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Resumo

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.

Resumo

A análise dos componentes bioativos presentes em alimentos e produtos naturais tornou-se uma popular área de estudo em muitos campos, incluindo o tradicional chinesa medicina e comida segurança/toxicologia. Muitas das técnicas de análise clássica exigem equipamentos caros e/ou experiência. Notavelmente, ensaios imunoenzimático (ELISA) tornaram-se um método emergente de análise de alimentos e produtos naturais. Este método baseia-se na mediada por anticorpo de detecção de componentes o alvo. No entanto, como muitos dos componentes bioativos em produtos naturais são pequenos (< 1.000 Da) e não provocar uma resposta imune, criar anticorpos monoclonais (mAbs) contra eles, muitas vezes é difícil. Neste protocolo, nós fornecemos uma explicação detalhada das etapas necessárias para gerar mAbs contra moléculas-alvo, bem como aqueles necessários para criar o associado indireta competitiva (ic) ELISA para a análise rápida do composto em várias amostras. O procedimento descreve a síntese do antígeno artificial (ou seja, o conjugado de hapteno-portador), imunização, fusão celular, preparação de hibridoma monoclonal, caracterização do mAb e o aplicativo baseado em ELISA do mAb. O conjugado de hapteno-transportadora foi sintetizado por sódio periodato método e avaliada por MALDI-TOF-MS. Após a imunização, splenocytes foram isoladas a partir do rato imunizado com o mais alto título de anticorpos e fundido com a hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT) - linha celular do mouse sensível mieloma Sp2/0 - Ag14 usando um polietileno glicol (PEG)-com base em método. As hibridomas secretando mAbs reativo ao antígeno alvo foram projectadas pelo icELISA de especificidade e de reactividade cruzada. Além disso, o método de diluição limitante foi aplicado para preparar os hybridomas monoclonais. Os finais mAbs foram ainda mais caracterizadas por icELISA e então utilizados em um aplicativo baseado em ELISA para a detecção rápida e conveniente de hapteno o exemplo (naringinases (NAR)) em produtos naturais.

Introdução

Anticorpos monoclonais (mAbs), também conhecido como anticorpos mono-específicos, são produzidos a partir de um único clone de linfócitos e são compostos de anticorpos monovalentes, que só ligam para o mesmo epítopo1. Nos últimos anos, utilizaram-se muitos produtos naturais de origem vegetal medicinais no tratamento de várias doenças2. De fato, muitos compostos moleculares pequenos originalmente derivados de produtos naturais são agora aplicados como drogas de primeira linha, tais como artemisinina para malária e paciltaxel (taxol) para câncer2,3. O estudo de produtos naturais tem feito progressos rápidos, em grande parte devido a enorme desenvolvimento e otimização de técnicas de análise convencionais, incluindo cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa (MS). No entanto, ainda existem algumas limitações associadas com esses métodos, tais como seus protocolos complexos de pré-tratamento e custos associados com relação ao tempo, mão de obra/expertise e instrumentos necessários4.

Recentemente, aplicaram-se ensaios baseados em mAb imunoenzimático (ELISA) para qualitativa e quantitativamente análise de alimentos e produtos naturais. Na verdade, esse método tem sido aplicado para análise de amostras biológicas e testes clínicos e foi mostrado para ser exato, sensível e altamente eficiente, evitando também as etapas de pré-tratamento tediosas associadas com outras análises5, 6.

Quando usando Elisa mAb-baseado para estudar produtos naturais complexos, preparação dos anticorpos monoclonais é uma das principais etapas. Infelizmente, os mAbs específicos aos pequenos componentes bioativos presentes nestes tipos de substâncias6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 muitas vezes são limitados em comparação com os antígenos da proteína. Para contornar esse problema, temos desenvolvido um protocolo para gerar especificamente mAbs contra pequenos compostos. O protocolo aqui apresentado inclui a síntese artificial de antígeno, imunização de rato, fusão celular, ELISA competitiva indireta e preparação de hibridoma monoclonal.

