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Resumo

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Resumo

Transporte de elétrons da membrana trans-plasma (tPMET) desempenha um papel na proteção das células do stress redutivo intracelular, bem como a proteção contra danos por oxidantes extracelulares. Este processo de transporte de elétrons do redutores intracelulares para o extracelulares oxidantes não é bem definido. Aqui apresentamos os ensaios espectrofotométricos por C2C12 myotubes para monitorar tPMET utilizando os aceitadores de electrões extracelular: sal de tetrazólio solúvel em água-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP ou DCIP). Através da redução destes aceitadores de electrões, somos capazes de monitorar este processo em uma análise em tempo real. Com a adição de enzimas como ascorbato oxidase (AO) e superóxido dismutase (SOD) para os ensaios, podemos determinar qual parte do tPMET é devido à produção de exportação ou superóxido de ascorbato, respectivamente. Enquanto WST-1 foi mostrado para produzir resultados estáveis com baixo fundo, DPIP era capaz de ser re-oxidado após a adição do AO e SOD, que foi demonstrado com análise espectrofotométrica. Este método demonstra um ensaio espectrofotométrico em tempo real, multi bem, rápido, com vantagens sobre outros métodos usados para monitorar tPMET, tais como o ferricianeto (BECN) e redução de c ferricytochrome.

Introdução

A visão de que a membrana plasmática tem uma capacidade inerente redox1levou a capacidade das membranas de plasma purificadas de reduzir aceitadores de electrões. Visto anteriormente em fungos, plantas e animais, o tPMET é um processo comum a vários organismos2,3,4,5. Especificamente, este processo tem sido demonstrado em Saccharomyces cerevisiae, cenoura células, hemácias, linfócitos, osteossarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético e neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. em um processo que transporta elétrons através da membrana de plasma para reduzir oxidantes extracelulares, tPMET está envolvido em muitas funções celulares, incluindo: célula crescimento5,8, de viabilidade celular9, ferro metabolismo10, sinalização11,12,13e proteção de1514,12,do espécies reactivas de oxigénio celular. Devido ao envolvimento do tPMET em muitas funções celulares, um desequilíbrio de tPMET tem sido hypothesized para contribuir para o desenvolvimento de algumas condições graves de saúde, incluindo câncer16, doença cardiovascular,17e metabólica Síndrome de18.

Existem várias maneiras de monitorar a transferência de electrões através da membrana de plasma, mas a técnica mais utilizada é avaliar a redução de aceitadores de electrões extracelular através de ensaios colorimétricos. Aceitadores de electrões extracelular comumente usados são sais de tetrazólio, DPIP, BECN e ferricytochrome c19,20. O sal de tetrazólio mais comumente usado é um conhecido sal da segunda geração como WST-119. Este composto é mais fácil de utilizar em ensaios colorimétricos comparados com sais de tetrazólio primeira geração devido a dois grupos sulfonato, que aumentam sua solubilidade de água21. WST-1, em conjunto com o methosulfate de 1-metoxi-Fenazina aceitador elétrons intermediários (mPMS), é reduzido em eventos de transferência de elétron dois. Esta redução altera a forma oxidada fraca-colorido do WST-1 para um mais intenso, amarelo formazan20,22. WST-1 possui um coeficiente de extinção molar elevada de 37 x 103 M-1cm-1, levando a um ensaio de alta sensibilidade21,22. DPIP é também utilizado como um aceitador do elétron extracelular para monitorar tPMET. Tem sido demonstrado que DPIP pode ser diminuído extracelularmente tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário23,24. Devido à falta de aceitadores de electrões intermediário, DPIP pode diretamente a pick-up os elétrons da membrana plasmática, ao contrário do WST-124. Semelhante a DPIP, BECN foi mostrado para ser diminuído extracelularmente para ferrocianeto de tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário19,24. Ao contrário do WST-1 e DPIP, BECN tem um coeficiente de extinção molar baixa, levando a uma baixa de sensibilidade de ensaio9. Outra aceitador de electrões extracelular comumente usados para monitorar tPMET é c ferricytochrome semelhante a WST-1, ferricytochrome c redução aumenta com o uso do aceptor de elétrons intermediários, mPMS22. Ao contrário do WST-1, o método de ferricytochrome c é menos sensível devido a um fundo elevado e um coeficiente de extinção molar baixa22.

