Um rato do modelo de fadiga Central usando um modificado método de plataforma múltipla

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para apresentar um modelo do rato de fadiga central usando o modificado método de plataforma múltipla (MMPM).

Resumo

Neste artigo, apresentamos um modelo do rato de fadiga central usando o modificado método de plataforma múltipla (MMPM). A caixa de plataforma múltipla foi concebida como um tanque de água com plataformas estreitas na parte inferior. Os ratos do modelo foram colocados no tanque e ficou nas plataformas para 14 h (18:00-08:00) por dia por 21 dias consecutivos, com um grupo de controle em branco para contraste. No final da modelagem, ratos no grupo modelo mostraram uma aparência cansada óbvia. Para avaliar o modelo, realizamos vários testes comportamentais, incluindo o campo aberto (OFT), teste da elevada além de labirinto (EPM) e o teste de natação exaustiva (ES). Os resultados mostraram que essa ansiedade, comprometimento da cognição espacial, desempenho pobre do músculo e recusada atividade voluntária apresentado em ratos modelo confirmam o diagnóstico da fadiga central. Alterações de neurotransmissores a central também verificado o resultado. Em conclusão, o modelo simulado com êxito a fadiga central, e estudos futuros com o modelo podem ajudar a revelar o mecanismo patológico da doença.

Introdução

A fadiga é um dos principais fatores que ameaçam a saúde humana¹. Nas últimas décadas, várias pesquisas provaram que fadiga é acionada por perifericamente mas centralmente orientada e sempre acompanhado com distúrbios emocionais e cognitivos. Fisiologista italiano Mosso r. proposto pela primeira vez a palavra fadiga Central². Geralmente é definida como a actividade voluntária limitada e comprometimento da cognição devido à disfunção da transmissão do impulso no sistema nervoso central (SNC)³. Comparado com fadiga muscular periférica, fadiga central enfatiza alterações no SNC, bem como as consequentes perturbações emocionais/comportamentais, incluindo depressão, ansiedade, deficiência de cognição e perda de memória. Um estudo mostra que muitos fatores podem induzir a fadiga central, entre os quais excessiva atividade física e estresse mental, são imprescindíveis⁴. Quanto a patogênese, teorias como o triptofano-Quinurenina via hipótese⁵ explicar alterações em determinadas vias; no entanto, estudos mais aprofundados ainda são necessários para revelar as correlações central-periférico da fadiga central.

Como o mecanismo subjacente de fadiga central ainda não está claro, um modelo animal eficaz é muito importante para futuras pesquisas. Os modelos existentes de fadiga são principalmente induzidos por exercício excessivo, como escadas rolantes⁶ e natação peso carregado⁷, com pouca preocupação sobre fatores mentais. Para melhor simular o desenvolvimento da fadiga central, nosso grupo desenvolveu um modelo do rato com o MMPM. Durante o processo de modelagem, ratos permanecem em pé nas plataformas estreitas na caixa múltipla plataforma por longas horas, incluindo a parte do tempo de sono. Diferente dos modelos de exercício excessivo, o modelo MMPM usa a privação do sono parcial como um fator mental tendo em consideração a complexa patogênese da fadiga central.

Para avaliação do modelo, usamos os OFT e EPM testes para determinar o clima de ansiedade e voluntariado. O teste de ES é realizado para medir o desempenho muscular periférica. Além disso, tomamos o cérebro do rato e detectar a dopamina (DA) / conteúdo de serotonina (5-HT) em ambos os hypothalamuses para observar as diferenças de neurotransmissor central.

O protocolo apresentado abaixo destina-se à fadiga central de modelo induzida pela atividade física repetida e falta de sono, imitando uma condição comum na vida humana. No entanto, ao ajustar a duração do modelo, pode ser usada em muitos outros campos, como em estudos de observação e estresse do sono. No futuro, pesquisa, esperamos que este modelo vai ajudar a descobrir mais mudanças do CNS e sua conexão com o sistema periférico, para revelar o mecanismo de patogênese da fadiga central.

Protocolo

Todos os animais foram mantidos em conformidade com as diretrizes da legislação chinesa sobre o uso ético e cuidar de animais de laboratório.

