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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.

Resumo

O circuito de retinotectal de girino Xenopus , composto de células ganglionares da retina (RGCs) no olho que formam sinapses diretamente sobre os neurônios no tectum óptica, é um modelo popular para estudar circuitos neurais como auto-montagem. A capacidade de realizar toda a célula gravações de braçadeira do remendo de neurônios tectal e a gravar respostas RGC-evocada, ou na vivo ou utilizando uma preparação de todo o cérebro, tem gerado uma grande massa de dados de alta resolução sobre os mecanismos subjacentes normal e formação de circuito anormal e a função. Aqui descrevemos como executar a in vivo preparação, a preparação original de todo o cérebro, e mais recentemente desenvolveram a preparação de fatia horizontal do cérebro para a obtenção de gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal. Cada preparação tem vantagens exclusivas experimentais. A preparação na vivo permite a gravação da resposta direta dos neurônios tectal a estímulos visuais projetadas sobre o olho. A preparação de todo o cérebro permite que os axônios RGC ser ativado em uma forma altamente controlada, e a preparação de fatia do cérebro horizontal permite a gravação de em todas as camadas do tectum.

Introdução

O circuito de retinotectal é o principal componente do sistema visual de anfíbios. É composto pelos RGCs nos olhos, que se projetam seus axônios para o tectum óptica onde formam conexões sinápticas com neurônios tectal pós-sináptica. O circuito de retinotectal de girino Xenopus é um modelo de desenvolvimento popular para estudar a função e formação de circuitos neurais. Existem muitos atributos do circuito de retinotectal dos girinos que a tornam um poderoso modelo experimental1,2,3. Um atributo importante e o foco deste artigo, é a capacidade de realizar gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal, vivo em ou utilizar uma preparação de todo o cérebro. Com uma plataforma de eletrofisiologia, equipada com um amplificador que suporta a tensão e corrente-grampo - modos de gravação, gravações de grampo celular patch permitam eletrofisiologia de um neurônio ser caracterizado em alta resolução. Como resultado, gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal em toda as fases chaves da formação de circuito retinotectal forneceram uma compreensão detalhada e abrangente do desenvolvimento e plasticidade de intrínseca4,5 , 6 , 7 e sináptica8,9,10,11 Propriedades. Combinando as gravações do neurônio tectal braçadeira remendo célula inteira, a habilidade de expressar genes ou morpholinos de interesse destes neurônios12e um método para avaliar o comportamento visual de guiada através de um teste de prevenção visual estabelecida13 promove o identificação de ligações entre moléculas, circuito função e comportamento.

É importante notar que o tipo de alta resolução de dados adquiridos a partir de gravações de grampo celular patch não são possíveis usar novos enfoques de imagem como o indicador de genética de cálcio GCaMP6, porque embora usando indicadores de cálcio permite a geração de imagens de cálcio dinâmica através de grandes populações de neurônios simultaneamente, há não direta ou forma óbvia de que os parâmetros elétricos específicos podem ser obtidos pela medição de fluorescência delta no somata e não há maneira de tensão grampear o neurônio para medir relações de corrente-tensão. Claramente estas duas abordagens distintas, eletrofisiológicas gravações e imagens de cálcio, possuem pontos fortes não sobrepostas e gerar diferentes tipos de dados. Assim, a melhor abordagem depende a questão experimental específica a ser tratada.

Aqui, descrevemos nosso método para a aquisição de gravações de grampo celular remendo de neurônios do tectum óptica de girino, usando uma in vivo preparação, preparação de todo o cérebro, e uma nova modificado a preparação de todo o cérebro que foi desenvolvida em nosso laboratório14 . Na seção de resultados de representante, demonstramos as vantagens experimentais de cada preparação e os diferentes tipos de dados que podem ser obtidos. Os limites e os pontos fortes de preparações diferentes, bem como dicas para solução de problemas, são incluídos na seção discussão.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Wyoming e institucional Cuidado Animal. Todos os procedimentos, incluindo gravações eletrofisiológicas, são realizados à temperatura ambiente, cerca de 23 ° C. Todos os métodos descritos aqui são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber15).

