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Resumo

Descreveremos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII Lambda selecione em culturas de células de roedores transgênicos ou correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos.

Resumo

Um número de modelos de animais transgênicos e sistemas de deteção de mutação foram desenvolvido para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos. Destes, ratos transgénicos e o Lambda (λ) Select cII sistema de deteção de mutação têm sido empregadas para experimentos de mutagenicidade por muitos grupos de pesquisa em todo o mundo. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII selecione Lambda, que pode ser aplicado às células cultivadas de mouses/ratos transgénicos ou os correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. O protocolo consiste das seguintes etapas: (1) isolamento do DNA genômico das células ou tecidos/órgãos de animais transgénicos trataram em vitro ou na vivo, respectivamente, com um composto de teste; (2) recuperação do vetor shuttle lambda carreg um gene repórter mutacional (ou seja, cII transgene) partir do DNA genômico; (3) embalagem dos vetores resgatados em bacteriófagos infecciosas; (4) infectar uma bactéria de acolhimento e cultivo seletivo condições para permitir a propagação das mutações induzidas cII ; e (5) marcando a cII-mutantes e DNA sequência análise para determinar a frequência de mutação cII e espectro de mutação, respectivamente.

Introdução

Uma ampla gama de modelos de animais transgênicos e sistemas de deteção de mutação foram desenvolvidos para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos. Destes, ratos transgénicos Big Blue (referido daqui em diante como BB) e o λ Select cII sistema de deteção de mutação têm sido empregadas para experimentos de mutagenicidade por este grupo e muitos outros pesquisa grupos em todo o mundo1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Nos últimos 16 anos, temos investigado os efeitos mutagênicos de diversos agentes químicos e/ou físicos usando esses animais transgénicos ou suas correspondentes culturas de células embrionárias fibroblastos tratadocom com um composto de teste e posteriormente analisaram os fenótipo e genótipo do transgene cII pelo ensaio λ Select cII e sequenciamento de DNA, respectivamente,10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. o genoma destes animais transgénicos contém um vetor de transporte λ do bacteriófago (λLIZ) integrado no cromossoma 4 como uma concatemer de cabeça-de-cauda multi cópia1,2,25. O vetor de transporte λLIZ carrega dois genes repórter mutacional, nomeadamente o Laureano e cII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,,43,44,45 , 46 , 47. o ensaio de Select cII λ baseia-se na recuperação dos vetores de transporte de λLIZ de DNA genômico de células derivadas de tecidos/órgãos de animais transgénicos1,2,25 . Os vetores de transporte λLIZ recuperados são então embalados nas cabeças do fago λ capazes de infectar um host indicador Escherichia coli. Posteriormente, as bactérias infectadas são cultivadas em condições seletivas para permitir a análise de mutações no cII transgene1,3e marcando.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o ensaio de Select cII λ, que consiste de isolamento do DNA genômico de células/órgãos de animais transgénicos tratados em vitro/na vivo com uma teste de recuperação composto, da λLIZ shuttle vetores partir do DNA genômico, embalagem dos vetores em fago λ infecciosas, infecção do hospedeiro e. coli com os bacteriófagos, identificação da cII-mutantes sob condições seletivas para determinar a frequência de mutação de cII , e Análise de sequências de DNA para estabelecer o espectro de mutação de cII . O protocolo pode ser aplicado a do mouse/rato transgénico célula culturas tratadas em vitro com um agente químico/físico de interesse, ou tecidos/órgãos dos animais correspondentes tratados na vivo com o teste químico/agente1, 2,4,,48,,49,50,51,52. Uma apresentação esquemática do ensaio λ Select cII é mostrada na Figura 1.

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Protocolo

1. isolamento do DNA genômica de fibroblastos embrionários de Mouse

Nota: Fibroblastos embrionários de mouse principal são isolados de embriões derivados de ratos transgénicos BB com fundo genético C57BL/6, de acordo com o protocolo publicado53. A matéria-prima para este protocolo consiste de 1 x 106 a 1 x 107 células de fibroblasto embrionário tratados com um teste composto versus controle. A colheita e a contagem destas células usando os métodos padrão são descritos em referências10,54,55.

