente, evacue o ar no espaço intratorácicos pressionando suavemente a parede torácica para o local de incisão da pele.
   Nota: Evacuação de ar bem sucedido pode ser evidenciada pelo bater do peitoral maior e peitorais menores músculos causados pelo ar expelido.
10. Feche a pele por sutura horizontal com uma sutura de seda 5-0.
    Nota: O peitoral maior e peitorais menores músculos devem não ser suturados, porque eles só sem rodeios são dissecados e suas estruturas anatômicas estão intactas durante toda a operação.

4. pós-operatórios

1. Administre a buprenorfina (3 mg/kg) duas vezes diariamente através de injeção subcutânea para reduzir a dor pós-operatória para as primeiras 48 horas após a operação¹¹.
2. Após a operação, imediatamente manter os ratos em uma almofada de calor (37 ° C) até que se recuperou totalmente. Coloque o mouse volta para a jaula, depois que ele se recupere totalmente.
3. Esterilizar o usado Hamilton seringa e agulha de seringa 30g num esterilizador alta temperatura/alta pressão (ver nota etapa 1.4). Recolha a agulha de seringa esterilizada 30 G em um recipiente de objectos cortantes.

5. na Vivo Imaging para medir a expressão Luciferase cardíaca

1. No dia 5 após a injeção de adenovírus, prepare uma solução stock fresca de luciferina em 15 mg/mL em solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS). Filtre a solução através de um filtro de 0,2 µm.
2. Intra peritoneally Injete os ratos acordados com a solução de luciferina a 150 mg/kg de peso corporal.
3. Ligue o sistema de imagem.
4. Depois automático autoteste do sistema de imagem, selecione o modo de imagem como "Luminescentes" e fazer as seguintes configurações: exposição: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Excitação: Bloco; Emissão: aberto.
5. Em 10 min após a injeção de luciferina, anestesia os ratos por injeção de hidrato de cloral (300 mg/kg de peso corporal). Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta de pitada de dedo do pé.
6. Fixe os ratos anestesiados num palco de imagem aquecida na posição de bruços, com o peito voltado para a câmera.
7. Recolher imagens (1 imagem para cada rato) e quantificar a intensidade dos sinais desenhando-se as regiões de idêntica medida circular de interesse (ROI) em torno do peito.
8. Após a coleta de imagens, sacrificar os ratos e coletar os tecidos, como mencionado na seção a seguir.

6. colheita de tecidos

1. Em pontos diferentes de tempo após a injeção do vírus (figura 1B), anestesiar os ratos com 4% de isoflurano, manter a anestesia com isoflurano 2% através de um cone de nariz e fixá-lo em uma plataforma de plástico na posição de bruços.
2. Fazer uma incisão ventral no pescoço anterior. Expor a artéria carótida comum direita, retraindo os músculos omohyoid e esternocleidomastoideo.
3. Sacrifica os ratos por cruza a artéria carótida comum direita e drenar o sangue.
4. Fazer uma incisão ventral no abdome. Corte as costelas de ambos os lados da caixa torácica, ao longo da linha médio clavicular e transecto o diafragma.
5. Expor o coração, levantando o xifoide. Encontrar a aorta ascendente e remova cuidadosamente o tecido adiposo perivascular.
6. Canule da aorta e perfundir retrogradely o coração com uma agulha 30G anexada a uma seringa de 1 mL, preenchida com 0,5 mL de solução-tampão de fosfato (PBS) 4 ° C.
7. Após a perfusão, excisar o coração e dividi-lo nos ventrículos direito e esquerdos. Excisar o fígado, pulmão e baço.
8. Depois de duas lavagens em PBS frio (4 ° C), armazene todos os tecidos coletados separadamente em frascos criogênicos em nitrogênio líquido.

7. determinação da expressão da proteína

1. Prepare o tampão de homogeneização adicionando coquetel de inibidor de protease em tampão de Lise comercialmente disponível a uma proporção de 1: 100. Calcule o volume total, com base no número de amostras a serem processadas. Mantenha o buffer de homogeneização preparado a 4 ° C para uso posterior.
2. Tire os tecidos do tanque de nitrogênio líquido. Pese o tecido em escalas de alta precisão (cerca de 60 mg para cada pedaço de tecido).
3. Transferi o tecido para um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Imediatamente adicione 200 µ l homogeneização buffer e pré-resfriado esferas de aço 1,5 mm (4 ° C) no tubo de microcentrifugadora.
4. Fixar os tubos microcentrifuga em pré-resfriado (4 ° C) suportes de metal em um tecido automático retificadora e começar a homogeneização, iniciando a máquina com as seguintes configurações: frequência: 70 Hz; tempo: 120 s.
5. Após a homogeneização, centrifugue o homogeneizado (16.000 × g, 4 ° C) e transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL com uma pipeta de 100 µ l.
6. Adicionar o carregamento do buffer solução (5x) à proteína sobrenadante na proporção de 1:4 e desnaturar a proteína a 100 ° C por 5 min.
7. Os níveis de expressão de proteínas no coração e outros tecidos de órgãos são mais monitorados pela análise ocidental do borrão (representante resultados são mostrados na Figura 2 e Figura 3) de acordo com o protocolo descrito anteriormente¹².

Resultados

O protocolo do experimento e algumas das principais etapas para o método relatado são mostradas na Figura 1. Em 5 dias após a injeção Intramiocárdica de luciferase codificação de adenovírus (Adv-luc), na vivo por imagens em ratos injetado adv-luc indicado robusto superexpressão de luciferase especificamente no coração (Figura 2A, B), que foi confirmado por análise ocidental do borrão (

Discussão

O presente relatório demonstra uma técnica modificada para injeção Intramiocárdica de vetores virais para manipulação do gene cardíaca, que foi modificado de um método para indução do infarto do miocárdio por Gao et al ¹³ atualmente, na vivo caracterização das funções do gene específico geralmente envolvem a geração de nocaute ou ratos transgénicos^3,14,15,<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Laminar flow sterile hood	Fengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)	FS-CJ-2F
Centrifuge	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Tissue grinding machine	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)	Scientz-48
High temperature/high pressure sterilizer	Hirayama (Saitama, Japan)	HVE-50
Isoflurane vaporizer	Matrix (Orchard Park, USA)	VIP3000
IVIS  Lumina III imaging system	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precision balance	Sartorius (Göttingen, Germany)	28091873
Instruments
Eppendorf pipette (100 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000059
Eppendorf pipette (10 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000113
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020	Curved tip
Hamilton syringe	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostat	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Curved, tip width 1.3mm
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)	J32110
Surgical scissors	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
1-mL Syringe	WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibody	CST (Danvers,  USA)	#2118
Anti-Luciferase antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab187340
Anti-rabbit IgG	CST (Danvers,  USA)	#7074
Anti-VDR antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab109234
Buprenorphine	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Chloralic hydras	LingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic Vials	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1.8 mL
Depilatory cream	Veet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco (Grand Island,  USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, China)	310132
EP tube	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filter	Millipore (Bedford, USA)		Pore size 0.2 µm
Isoflurane	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
Luciferin	Promega (Madison, USA)	P1041
Lysis buffer for western  blot	Beyotime (Shanghai, China)	P0013J	Without inhibitors
Ophthalmic cream	Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBS	Gibco (Grand Island,  USA)	10010023
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
5-0 silk suture	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ball	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)		Width 1.5 mm
Syringe needle	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)		30 gauge
Warm mat	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )	NF-GNCW