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Resumo

Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.

Resumo

Transplante de rim é agora uma terapia convencional para o estágio final da doença renal. No entanto, com cerca de 96.000 pessoas na lista de espera e apenas um quarto desses pacientes realizar o transplante, há uma grande necessidade de alternativas para aqueles com falência de órgãos. A fim de diminuir as consequências prejudiciais da diálise juntamente com os custos globais de saúde incorre, investigação está em curso em busca de soluções alternativas para a transplantação de órgãos. Implantáveis engenharia de tecido renais celulares construções são uma tal abordagem viável para substituir a funcionalidade renal perdida. Aqui, descrita pela primeira vez, é o microdissection dos rins murino para isolamento de vida córtico segmentos renais. Esses segmentos são capazes de rápida incorporação dentro de construções de andaime-free endotelial-fibroblasto que lhe permitam conexão rápida com a vasculatura hospedeiro uma vez implantada. Os rins do rato adulto foram colhidos em dadores vivos, seguidos pelo estereoscópio microdissection obter segmentos renais 200-300 µm de diâmetro. Várias construções renais foram fabricadas usando segmentos renais primários, colhidos a partir de apenas um rim. Este método demonstra um procedimento que poderia salvar o tecido renal funcional de órgãos que seria caso contrário serão descartados.

Introdução

Doença renal crônica (DRC) é um do atual saúde pública desafios em todo o mundo1. A prevalência de DRC nos Estados Unidos é mais 14% do total da população, com mais de 600.000 americanos sofrem de forma mais severa, estágio final da doença renal (DRT)2. As atuais opções de tratamento disponíveis para aqueles com DRT incluem transplante renal e diálise. Apesar de aproximadamente 25.000 pacientes submetidos a transplante renal a cada ano, um número significativo de pacientes é adicionado anualmente levando a uma grande disparidade entre aqueles que aguardam um órgão de salvamento e aqueles recebendo transplante3. Além de seus graves efeitos negativos na qualidade de vida e longevidade, diálise está associado um encargo financeiro surpreendente. Em 2014, o Medicare paga reivindicações mais totalizou US $ 30 bilhões para DRT pacientes2. Com um suprimento limitado de órgão e sem aparente tendência de baixa em pacientes que necessitam de diálise, os esforços de investigação visam identificar soluções alternativas para diálise e transplante são sempre importantes. Mesmo um atraso relativamente curto na necessidade de diálise aumenta o número de um paciente dos anos de vida ajustados por qualidade e produtividade substancialmente enquanto adiar custos relacionados com a diálise4,5,6.

Soluções para a perda de tecido funcional, assim na DRT, atualmente estão sendo estudadas na engenharia de tecidos e medicina regenerativa laboratórios, com abordagens amplamente variadas, variando de fabricação baseados em andaime organoides para órgão inteiro usando engenharia decellularized estruturas de órgão para implantação celular7,8,9,10,11. Recapitulando complexas estruturas renais de rins marginais ou descartados foi parcialmente investigado. Na verdade, quase 20% dos rins para transplante são descartados por várias razões12,13. O tecido renal funcional destes enxertos putativos poderia ser utilizado e incorporado uma ou muitas construções de engenharia de tecidos. Estudos prévios têm demonstrado a viabilidade de trabalhar com estes órgãos descartados, utilizando os rins para a matriz extra-celular para engenharia de tecido fins14,15. No entanto, poucos têm usado tecido nephronal primário de rins saudáveis para fins de engenharia de tecidos a16,17,18.