  1. Preparar um (0,3 M de sacarose, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, espermidina 0,5 mM, espermina 0,15 mM e 2 mM EDTA) do buffer, buffer B (150 mM NaCl e 5 mM EDTA, pH 7,8) e C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 do buffer 20 mM de NaCl, 20 mM de EDTA e 1% SDS) em avanço e conserva em temperatura ambiente (RT) por até um ano54,55.
  2. Ressuspender as células em 2 – 4 mL de tampão A em um tubo de centrifuga conico de 15 mL pipetando repetidamente acima e para baixo usando uma ampla furo a ponta da pipeta 1.000 µ l.
  3. Adicionar um volume (2 – 4 mL) tampão A contendo 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (por exemplo, Nonidet P40) utilizando uma pipeta sorológica de vidro.
  4. Incube o tubo no gelo por 5 min.
  5. Centrifugar o tubo a 1.000 x g durante 5 min à RT
  6. Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento com 10 a 15 mL de tampão A utilizando uma pipeta sorológica de vidro.
  7. Resuspenda o pellet em 2 – 4 mL de tampão B.
  8. Adicionar um volume (2 – 4 mL) tampão C contendo 600 µ g/mL proteinase K.
  9. Incubar o tubo por 3 h a 37 ° C.
  10. Adicione RNase A uma concentração final de 100 µ g/mL.
  11. Incubar o tubo para um adicional 1 h a 37 ° C.
  12. Adicionar um fenol de volume (2 – 4 mL) (saturado em 0.1 M Tris-HCl, pH 8,0) álcool:chloroform:isoamyl (25:24:1 vol/vol).
    Nota: Fenol pode representar um perigo de saúde grave e deve ser manuseado com extrema precaução. Fenol é altamente corrosivo para a pele e facilmente absorvido através dele e exibe outros efeitos. Quando lidar com fenol, sempre use duplo enluvamento, usar óculos de proteção e trabalhar em uma coifa de química.
  13. Misture bem por inversão do tubo por 5 min em rotacao tubo a 4 ° C.
  14. Centrifugar o tubo a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C.
  15. Retire a fase aquosa (camada superior) para um novo tubo utilizando uma pipeta sorológica de vidro.
  16. Repita a extração de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio 1 a 3 vezes até a fase aquosa é clara e a interface não é mais turva.
  17. Adicione o volume de 1/10 (200 – 400 µ l) 3M acetato do sódio, pH 5.2.
  18. Adicione 2.5 volume (5-10 mL) 100% de etanol (refrigerados) e inverta o tubo delicadamente à mão por 2 – 3 min.
  19. Spool o DNA com um gancho de vidro e transferi-lo para um novo tubo contendo 1 – 5 mL 70% etanol e lave-o cuidadosamente. Alternativamente, centrifugar o tubo em alta velocidade (3.500 x g) a 4 ° C para o DNA de pelotas e lave-o cuidadosamente com 1 – 5 mL 70% etanol.
  20. Centrifugar o tubo em alta velocidade (3.500 x g) a RT, remover o sobrenadante e secar o DNA para 10-15 min.
  21. Dissolver o DNA no buffer de TE de µ l 10 – 100 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) e armazenar a 4 ° C (para armazenamento de curto de até um mês) ou a-20 ° C (por longo período de armazenamento). A concentração ideal para DNA para o ensaio de Select cII λ é de 0,5 m a 1,0 µ g / µ l (em tampão TE)56.