Notadamente, nosso grupo de pesquisa foi estudar a formação de mAbs contra pequenos compostos bioativos de medicinas chinesas tradicionais e desenvolver suas aplicações há anos. Em nossos estudos em curso, desenvolvemos mAbs contra baicalin16, puerarina17, de ácido glicirrízico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121e muitas outras pequenas moléculas. Nossos protocolos de ELISA baseados nesses mAbs têm sido utilizados em uma série de estudos para avaliar a farmacocinética destas pequenas moléculas, bem como suas interações com outros compostos bioativos. Além disso, usando esses mAbs, também desenvolvemos immunoaffinity métodos de cromatografia para separação de análogos estruturais, incluindo epimers. Recentemente, preparamos um imunoensaio de fluxo lateral usando nosso mAb antipuerarina que foi posteriormente usado para detecção rápida no local deste composto. Nossos resultados indicam que nossos ensaios mAb-based são ferramentas indispensáveis e convenientes para estudar a biologia e a qualidade de compostos naturais-produto-derivado, particularmente aqueles usados em medicinas chinesas tradicionais.

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Protocolo

Todos os animais procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de revisão ética da Universidade de Beijing de medicina chinesa (aprovação número 2016BZYYL00109).

Nota: Camundongos BALB/c feminino (8 semanas de idade) foram imunizados com transportadora hapteno proteína conjugados. Quando usado sozinho, uma pequena molécula (< 1.000 Da) não pode eliciar uma resposta imune. No entanto, conjugando a molécula pequena para um resultados de macromolécula transportadora na síntese do antígeno. Neste contexto, a pequena molécula é rotulada um hapteno. Hapteno conjugação é uma estratégia eficaz e necessária para a produção do mAb. Para evitar reactividade cruzada, duas operadoras diferentes da proteína, como albumina de soro bovino (BSA) e ovalbumina (OVA) ou hemocianina Lapa de fechadura (KLH) e BSA, deve ser usado como o imunogenos (para a imunização de animais) e antígenos de revestimento (para revestir a placa para antideteção soro). BSA e óvulos são usados como exemplo no presente protocolo.

1. preparação do antígeno e do antígeno de revestimento

Nota: Para a síntese do antígeno artificial, use o grupo funcional adequado (por exemplo, hidroxila, carboxila sulfidrila ácida, ou amino) como o lado do braço para ligação covalente com a proteína transportadora. A conjugação de métodos incluem periodato de oxidação, o método de carbodiimida, uma reação de anidridos mistos, uma reação de glutaraldeído e o método de succinato. Este protocolo usa naringinases (NAR), um glicosídeo de flavanone conhecida, como um exemplo de composto. NAR é um pequeno composto (581 Da) presente em frutas cítricas, bem como várias medicinas chinesas tradicionais.

  1. Use um processo de oxidação de periodate para sintetizar o cojugado NAR-BSA e NAR-óvulos.
    1. Dissolva 50 mg de NAR na água em uma concentração final de 1 mg/mL22.
    2. Adicione 100 µ l de sódio preparado periodato solução (0,1 M) para 5 mL da solução-NAR. Agite a mistura à temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Dissolva 4 mg de BSA e óvulos em 2,0 mL de tampão de carbonato de 50 mM (pH 9.6). Adicionar esta proteína periodato de solução para o NAR de sódio mistura reacional.
  3. Ajustar a mistura de pH 9 com uma solução 1 M Na2CO3 e misture em temperatura ambiente por 6-8 h.
  4. Dialize mistura reacional em tampão fosfato salino (PBS) usando uma membrana de diálise (MWCO 10 kDa) por 3 dias para trocar a CBS.
  5. Analisar o conjugado de hapteno-transportadora usando matrix assistida laser dessorção/ionização tempo de voo (MALDI-TOF)-MS.
    1. Misture 1-10 pmol do conjugado com um 103-dobre o excesso molar de ácido sinapínico em solução aquosa contendo 0,15% o ácido trifluoroacético (TFA). Seca a mistura em uma placa de amostra no ar.
    2. Realizar a análise usando uma MALDI-TOF espectrômetro de massa equipado com um laser pulsado nitrogênio operado em 337 nm. Aquisição de espectros de massa MALDI íon positivo no modo linear dentro da faixa de massa (m/z) de 15.000-100.000 descrito anteriormente como22.

2. imunização

Nota: Um total de 5 ratos fêmeas de BALB/c (8 semanas de idade) foram usados: 4 para NAR conjugado imunização e 1 para a imunização de controle (PBS).