Um método anteriormente descrito por Kim et al envolve isolamento de renais "segmentos" de rins de rato saudável, que em seguida foram semeados em andaimes de (PGA) ácidos poliglicólico para fabricação de construção16. No entanto, pouca informação é dada em relação a metodologia exata de dissecação, e segmentos foram obtidos a partir de uma combinação de picagem fina e filtração. Nós descrevemos uma modificação do presente protocolo, que da mesma forma, produz discretos segmentos renais com arquitetura nephronal intacto, mas em vez disso se baseia em técnicas de microdissection. Nephrectomies são executadas em ratos adultos vivos, depois que os rins são transferidos para o microscópio de dissecação onde é removida a cápsula renal, e o tecido é mais dissecado. Pequeno calibre agulhas 30½ G são usadas como instrumentos de corte e também como guias, ajudando na dissecação, como a agulha de diâmetro é igual ao diâmetro do alvo dos segmentos renais. Os segmentos isolados, neste caso murino, renais mantêm viabilidade em cultura e incorporam com construções celular livre de andaime endotelial-fibroblasto19. Essas construções têm sido utilizadas anteriormente para engenheiro de outros órgãos, incluindo pâncreas artificial bio20.

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Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos animais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) na Medical University of South Carolina, antes de qualquer animais cirurgias ou uso de quaisquer tecidos animais.

1. murino nefrectomia

  1. Não uma máscara cirúrgica e tampão bouffant para minimizar o risco de contaminação. Manter a esterilidade durante a configuração da área cirúrgica.
    1. Coloque cortinas cirúrgicas não-fenestrado na mesa de operação.
    2. Abre a mochila de instrumentos esterilizados para as cortinas estéril. Os instrumentos necessários para nefrectomia incluem 3 hemostatos pequenos, finas pinças com dentes, pinça fina sem dentes e a tesoura de íris reta.
    3. Coloque outro não fenestrado cirúrgica drapeja no centro da mesa de operações.
    4. Prepare-se 5 mL de Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS) com cálcio e magnésio, suplementado com 1% penicilina/estreptomicina em um tubo cônico estéril 15 mL. Coloque esta solução no gelo ao lado da mesa de operações.
  2. Obter um rato C57BL/6 de 8-12 semanas (masculino ou feminino) em relação ao complexo de alojamento dos animais.
  3. Posicione o mouse dentro de uma câmara de indução da anestesia e induzir com isoflurano 3,5% inalado. Coloque um cone de nariz do mouse, usando 2% de isoflurano para a anestesia de manutenção.
    1. Monitor para adequada profundidade de anestesia periodicamente durante todo o procedimento cirúrgico avaliando para pedal reflex (pitada de dedo firme).
  4. Remova todo o cabelo do tronco ventral usando o creme depilatório. Enxague a área com água destilada para garantir que todo o cabelo foi removido do abdômen.
  5. Transferi o mouse para a mesa de operações estéril em posição supina sob a cortina não fenestrado superior. Corte uma fenestração de2 2 x 2 cm na cortina sobrejacente apenas o abdômen do mouse.
  6. Aplica iodo-povidona, seguido por 70% de etanol para o abdômen, usando bolas de algodão ou gaze estéril.
  7. Usando a pinça fina com dentes e iris tesouras, faça uma incisão de pele abdominal vertical de 3-4 cm paralelo à linha média, 0,5 cm para a esquerda da linha média
    Nota: Se tentar remover o rim direito, esta será uma incisão de 0,5 cm à direita da linha média.
    1. Segure o peritônio com pinça fina, sem dentes e cortar com uma tesoura de íris para entrar na cavidade abdominal. Aplica hemostatos as bordas laterais superiores e inferiores, pele e peritônio colocar tensão lateralmente e aumentar a exposição.
    2. Deslocar o conteúdo intestinal delicadamente para o lado direito do abdômen para expor o rim esquerdo. Coloque delicadamente a tração no rim para elevá-lo fora do abdômen.
    3. Coloque uma pinça hemostática através do hilo do rim esquerdo. Use tesoura de íris para transecto o ureter e vasos renais.
    4. Coloque o rim esquerdo no 1% solução de DPBS penicilina/estreptomicina no gelo.
    5. Transferi o tubo contendo o rim para o bairro de cultura de tecido estéril. Transferi o rim do tubo cônico de 15 mL para um prato de petri de 60-mm (Figura 1). Lave duas vezes com 5 mL DPBS com cálcio e magnésio. Manter o rim suspendido em 5 mL DPBS no prato 60mm.
      1. Prepare um prato de petri 60mm adicionais com 5 mL DPBS deve ser usado durante o protocolo de microdissection.
    6. Eutanásia o mouse por toracotomia e perda de sangue após a aquisição do rim, de acordo com um protocolo de animais IACUC aprovado.