2. in Vitro Packaging reação

  1. Por uma reação de embalagem, acrescentar ~ 5 µ g DNA genômico (volume final: 8 – 12 µ l, DNA genômico foi isolado na secção 1 do rato embrionárias fibroblastos tratados em vitro com um composto de teste ou controle) para um tubo de microcentrifugadora que contém o primeiro mistura de reação (~ 10 µ l).
    Nota: Internamente preparados ou extratos de embalagens λ comercialmente disponíveis são usados em laboratórios diferentes. Na embalagem comercial kit de extrato usado aqui56 (consulte a Tabela de materiais), tubos vermelhos continham o primeiro mix de reação (~ 10 µ l) e tubos de azuis continham a mistura de reação segunda (~ 70 µ l para pelo menos 5 reações).
  2. Incubar o tubo para 90 min a 30 ° C.
  3. Adicione o volume necessário (~ 12 µ l) da segunda reação mistura ao tubo.
  4. Incubar o tubo para um adicional 90 min a 30 ° C.
  5. Adicione 1,1 mL de tampão SM para o tubo.
    Nota: 1 mL desta solução (ou seja, mistura de reação de embalagem) será usado para a seleção do λ cII-mutantes. O restante será usado para a titulação.
    1. Preparar o tampão SM misturando 5,8 g NaCl, 2,0 g de MgSO4.7h2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) e gelatina de 2% (p/v) de 5 mL. Adicione O dH2até um volume final de 1 litro, autoclave de 30 min. armazenar em temperatura ambiente por até 1 ano.
  6. Vórtice o tubo contendo a amostra de DNA empacotada para 10 s no RT (vigorosa num Vortex).
  7. O pulso girar o tubo em uma loja no gelo e microcentrifuga até estar pronto para usar. Se a amostra não vai ser usado dentro do mesmo dia da embalagem, adicionar 50 µ l de clorofórmio de DNA embalado por mL da amostra, vórtice suavemente e armazenar a 4 ° C por até 2 semanas.

3. preparar a cultura de bactérias Escherichia coli G1250

  1. Pelo menos dois dias antes de chapeamento, fazer umas placas de raia bacteriana de Escherichia coli (e. coli) G1250 em placas de ágar TB1-canamicina.
    1. Prepare-se placas de ágar TB1-canamicina como segue. Mix de 5,0 g de NaCl, peptona de caseína 10,0 g e ágar 12,0 g. Adicione 800ml dH2O. adicionar 1 mL 0,1% tiamina cloridrato. Ajustar o pH a 7,0 com NaOH ou HCl. Add dH2O até um volume final de 1 litro.
    2. Misture bem e autoclave de 30 min. deixe arrefecer a 55 ° C. Adicione a 50,0 mg canamicina e misture. Despeje em pratos de petri estéril-100mm (20 – 25 mL por prato). Armazenar as placas a 4 ° C por até duas semanas.
  2. Incube as placas bacterianas raia numa incubadora estacionária 30 ° C durante pelo menos 24 h.
  3. Um dia antes do chapeamento, combine 10 mL de meio líquido TB1 com 100 µ l de 20% (p/v) maltose-1 M MgSO4 solução num tubo cônico estéril 50 mL tampa de rosca.
    1. Prepare o meio líquido TB1 como segue. Mix de 5.0 g NaCl peptona de caseína 10,0 g, adicionar 800ml dH2O, cloridrato de tiamina 1 mL 0,1% e ajustar o pH a 7,0 com NaOH ou HCl. Em seguida, adicione O dH2até um volume final de 1 litro, misture bem e autoclave para 30 min. armazenam o médio em RT por até três meses.
    2. Prepare-se 20% (p/v) Maltose-1 M MgSO4 como segue. Misture 20,0 g Maltose e 24,6 g MgSO4. 7H2O, em seguida, adicione O dH2até um volume final de 100 mL. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C por até 6 meses.
  4. Inocule o meio líquido com várias colónias da placa bacteriana raia usando um estéril inoculando laço56.
  5. Incube a cultura líquida durante a noite em um 30 ° C a tremer de incubadora com agitação vigorosa (250 – 300 rpm).
  6. No dia do chapeamento, centrifugar o tubo cônico contendo a cultura líquida G1250 a 1.500 x g durante 10 minutos a RT para as células bacterianas de Pelotas.
  7. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de 10 mM de MgSO4.
  8. Medir a absorvância de uma 01:10 diluição da suspensão celular no comprimento de onda de 600 nm, utilizando um UV-Vis espectrofotômetro (por exemplo, 100 suspensão de células µ l + 900 µ l 10mm MgSO4)56.
  9. Dilua a suspensão de células para um final OD600 de 0.5 com 10 mM de MgSO4. A suspensão preparada de G1250 e. coli com OD600 = 0,5 é referido como 'a cultura de chapeamento de G1250'.
  10. Armazenar a cultura de chapeamento de G1250 no gelo e usar dentro de 1-2h.