  1. Para a primeira vacinação, misture 50 µ g de conjugado (diluído em 100 µ l de PBS) com igual volume de adjuvante completo de Freund (CFA) e emulsiona-se completamente. Administre 100 µ l desta mistura para cada rato via dorsal injeção subcutânea.
  2. Duas semanas depois, entrega um impulsionador da vacinação (100 µ l) através de injeção subcutânea com a mesma quantidade de conjugado misturado com adjuvante incompleto (IFA).
  3. Extrai 200 µ l de sangue da veia da cauda de cada rato 7 dias mais tarde para obter o soro.
    1. Centrifugar o sangue a 3.000 x g por 10 min. Transfira o soro sobrenadante para um tubo novo.
    2. Analise o soro usando um ELISA como descrito anteriormente,21. Escolha o rato com o mais alto título de soro usar para fusão celular.
  4. Em preparação para fusão celular, administre uma imunização pulsada para a rato escolhido através de injeção intraperitoneal de 50 µ g do conjugado em 300 µ l de PBS sem adjuvante 3 dias antes da fusão.
    Nota: Este passo pode ser omitido se o título for alto o suficiente.

3. preparação para fusão celular

  1. Preparação de fusão da pilha média
    1. Para o meio seletivo de hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT): dissolver 50 x suplemento de mídia de chapéu em 10 mL de RPMI-1640 e adicione esta mistura de 500 mL de RPMI 1640 contendo 20% FBS.
      Nota: Quando 10 mL do concentrado 50 x são diluídos em 500 mL de meio de cultura, as concentrações finais de hipoxantina, aminopterin e timidina são 100 µM, 0,4 µM e 16 µM, respectivamente.
    2. Para a mídia de hipoxantina-timidina (HT): dissolver 50 x suplemento de mídia de HT em 10 mL de RPMI-1640 e adicione esta mistura de 500 mL de RPMI 1640 contendo 20% FBS. As concentrações finais de hipoxantina e timidina são 100 µM e 16 µM, respectivamente.
  2. As células de Sp2/0-Ag14 da cultura.
    1. Pelo menos 7 dias antes da fusão, descongele rapidamente um frasco de líquido nitrogênio congelado SP2/0-Ag14 pilhas do myeloma em água morna.
    2. Transferi a solução de célula em 5 mL de meio de cultura fresco (RPMI-1640) e centrifugar durante 10 minutos a 1000 x g.
    3. Após a centrifugação, remover o meio de cultura e ressuspender as células em RPMI-1640 fresco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
    4. As células e o meio de transferência para um balão de2 25 cm e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2.
    5. Expanda as células para 3 ou frascos de2 4 75 cm antes da fusão.
  3. Preparação de células de camada abdominal alimentador
    1. Sacrificar um rato ICR albino de 12 semanas de idade por deslocamento cervical 1 dia antes da fusão celular e mergulhe-o em 75% de etanol.
    2. Depois de remover a pele do abdômen com pinça hemostática, desinfete a área com 75% de etanol. Corte a pele externa para expor na cavidade abdominal. Injetar 3ml de estéril meio RPMI-1640 no abdômen e massagear o abdômen para retirar células adicionais para a solução. Aspire a suspensão de células de alimentador para um tubo de centrífuga de 15 mL.
    3. Depois da centrifugação a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 1000 x g, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células alimentador em 20 mL de meio seletivo de chapéu.
    4. Transferi as células em placas de cultura de células 96 poços (100 µ l/poço). Incube as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2.