2. murino rim Microdissection para isolamento de segmento Renal

  1. Continue usando uma técnica estéril para esta parte do protocolo, incluindo luvas estéreis, máscara cirúrgica e shampoo para minimizar o risco de contaminação.
    1. Lugar estéril cortinas na plataforma de microscópio estéreo também quanto à áreas saiu e direito do microscópio de ter um campo estéril para instrumentos. Coloque folhas de adesivo plástico sobre os botões de foco do microscópio e pulverizar com etanol a 70%. Liga o iluminador de pescoço de cisne dual para iluminar o palco.
    2. Aberto instrumentos esterilizados (pinça fina sem dentes, alça para bisturi, lâmina de bisturi #15, duas retos hemostatos, duas 30½ calibre agulhas de calibre oco) para cortinas estéril. Lâmina de lugar o #15 no bisturi tratar agora e anexar uma pinça hemostática para cada adaptador de agulha/hub para criar instrumentos de dissecção de agulha para uso posterior, conforme mostrado na Figura 1.
  2. Mova os pratos de petri-60mm, um contendo o rim em DPBS e outros DPBS a única, do bairro cultura de tecidos para a área de microscópio.
    1. Coloque o prato de petri 60mm no âmbito do objectivo e retire a tampa para expor o rim. Deixe o prato contendo DPBS ao lado no campo estéril para uso posterior.
    2. Mova o prato para que apenas a superfície anterior ou posterior do rim está em exibição (ou seja, a grande cara lisa do rim, com a outra face, tocar no fundo do prato). Aumentar o zoom 3.2-4x para esta parte do procedimento. Usando a mão não dominante, use pinça fina, sem dentes para perfurar e fixar o rim contra o prato perto dos polos superiores e inferiores do rim.
    3. Mantenha a mão não dominante no lugar para fixar o rim. Com a mão dominante, utilize a lâmina #15 para remover a camada capsular fibrosa translúcida da superfície exposta. Raspe o mais superficial 0,5 mm da superfície exposta do rim para remover o restante da cápsula.
    4. Use a lâmina #15 para dissecar uma pirâmide invertida de tecido da área congelada, aproximadamente 2 mm3 no tamanho. Recuperar o prato de 60-mm contendo apenas DPBS e colocar o prato limpo a pirâmide do tecido. Descarte o restante do rim.
    5. Diminua a ampliação de 1.5-2.0 X para o resto da dissecação. Usando dois instrumentos de pinça hemostática-agulha como instrumentos de corte, fatie o fragmento de tecido em pedaços progressivamente menores até que os segmentos de tecido são menor ou igual ao diâmetro das dicas de agulha. Um tecido renal 2 mm3 no tamanho produzirá mais de 50 segmentos uma vez completamente dissecados.
    6. Mova o prato de 60-mm com segmentos renais para o capô de cultura de tecidos. Remova DPBS com pipeta de 1000 µ l. Adicione 5 mL DMEM, suplementado com 10% soro Fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
    7. Cultura por 3 dias a 37 ° C em uma incubadora ou implante em construções de celulares imediatamente.