4. as amostras de DNA empacotado do chapeamento

  1. Por uma amostra de DNA empacotada, prepare dezesseis tubos de fundo redondo de2 estéril 14 x 100 mm e placas de ágar dezesseis TB1. Dez de cada jogo será usado para triagem e seis para titulação (três para Titer 20) e três para 100 Titer.
    1. Prepare-se placas de ágar TB1 como segue. Mix de 5.0 g NaCl, peptona de caseína 10,0 g e 12,0 g de ágar-ágar, em seguida, adicione 800ml dH2O e cloridrato de tiamina 1 mL 0,1%. Ajustar o pH a 7,0 com NaOH ou HCl e adicionar O dH2até um volume final de 1 L.
    2. Misture bem e autoclave para 30 min. deixe a mistura esfriar a 55 ° C e, em seguida, despeje em pratos de Petri estéril 100mm (20 – 25 mL por prato). Armazene as placas a 4 ° C por até duas semanas.
      Nota: Placas de ágar TB1 devem ser preparadas pelo menos 24 h antes da utilização.
  2. Alíquotas de 200 µ l da cultura de chapeamento de G1250 em cada tubo de fundo redondo.
  3. Para titulação, faça uma diluição de 1: 100 da amostra do DNA empacotada e misture bem vortexing (ou seja, 10 µ l embalados de DNA + µ l 990 SM buffer).
  4. Adicione 20 µ l da diluição 1: 100 para cada um dos três tubos 20 Titer.
  5. Adicione 100 µ l da diluição 1: 100 para cada um dos três tubos Titer 100.
  6. Para a seleção, adicionar 100 µ l do 'não diluído ' embalada amostra de DNA para cada um dos tubos de rastreio de dez.
  7. Processar todos os titulagem e tubos de triagem (2 x 3 + 10 = 16 tubos), da seguinte forma: misturar bem vortexing por aproximadamente 10 s e então incubar a temperatura ambiente por 30 min permitir que o host de Escherichia coli para adsorver os fago.
  8. Adicionar 2,5 mL TB1 fundido com microondas top agar (arrefecido a 55 ° C) para cada título ou triagem tubo, misture imediatamente vortexing (suavemente), e despejando o título apropriado ou TB1 placas de ágar de triagem.
    1. Prepare o TB1 top agar como segue. Mix 5.0 g NaCl, peptona de caseína 10,0 g e 7,0 g de ágar-ágar, então adicione 800ml dH2O. adicionar 1 mL 0,1% tiamina cloridrato e ajustar o pH a 7,0 com NaOH ou HCl. Finalmente, adicione O dH2até um volume final de 1 litro.
    2. Misture bem e autoclave por 20 – 25 min. armazenar em temperatura ambiente por até três meses.
    3. Antes da utilização, derreter agar top TB1 preparado no microondas, misture bem e deixe arrefecer a 55 ° C em banho-maria.
      Nota: O top TB1 derretida e arrefecida é adicionado ao conteúdo de cada título ou tubo de rastreio e após a mistura, é derramada a título apropriado ou placas de ágar de triagem TB1.
  9. Deixe as placas repousar durante 15 a 30 min à temperatura ambiente, com a tampa entreaberta para evitar a condensação.
  10. Inverter as placas e colocar as placas de dez triagem numa incubadora estacionária 24 ° C e incube por 46 – 48 h (ou seja, condições seletivas) e as seis placas de título em uma incubadora estacionária 37 ° C e incubar por 24 h/durante a noite (ou seja, condições não-seletivo).
    Nota: Para a garantia da qualidade e padronização dos resultados, controle comercialmente disponíveis do fago soluções contendo uma mistura de sua e mutante cII com frequência de mutação conhecida são chapeadas juntamente com as amostras de DNA empacotadas e incluídas em todos os ensaio é executado56.