1. pré-modelagem preparação

1. Preparação do laboratório
   1. Execute a lâmpada de UV durante pelo menos 30 min antes do experimento.
   2. Controle a temperatura do laboratório a 25 ± 3 ° C e umidade relativa em torno de 30%.
   3. Ligue o laboratório luz às 06:00 e desligar às 18:00 para estabelecer um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
2. Construção de caixa de plataforma múltipla
   1. Construa um depósito de plástico opaco sem uma cobertura de 110 × 60 × 40 cm³.
   2. Corrigir a quinze plataformas circulares (h = 8 cm, d = 6,5 cm) na parte inferior do tanque, o enfermeiro que distribuir em três linhas e cinco colunas. Deixe espaço suficiente entre cada plataforma, mais ou menos 10 cm entre colunas e entre linhas de 13 centímetros.
   3. Definir uma saída de água no lado lateral do tanque e instalar uma torneira.
   4. Fazer uma cobertura de rede de fio de ferro para o tanque com uma caixa de comida pendurado nela.
3. Agrupamento e ratos de habitação
   Nota: Ratos machos Wistar de 8 semanas de idade, pesando aproximadamente 200-210 g, são utilizados no experimento. Os ratos vivem em grupos durante o processo de modelagem.
   1. Número de raízes de cauda dos ratos com uma caneta.
   2. Pesar os ratos, excluir o extremamente leve ou mais pesada e dividir o resto aleatoriamente em grupos de controle e modelo.
   3. Delicadamente colocou os ratos as gaiolas limpas e permitir-lhes para se aclimatar ao laboratório pelo menos 3 dias. Fornece água suficiente e fornecimento de alimentos.

2. modelagem com MMPM

Nota: O processo começa às 18:00 e termina às 08:00 no dia seguinte, para um total de 14 h por dia, durante 21 dias. Para evitar fatores de interferência, a mesma pessoa é necessária para conduzir todo o experimento, enquanto usava o mesmo casaco de laboratório. 10 ratos Wistar são usados no experimento.

1. Coloque o reservatório sobre uma superfície plana, por exemplo, no chão. Em seguida, encha o reservatório com aproximadamente 7 cm de água morna (25 ± 3 ° C), cerca de 1 cm abaixo da plataforma plana.
2. Prepare comida e bebida suficiente para todos os ratos no tanque para 1 dia. Forragem e água colocaram na caixa de comida e pendurá-lo na capa.
   Nota: Alguns ratos inteligentes aprendem a descansar na caixa de comida. Em caso afirmativo, conduzi-los a volta para o tanque.
3. Levar os ratos do grupo de modelo fora da gaiola, agarrá-los pelo rabo e colocá-los suavemente para o tanque. Lançar todos os ratos na água em vez das plataformas para motivar o seu medo de água. Certifique-se de que todos os ratos Obtém uma plataforma para se sustentar, enquanto ratos do grupo controle permanecer em suas gaiolas originais com comida e água suficientes.
4. Tampa do tanque. Monitore os ratos para evitar ferimento acidental. Se um rato permanece na água por mais de 1h sem subir na plataforma, buscá-lo fora do tanque e removê-lo do teste.
5. Após 14 h, tirar os ratos do modelo do tanque e seque os cabelos com um secador. Re-marca as caudas dos ratos se desvanece-se. Retornar os ratos para suas gaiolas originais e fornecer-lhes comida e água suficientes.
6. Limpe todos os cantos do aquário. Elevar um lado do tanque e abra a torneira para a água de esgoto de saída.
7. Esterilizar o tanque com um spray de etanol 75% e expô-lo à luz UV.

3. modelo de avaliação: Teste comportamental

Nota: Todos os testes são realizados no laboratório comportamental. Ruído e luz extra não são permitidas durante o teste para evitar a perturbação. Se possível, use o mesmo pessoa (s) para realizar cada teste. Um casaco escuro e luvas são necessárias para o reconhecimento de escala de cinza no processamento de imagem. Executar o OFT primeiro como tem o menor efeito sobre o comportamento do rato.