3. renal segmento construção celular fabricação

  1. Cultura normal humanos fibroblastos dérmicos (NHDF) e humanas adiposas microvasculares células endoteliais (HAMEC) durante várias semanas obter a 7,2 x 105 fibroblastos e 1,8 x 105 células endoteliais por construto desejado. O capuz de cultura de tecidos, propagar a relação apropriada dos fibroblastos, células endoteliais (4:1) para poços de forma cilíndrica em agarose moldes para formar o andaime livre pre-vasculares endotelial-fibroblasto construções (SPEC), conforme descritas por Czajka et al 19.
  2. Obter um hemostat esterilizado, agulha de 30½ G e uma espátula estéril com extremidade plana.
    1. Remova a maioria dos meios de comunicação da placa de 60-mm contendo segmentos renais, tomando cuidado para não aspirar e remover os segmentos renais.
    2. Equipe as lupas cirúrgicas para visualizar a implantação dos segmentos.
    3. Raspe o fim da espátula suavemente ao longo do fundo do prato 60mm para obter segmentos de 10-15, espalhar-se uniformemente ao longo da ponta da espátula. Coloca a ponta da espátula tão próxima quanto possível para o lábio do poço onde o SPEC foi semeada.
    4. Use um instrumento de agulha pinça hemostática-30½ G na outra mão para mover cada segmento individual desde a ponta da espátula para a borda do poço. Mova cada segmento para o bem usando a ponta da agulha até ligeiramente submerso na suspensão celular previamente semeada.
    5. Cultura de segmento renal-SPEC em 2:1:1 relação de meio de mutilação genital feminina-2/EGM-2/DMEM (total de volume de 2,5 mL). Mudar a cada 24 h de meios de cultura por 3 dias. Remover as construções de moldes em 72 h e corrigir ou congelam para processamento.

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Resultados

O protocolo descrito produz aproximadamente 50 segmentos renais por seção de3 mm 2 piramidal do tecido renal. Os segmentos renais que foram processados e fotografados tem componentes tubulares e glomerulares em proporções diferentes (ver Figura 2). Os segmentos intactos foram submetidos a um ensaio para determinar a viabilidade de diferentes segmentos de uma vez a cada 24 horas durante três dias. Verde-fluorescente calceína-AM está presente ...

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Discussão

Métodos usados para projetar o tecido renal vivo construções variam bastante no que se refere o tipo de células e biomateriais utilizados e em muitos casos, estão desatualizados ou não bem caracterizadas na literatura7. Enquanto muitos estão usando células-tronco abordagens ou sintetizando os componentes individuais da arquitetura renal isoladamente, é a perspectiva de recriar artificialmente um órgão inteiro com mais de 26 tipos diferentes de células diferenciadas de suspensões celul...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

NIH institucional formação pós-doutoral Grant, NIH-HL-007260

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Non-fenestrated Sterile FieldBusse Hospital Disposables696
Fenestrated Sterile FieldBusse Hospital Disposables697
Halsted Mosquito Forceps 5 CurvedMiltexMil-7-4"Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teethFine Science Tools11155-10Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)Fine Science Tools11152-10Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%Purdue Products L.P.67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4")Fisher Healthcare22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered SolutionCorning21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-Cl
Isoflurane, USPManufacturer: Piramal, Distributor: McKesson2254845
Nair Hair RemoverNair22600-23307Hair Removal Cream in text
200 Proof EthanolDecon Laboratories2705Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture DishThemo-Scientific130181
Press'n SealGlad12587-70441Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo MicroscopeOlympusSZX16
Fiber Optic IlluminatorCole Parmer41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L GooseneckCole ParmerEW-41720-60
Scalpel Handle #3MiltexMil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15Bard-Parker371115
31 1/2 Gauge NeedleThermoFisher Scientific14-826FBecton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine SerumAtlas BiologicalsFS-0500-AD
Normal Human Dermal FibroblastsLonzaCC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial CellsSciencell Research Laboratories7200
Surgical Loupes (2.5x)Orascoptic(N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian CellsThermoFisher ScientificL3224
Anti-Cytokeratin-18 AntibodyAbcamab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633ThermoFisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA-11010
Anti-Von Willebrand Factor AntibodyAbcamab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate ConjugateSigma AldrichA9771-50MG
Hoescht 33342BD Pharmingen561908
Background BusterInnovex BiosciencesNB306

Referências

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