4. fusão celular

  1. Depois que o escolhido imunizados rato foi preparado para fusão celular (consulte a etapa 2.4), administrar uma injeção intraperitoneal de hidrato de cloral 10% (anestésico) e sacrificar o rato imunizado através do colo do útero deslocamento.
  2. Coletar sangue adicional do coração (1 mL) e preparar o soro, conforme descrito na etapa 2.3.1 para usar como um controle positivo durante a seleção do hybridoma.
  3. Retire o pele e o tecido muscular usando uma tesoura para expor o baço.
  4. Isolar o baço com uma pinça, cuidadosamente e lavar o baço com RPMI-1640. Corte o baço em pedaços e bater lentamente o baço para triture. Prepare uma suspensão de células de baço, pressionando o tecido do baço através de um filtro de célula de 800 malha em um tubo de centrífuga de 50 mL.
  5. Lave a suspensão de células de baço com meio RPMI-1640. Colha as células do baço por centrifugação (1000 x g, 10 min e 4 ° C) e em seguida, descartar o sobrenadante. Repita essa etapa de lavagem três vezes.
  6. Remover as células de mieloma cultivada e amplificado de incubadora e suavemente torneira/agitar os frascos para obter uma suspensão de células. Lave esta suspensão com meio RPMI-1640 duas vezes para remover o FBS.
    Nota: Este é um passo essencial como FBS podem influenciar a fusão celular.
  7. Contar as células e ajustar a concentração antes de misturar com as células do baço. A relação final de células de baço de pilhas do myeloma deve ser entre 1:5 e 01:10.
  8. Misture a célula de baço células suspensão e mieloma múltiplo. Centrifugue a mistura de célula (1000 x g, 10 min e 4 ° C) e remover o sobrenadante.
  9. Adicionar 1 mL de solução de 50% polietileno glicol (PEG) para as células e agitar suavemente a 37 ° C por 1 min. Deixe descansar por 30 s.
    Nota: A solução de PEG usada nesta etapa deve conter 50% (p/v) polietileno glicol 1500 e 10% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO) em PBS sem cálcio (Ca2 +).
  10. Adicione 2 mL do meio RPMI-1640 por 2 min terminar a reação. Adicionar um adicional 2 mL de meio RPMI-1640 por mais 1 minutos e em seguida, adicione um adicional 10 mL de meio RPMI-1640.
  11. Centrifugar as células em 800 x g durante 10 minutos. Após descartar o sobrenadante, adicionar solução de chapéu e continuar a cultivar as células. Em seguida adicione 100 µ l de suspensão de células a cada poço das placas de camada de alimentador e incubar as placas durante 7 dias a 37 ° C, 5% de CO2.
    Nota: Nestas condições, as células de mieloma morrerá enquanto as células de hibridoma continuará a crescer no meio de chapéu. Após 7 dias, anticorpo monoclonal hibridoma formarão como um único cluster de células no poço, enquanto poços contendo polyclonal do hybridoma terá vários clusters de células.
  12. Aspirar o sobrenadante para análise e substitua o meio médio do HT.
    Nota: Certifique-se de substituir o meio de chapéu com HT médio primeiro como mudar diretamente para o unsupplemented médio é prejudicial para a hibridoma.

5. indirecto ELISA competitiva (icELISA)

  1. Revestir uma placa de 96 poços com NAR-óvulos (1 µ g/mL, 100 µ l/poço) e incubar durante 1 h a 37 ° C, ou durante a noite a 4 ° C.
  2. Bloquear a placa com 300 µ l de GPBS (PBS contendo gelatina de 1% m/v) 1 h a 37 ° C para evitar a adsorção não específica.
  3. Lave a placa 3 vezes com TPBS (PBS contendo 0,05% v/v Tween-20).
  4. Dilua unconjugated NAR em uma série de concentrações com 10% de metanol. Adicione 50 µ l destas diluições aos diferentes. Em outros poços, adicione 50 µ l de antiou soro hibridoma sobrenadante (contendo mAbs). Incubar a placa por 1 h a 37 ° C.
  5. Adicionar 100 μL de marcado com peroxidase anti-mouse IgG em cada poço e incubar durante uma 1h adicional.
  6. Depois de lavar a placa 3 vezes com TPBS, adicionar 100 µ l de solução de substrato (0,1 M citrato tampão (pH 4) contendo 0.015% v/v de H2O2 e 2 mg/mL de 3, 3', 5, 5'-tetrametil benzidina (TMB)) para cada um bem e incube por 15 min.
  7. Pare a reação adicionando 50 µ l de 1 M H2então4 a cada poço.
  8. Medir a absorvância usando um leitor de microplacas a 450 nm. Escolha as hibridomas que secretados maiores concentrações de anticorpos NAR em seu sobrenadante para ainda mais preparação.