1. preparação na Vivo

  1. Anestesia o girino.
    1. Coloque o girino em um pequeno prato de Petri contendo solução de Steinberg com 0.01% MS-222 por aproximadamente 5 min.
      Nota: MS-222 aka "tricaina" é um peixe comum e anfíbios anestésico. Os girinos são gerados em solução a Steinberg em mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, NaCl 5.8, 4,9 HEPES.
    2. Certifique-se do que girino é profundamente anestesiada (não-responsivos e não mais natação) antes de prosseguir para a etapa 2.
  2. Fixe o girino anestesiado para um bloco de silicone submerso no chão do prato dissecando/gravação.
    1. Usar uma pipeta de transferência descartável para mover o girino anestesiado para um prato de dissecação/gravação contendo a solução de gravação externa (115 mM de NaCl, 2mm de KCl, com 3 mM de CaCl2, 3 mM de MgCl2, 5mm de HEPES, 1 mM de glicose; ajustar o pH para 7,25 usando 10 N de NaOH, osmolaridade 255 mOsm).
      1. Para minimizar o músculo espontâneo se mexer, adicione o bloqueador do receptor de acetilcolina, tubocurarina (100 µM) para a solução externa. (Normalmente, isso é feito usando uma pipeta de 200 µ l para adicionar 100 µ l de um estoque de tubocurarina 10 mM a 10 mL de solução externa).
    2. Usando pinos insetos, segura o girino, o lado dorsal, com uma pedra submersa de elastómero de silicone (tais como Sylgard 184, consulte Tabela de materiais para obter detalhes), que tem sido colada ao piso dissecação do prato.
      Nota: A colocação dos pinos é crítica: colocá-los em ambos os lados do cérebro, caudal suficientemente para evitar empalar os axônios RGC aferentes esse projeto do olho e penetra o cérebro apenas anterior a óptica tectum (Figura 1A).
  3. Filé do cérebro ao longo da linha mediana.
    1. Para uma visão clara do cérebro, retire a pele sobrejacente do cérebro tornando-se uma incisão superficial ao longo da linha mediana usando uma agulha estéril de 25-G.
    2. Filé do cérebro ao longo do eixo da linha média mesmo inserindo a agulha no tubo neural e puxando suavemente para cima (dorsalmente) tal que a porção dorsal do tubo é cortada corretamente (cortada) deixando a placa de assoalho intacta (Figura 1B).
      Nota: É importante que a placa de assoalho do tubo neural deixada intacta porque as entradas sensoriais aferentes entram o tectum através da placa de piso.
  4. Remova a membrana ventricular transparente que cobre os neurônios tectal.
    1. Mover o prato de gravação para o equipamento de eletrofisiologia e use uma ponta de pipeta de vidro quebrado para remover a membrana ventricular sobrejacente os corpos celulares de neurônios tectal. Quebre a ponta levemente arrastando-o através de um limpador de tarefa delicada.
    2. Dane-se a pipeta no suporte da pipeta e abaixá-la até o tectum óptica através do micromanipulador.
    3. Use a pipeta quebrada a casca da membrana ventricular longe o tectum.
      Nota: Não é necessário remover a membrana do tectum inteira; uma pequena janela irá ser suficiente e fornecer acesso à abundância de neurônios.
  5. Obter a célula inteira gravações de braçadeira do remendo.
    Nota: A abordagem a partir de agora é semelhante ao efectuar gravações de grampo celular remendo de fatias de cérebro de rato, conforme descrito em Segev, et al 16 (Figura 1C).
  6. Grave as respostas tectal neurônio para um flash de todo campo de luz projetada na retina.
    1. Para projeta um flash de todo campo de luz na retina, coloque uma fibra óptica adjacentes ao olho do girino. No outro extremo da fibra óptica é um LED em consonância com um resistor variável que permite para a luminosidade da luz ser controlado. Acionar o LED pela saída digital do amplificador. Desta forma, todo campo flashes de diferentes intensidades de luz podem ser gravado(Figura 4).