5. examinar o título e placas de triagem para determinar a cII frequência mutante

  1. Após 24 h/pernoite incubação a 37 ° C, contagem do número de placas formou-se em cada uma das três placas 20 título e título 100 placas. Para mais facilmente identificar as placas, segure a placa ao lado de uma caixa de luz branca e contra um fundo escuro com a tampa removida (ver Figura 2).
  2. Faça uma média do número de placas contada em cada conjunto de placas 20 título e título 100 placas (triplicata, cada um).
  3. Escolha o número médio do conjunto de placas de título que cai mais próximo para a gama de placas de 50 – 200 pelo jogo de placa.
  4. Calcule o número total de placas exibido nas placas de dez triagem como segue:
    Total de placas selecionadas = (número médio de placas no conjunto escolhido de título placas ÷ número de µ l da diluição usado por placa de título escolhido) x fator de diluição x número de µ l de amostra de DNA embalada por triagem placa [100 µ l/placa] x número de rastreio placas [10].
    Nota: por exemplo, se o número médio de placas por placa no conjunto de placas Titer 20 é 128 e o número correspondente no conjunto de placas Titer 100 é 478, o número 128 será usado para o cálculo do número total de placas selecionados , como segue:
    (128 ÷ 20) x 100 [fator de diluição] x 100 [µ l/placa] x 10 [placas] = 640.000
    Isso é equivalente a multiplicar o número médio de placas por 5.000 ou 1.000, se o número médio é baseado na contagem de placas Titer 20 ou 100 Titer, respectivamente.
  5. Após incubação 46 – 48 h a 24 ° C, contagem do número total de placas formou-se nas placas de dez triagem (siga as instruções fornecidas na secção 5.1).
    Nota: A frequência de mutação cII é calculada dividindo o número total de placas formadas nas placas de triagem pelo número total de placas selecionados. Usar o exemplo acima, se o número total de placas contadas nas placas de triagem de dez é o 112, a frequência de mutação de cII para esta amostra de DNA seria 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5.

6. verificação da Putative λ cII mutantes, amplificação por PCR e sequenciamento de DNA