6. preparação de hibridomas Monoclonal

  1. Use o método de diluição limitante para preparar as hibridomas monoclonais.
    1. Após a remoção do meio de HT as hibridomas selecionadas (ou seja, aqueles positivos para a secreção de anticorpos NAR), Ressuspender as células em RPMI-1640 e contá-los.
    2. Dilua as células a uma concentração de 1 celular, 2 células, 4 células por poço em 100 µ l de RPMI-1640 em uma placa de 96 poços. Incube a placa a 37 ° C, 5% de CO2.
    3. Após 7-10 dias, detecta os anticorpos NAR na cultura do sobrenadante usando o protocolo de icELISA (passo 5). Transferência de células de hibridomas que são positivas para anticorpos NAR placas boas 24, 25 cm2 e de 75 cm2 para cultivo.
  2. Cryopreserve as anticorpo monoclonais hibridomas.
    1. As células da colheita e transferi-los para tubos de centrifuga.
    2. Depois da centrifugação das células (800 x g, 10 min), remover o sobrenadante e ressuspender as células em congelamento médio (RPMI-1640, soro de vitelo fetal de 20% (FCS) e 10% DMSO). Transferi as suspensões celulares para cryotubes.
    3. Armazene o cryotubes em uma caixa de resfriamento gradiente a-80 ° C por 24 h. Depois de transferir o cryotubes de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

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Resultados

Geração de hibridomas monoclonais

O peso molecular do conjugado hapteno-transportadora foi confirmado pela análise de MALDI-TOF-MS. Como o peso molecular de BSA e o NAR são conhecidos, o número de pequenas moléculas conjugadas com BSA poderia ser calculado. A Figura 1 mostra resultados representativos de espectrais para NAR-BSA22, que...

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Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção bem sucedida de mAbs contra naturais produto derivado pequenas moléculas. As etapas essenciais no procedimento foram delineadas, e temos demonstrado a utilidade do presente protocolo usando NAR como uma pequena molécula de exemplo. Os espectros de exemplo, análises de reatividade e icELISA resultados que todos mostram representante experimental e dados de controle que são obtidos usando este protocolo. Imagens de exemplo das hibridomas fornecem uma representação vis...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (concessão números 81573573, 81473338 e 81503344) e a clássica receita básica equipe de pesquisa da Universidade de Beijing de medicina chinesa.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
800 mesh (40 μm nylon) filter FALCON352340
24 well culture plateNUNC119567
25 cm2 FlaskLabserv310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)Sigma Aldrich860336 1G
75 cm2 FlaskCorning430720
96 well culture plateNUNC117246
bovine serum albuminAMRESCO332
cell strainerFALCON352340
centrifuge tube 15 mLCorning430645
centrifuge tube 50 mLCorning430828
cryotubes, 1 mL Sigma AldrichV7384-1CS
cultivatorDRP-9082 Samsung
dialysis membrane (10kDa)Heng Hui45-10000D
dimethylsulfoxideSinopharm ChemicalDH105-10
electronic balance BS124-S Sartorius
ELISA plates, 96 wellNUNC655101
ethanol, 96%Sinopharm Chemical
Fetal bovine serumGibco16000-044
fetal calf serumInvitrogen10270106
Freund´s adjuvant, completeSigma AldrichSLBM2183V
Freund´s adjuvant, incompleteSigma AldrichSLBL0210V
GelatinAMRESCO9764-500g
Gradient cooler containerNalgene5100-0001
HAT media supplementSigma AldrichH0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibodyapplygenC1308
HT media supplementSigma AldrichH0137-10VL
Inverted MicroscopeIX73Olympus 
keyhole limpet hemocyaninSigma AldrichH8283
MALDI-TOF-MS Axima-CFR  plus  Axima 
Microplate ReaderBioTexELX-800 
mouseVital River BALB/c
ovalbuminBeijing BIODEE5008-25g
PEGSigma AldrichRNBC6325
Penicillin&Streptomycin solutionHycloneSV30010
Pipette 10 mLCOSTAR4488
Pipette 25 mLFALCON357525
RPMI 1640Corning10-040-CVR
skim milkapplygenP1622
sodium periodateSinopharm ChemicalBW-G0008
Sulfo-GMBSPerbio Science Germany22324
TipOne Tips 1,000 µLStarlabS1111-2021

Referências

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