1. OFT
   1. Verifique se o gravador sobre a caixa de campo aberto para se certificar que está ligado à estação de trabalho e cobre cada canto da caixa. Ajuste a iluminação para eliminar sombras na caixa.
   2. Mova os ratos em laboratório comportamental em suas gaiolas originais. Permita-lhes para se aclimatar pelo menos 1 h antes do teste.
   3. Limpar e desinfetar a caixa com 75% de etanol para garantir que não há nenhum excremento ou cheiro do experimento anterior.
   4. Remover um rato da gaiola por suas costas e colocá-lo suavemente na área central da caixa. Rapidamente os braços retiro da caixa para não bloquear o tiro.
   5. Entrada de número de ratos e iniciar a gravação. Contagem e registro da frequência de atividades verticais, como o rato, incluindo a criação e a escalada.
   6. Depois de 5 min, parar a gravação, tira da caixa com o rato e devolvê-lo para a gaiola.
   7. Repita as etapas 3.1.3 - 3.1.6 até que todos os ratos terminaram o teste.
2. EPM
   1. Execute as etapas de pré-seleção e aclimatação quanto o OFT (etapas 3.1.1 - 3.1.2).
   2. Remover um rato da gaiola por suas costas e colocá-lo suavemente sobre a parte de junção dos dois braços. Aterrar o rato para o braço esquerdo aberto e sair rapidamente para não bloquear o tiro.
   3. Entrada de número de ratos e iniciar a gravação. Contagem e registo a frequência de entradas diferentes de braço. Se o rato cai fora do labirinto no teste, buscá-lo e enviá-lo para o labirinto. Gravar informações detalhadas para análise de dados.
   4. Depois de 5 min, parar a gravação, pegue o rato fora e devolvê-lo para a gaiola.
   5. Remover o excremento e limpe o labirinto com 75% de etanol para eliminar cheiro do antigo rato.
   6. Repita as etapas 3.2.2 - 3.2.5 até que todos os ratos terminaram o teste.
3. Teste de ES
   1. Encha o tanque de natação (70 × 30 × 110 cm³) com 80 cm de água morna (25 ± 3 ° C).
      Nota: Se houver um termostato no tanque, temperatura da água deve ser definida em 37 ° C, que é semelhante à temperatura do corpo do rato. Caso contrário, defina-o como a temperatura para mantê-la constante.
   2. Faça uma carga para cada rato com pino cachos e amarrá-lo suavemente na sua raiz da cauda. A carga pesa 10% do peso do rato.
   3. Pegar um rato pela cauda e jogá-lo no tanque de natação. Se os ratos huddle ou agarrar-se à parede, os distinguem e conduzi-los de volta na água.
   4. Iniciar a cronometragem no momento em que o rato é colocado em água e parar o tempo quando ele está esgotado, que é demonstrada como a incapacidade de lutar fora da água com a boca e o nariz por baixo da água por mais de 10 s.
      Nota: Às vezes, exaustão e afogamento ocorrem de repente. Certifique-se de ter bastante experimentadores para gravar e salvar o animal ao mesmo tempo.
   5. Remova os ratos exaustos fora da água sem interromper os outros. Seque os cabelos, re-marcar seus números e enviá-los de volta para a gaiola.
   6. Mude a água no tanque após conclusão de um grupo. Depois de fazem todos os ratos, esvaziar o tanque de natação e limpar e esterilizá-lo com etanol e luz UV.

4. modelo de avaliação: Deteção de neurotransmissor Central

1. Anestesia o rato com injeção intra-peritoneal de hidrato de cloral 10% (3ml/kg) até que esteja inconsciente.
2. Decapitar o rato.
3. Faça uma incisão longitudinal ao longo da linha pós-medial, abrir o crânio para ambos os lados e expor o cérebro. Vire o crânio, remover o cérebro e colocar o cérebro em um saco de gelo.
4. Separar e remover o hipotálamo, que é a área em forma de diamante na parte central da base do cérebro que tem uma fronteira clara com tecidos circundantes. Coloque-o em um tubo estéril e congelá-lo com nitrogênio líquido. Armazene todas as amostras em um frigorífico de-80 ° C.
5. Detecta o conteúdo da DA e 5-HT no hipotálamo usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)⁸.

Resultados

Descrevemos um modelo do rato de fadiga central usando MMPM. 24 ratos Wistar são aleatoriamente divididos em grupo controle e o grupo modelo, com 12 ratos em cada grupo. O aparelho modelo é projetado como um tanque de água com plataformas estreitas na parte inferior (Figura 1). Ratos do modelo fique nas plataformas para 14 h por dia, incluindo o tempo de sono parcial, durante 21 dias (Figura 2).

Discussão

O MMPM é projetado originalmente por privação de sono⁹. Ratos são lançados em um tanque de água com plataformas fixadas na parte inferior. Impulsionado pelo medo instintivo de água, ratos permanecem em pé nas plataformas e ocorre sem dormir. O estudo mostra que diferentes horas de privação de sono levam a várias alterações no comportamento do rato e humor, incluindo reconhecimento de imparidade¹⁰en¹¹e fadiga central. Alguns pesquisadores...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.