  1. A placa em questão com uma ponta da pipeta estéril de largo diâmetro do núcleo e expulsá-lo (por pipetagem para cima e para baixo) em um tubo estéril microcentrifuga contendo 500 µ l de tampão estéril de SM.
  2. Incubar durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente, ou a 4 ° C durante a noite, para permitir que as partículas do fago eluir de agar plug.
  3. Em um tubo de fundo redondo de2 estéril 14 x 100 mm, misturar 200 µ l de cultura de chapeamento de G1250 com 1 µ l da solução do fago tubulares e incube por 30 min em RT
  4. A amostra com 2,5 mL de 55 ° C superior TB1 de ágar fundido da placa e incubar a placa a 24 ° C para 46 – 48 h (condições seletivas), conforme descrito nas seções 4.8 – 4.10.
  5. Uma vez que as placas secundárias formaram, use uma ponta de pipeta para escolher cuidadosamente um único λ verificado bem isolados cII-placa mutante (evitar tocar o ágar inferior).
    Nota: Replating as placas mutante putativo cII serve dois propósitos: (i) chapeamento artefatos às vezes pode ser confundido com pequenas placas; e (ii) um núcleo de agarose tirado de uma placa de triagem pode conter não mutantes phage(s) juntamente com um mutante do fago. Placas secundárias de uma baixa densidade replating fornecerá um modelo mutante não contaminado por PCR e posterior análise de sequências de DNA.
  6. Transfira a placa para um tubo de microcentrifugadora contendo água bidestilada a µ l 25 pipetando para cima e para baixo.
  7. Coloca o tubo em água fervendo por 5 min.
  8. Centrifugar a velocidade máxima (18.000 x g) durante 3 minutos em RT
  9. Transferência imediatamente de 10 µ l do sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora novo contendo 40 µ l de uma PCR mastermix na qual as concentrações finais dos reagentes são 1 tampão PCR de Taq x, 10 pmol cada dos primers para diante e reversos, 12.5 nmol de cada dNTP e 2,5 U de Taq DNA polimerase.
    Nota: Os primers para diante e reversos são os seguintes: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (posições-68 a -50 em relação a cII começar códon) e 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (posições +345 para +365 em relação a cII códon de início), respectivamente.
  10. Amplificar o modelo usando os seguintes parâmetros de ciclismo: uma desnaturação de 3min a 95 ° C, seguido de 30 ciclos de 30 s a 1 min a 60 ° C, 95 ° C e 1 min a 72 ° C, com uma extensão final de 10 min a 72 ° C.
  11. Purifica o produto do PCR bp 432 contendo o gene de cII e flanqueiam regiões usando kits de purificação de PCR comercialmente disponíveis, de acordo com as instruções do fabricante.
  12. Realizar o sequenciamento de DNA usando uma plataforma de sequenciamento adequado e analisar as sequências de ADN resultantes para detectar mutações no transgene cII (veja a nota abaixo).
    Nota: Isto é melhor conseguido pelo alinhamento com a sequência de cII de referência usando o software, como o servidor de alinhamento de sequência de T-café baseado na web. Para obter instruções sobre como usar o programa, visite: http://tcoffee.crg.cat/

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Resultados

Dependendo da distribuição de dados, testes paramétricos ou não-paramétricos são usados para determinar a importância da diferença na frequência de mutação a cII entre os grupos tratamento e controle (ou seja, induzida contra frequências mutantes espontâneas) . Comparação das frequências induzidas cII mutante entre grupos diferentes de tratamento é feita por vários (emparelhada) testes estatísticos, conforme aplicável. Teste de Adams e Skopek...

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Discussão

O ensaio de Select cII λ é usado para detecção de mutações no transgene cII recuperadas o DNA genômico de células derivadas de tecidos/órgãos de roedores de BB3. O genoma destes animais transgénicos contém várias cópias em tandem do vetor cromossomicamente integrado λLIZ shuttle, que transporta a cII (294 bp) e Laureano (1.080 bp) transgenes, como o repórter mutacional genes1, 2 ,

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Divulgações

Todos os autores não declaram nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

Nós gostaríamos de reconhecer as contribuições de todos os colegas e colaboradores para nossos estudos originais, cujos resultados têm sido referidos neste manuscrito (para fins ilustrativos). O trabalho dos autores é suportado por doações do Instituto Nacional de dentárias e craniofaciais pesquisa do National Institutes of Health (1R01DE026043) para AB e pela Universidade do programa de pesquisa de doença California Tobacco-Related a AB ( TRDRP-26IR-0015) e ST (TRDRP-25IP-0001). Os patrocinadores do estudo não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados, análise de dados, interpretação dos dados, redação do relatório, ou na decisão de enviar para publicação.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarMO Bio Laboratories, Inc.12112-05Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitThermo Fisher Scientific4337455None
Casein PeptoneAlfa AesarH26557None
GelatineJ. T. Baker2124-01Powder
GlycerolFisher ScientificBP 229-1 / M-13750None
LB AgarFisher ScientificBP 9724-500None
QIAquick PCR purification kitQiagen810450 PCR purification reactions
Sodium Acetate TrihydrateFisher ScientificM-15756None
Taq5000 DNA Polymerase Qiagen201207None
Thiamine HydrochlorideMacron Fine Chemicals2722-57None
Transpack Packaging ExtractStratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.20022350 packaging reactions
Tris BaseFisher ScientificBP 152-1 / EC 201-064-4None
TryptonBiosciencesRC-110None

Referências

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