2. todo o cérebro preparação

  1. Execute as etapas 1.1 a 1.3.
    Nota: Não há nenhuma necessidade para tubocurarina na solução externa para esta preparação.
  2. Isole o cérebro.
    1. Use uma agulha de 25 G para romper o rombencéfalo(Figura 2).
    2. Para isolar o cérebro inteiro do girino, passa suavemente a agulha por baixo do cérebro, em uma direção caudal e rostral para separar todas as lateral e ventral do tecido conjuntivo e fibras nervosas.
  3. Proteger o cérebro de um bloco de elastômero de silicone.
    1. Assim completamente livre, proteger o cérebro de um bloco de elastômero de silicone, colocando um pino através de um dos bulbos olfatórios e outro alfinete e o rombencéfalo (Figura 2B). Esta é a configuração ideal para gravação de neurônios tectal.
  4. Mova o prato que contém a preparação de cérebro inteiro fixado do escopo dissecar ao equipamento de eletrofisiologia. Remova a membrana ventricular utilizando uma pipeta de vidro quebrado, conforme descrito na etapa 1.4.
  5. Coloque um eletrodo bipolar estimulante sobre o quiasma óptico (onde os panfletos do axónio de cada olho cruzam no mesencéfalo) para ativar diretamente os axônios RGC.
    1. Coloque o eletrodo bipolar estimulante rostral e quase ao lado, o ventrículo médio grande. O quiasma situa-se imediatamente rostral ao ventrículo médio grande (Figura 2B).
      1. Delicadamente mais o eletrodo estimulante para baixo sobre o quiasma tal que uma pequena amolgadela é formada no tecido. O eletrodo bipolar é impulsionado por um estimulador de pulso que permite que a força de estimulação a ser precisamente controlada.
  6. Executar a gravação de grampo de remendo de célula inteira (Figura 2C) conforme descrito por Segev, et al 16

3. preparação de fatia do cérebro horizontal

  1. Execute os passos 2.1 para 2.3.
  2. Use uma lâmina de barbear para excisar a quarta mais lateral (que na vivo corresponde a quarta mais dorsal) de um lado de uma óptica tectum. Este corte é feito paralelo ao plano rostral-caudal, como mostrado na Figura 3.
  3. Re-pino do cérebro para o lado do elastómero de silicone com o fatiado lateral voltada para cima (de modo que o somata e neurópilo podem ser acessados diretamente por gravação) e a superfície ventricular do cérebro para fora do bloco de elastômero de silicone (Figura 3 B) (para que um eletrodo bipolar pode ser colocado sobre o quiasma óptico).
  4. Executar a braçadeira do remendo de célula inteira ou gravação local potencial arquivada (Figura 3C) conforme descrito por Segev, et al 16

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Resultados

Para gravar as respostas evocadas de luz um flash de todo campo de luz é projetado na retina enquanto a resposta resultante é gravada a partir de neurônios tectal individuais(Figura 4). Este protocolo particular é projetado para medir tanto a resposta do neurônio à luz activar ("no" resposta) e em seguida desligar 15 s mais tarde para medir a "resposta fora." Tectal neurônios normalmente exibem robusto e desativar respostas (modo de b...

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Discussão

Todos os métodos descritos neste trabalho são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber15). Pela fase 42, os girinos são suficientemente grande e suficientemente desenvolvidos para que os pinos de insetos podem ser colocados em ambos os lados do cérebro para gravações na vivo e para a realização da dissecação do cérebro inteiro. Nas fases anteriores, quando os girinos são essencialment...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Com a subvenção de NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GAmphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)Fisher ScientificP217-500Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGUsed to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GUsed to prepare Stienberg's solution  
Magnesium Sulfate (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GUsed to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)J.T. Baker2444-01Used to prepare external recording solution
D-glucose AnhydrousMallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect PinsFine Science Tools26002-100.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning761028Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mmFisher ScientificAS4052Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)BD305122Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe BD309659Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glassSutter InstrumentBF150-86-10HPPulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipesKimberly-Clark34120Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7BCurrent clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop ControllerSutter InstrumentMP-285/TControl for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)ThorlabsM530F2Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)FHC30207Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex StimulatorA.M.P.I. (Israel) Contact manufacturerFlexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch AmplifierMolecular Devices2500-0157Amplifier for voltage- and current-clamp recording 
Digidata 1322A digitizerMolecular Devices2500-135Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab TableTMC63-533Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bitDellD06D001Computer running electrophysiology software
c2400 CCD cameraHamamatsu70826-5Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless RazorbladesGilletteCMM01049Platinum-coated stainless razor blades
Transfer PipetsFisher Scientific13-711-7MDisposable Polyethylene transfer pipets

Referências

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  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
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  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
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  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

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