Aqui nós apresentamos um método de análise em tempo real de tPMET através de ensaios espectrofotométricos. O método utilizado os aceitadores de electrões extracelular WST-1 e DPIP, que tenham um coeficiente de extinção molar alta enquanto ser menos caro em comparação com o outro comumente usado aceitadores de electrões extracelular como ferricytochrome c. Utilizamos o methosulfate Fenazina (PMS) em vez de mPMS têm uma composição química semelhante e PMS é muito menos dispendioso. mPMS fotoquimicamente estável que é uma característica importante para um kit comercial que tem uma vida útil longa. No entanto, fazemos PMS fresco para cada ensaio, por estabilidade não deve ser um problema. Também apresentamos um método para avaliar possíveis interações enzimáticas (ver Figura 1) entre o aceitador de electrões extracelular e enzimas que podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais o processo de tPMET. Especificamente, as enzimas AO e SOD podem ser usado determinam qual parte do tPMET é devido ao transporte de ascorbato ou liberação de superóxido extracelular, dois métodos comuns para elétrons ser transportado através da membrana plasmática.

Protocolo

Nota: Consulte a Figura 1 para uma visão esquemática das principais etapas.

1. ensaio de redução WST-1

  1. Crescem e se diferenciam células aderentes C2C12, usando de procedimentos de cultura de célula padrão7 em uma placa de 96 poços utilizando linhas A-F.
    1. Use um meio de diferenciação consistindo de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 2% de soro de cavalo, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 mg/mL. Incube a 37 ° C com 5% CO2células.
    2. Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, suplemento meios de diferenciação com o ácido ascórbico 100 µM. Permitir que as células incubar em meios de diferenciação para ~ 24-48 h.
  2. Prepare as soluções WST-1 e PMS.
    1. Para fazer um estoque de 10 mM do WST-1, dissolver 0,033 g do WST-1 (fórmula peso (FW): 651.34 g/mol) em 5 mL de fosfato, tampão salino (PBS). Loja a 4 ° C.
    2. Para fazer um estoque de 5 mM do PMS, dissolver 0,0023 g de PMS (FW: 306.34 g/mol) em 1,5 mL de deionizada H2O (diH2O). Armazenar a-20 ° C e proteger da luz.
  3. Adicionar 0,0108 g de glicose para uma concentração final de 5 mM a 11,4 mL de PBS ou HEPES tampão salino (HBS; sal de sódio HEPES 20 mM, 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM de MgSO4, 1mm CaCl2). Adicione 480 µ l de 10mm WST-1 para uma concentração final de 400 µM e 48 µ l de 5mm PMS para uma concentração final de 20 µM.
  4. Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicione 6 µ l de diH2O e para outra alíquota adicionar 6 µ l de 2 kU/mL para uma concentração final de 2 U/mL.
  5. Ao monitorar o envolvimento de superóxido em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicionar 55 µ l de tampão de4 de KPO 0,1 M e para a outra alíquota adicionar µ l 55 de 6,5 kU/mL SOD para uma concentração final de 60 U/mL.
  6. Lave as células com PBS. Aspirar a mídia e adicionar 150 µ l PBS. Em seguida, Aspire a PBS.
    Nota: O ensaio é feito com células chapeadas, anexadas. Assim, não há nenhum centrifugação ou o uso de tripsina no processo de lavagem.
  7. Adicione 100 µ l de solução WST-1 (-) SOD ou (-) de colunas 1-6 e adicionar 100 µ l de solução WST-1 (+) SOD ou (+) de colunas 7-12 na placa de 96 poços. Usar linhas G e H, como controles de fundo (ou seja, para monitorar a mudança em absorvância no reagente sozinho em poços sem células).
  8. Medir os valores de absorvância utilizando o espectrofotômetro cada 10min por 1h em 438 nm.
  9. Após a leitura, aspirar a mídia e lave cada uma com 150 µ l de PBS. Em seguida, Aspire a PBS.
  10. Calcule a variação de absorvância para cada poço subtraindo-se a absorbância inicial para um poco de absorvância em qualquer ponto do tempo para aquele poço. Corrigi essa alteração para a mudança de absorbância (se houver) observada em poços de fundo (ou seja, poços com solução de ensaio, mas sem células).
  11. Para análise, normalizar os dados de absorbância para a medição de controle de 60 min ou lavar os poços com PBS ou HBS e então executar um ensaio de proteína bicinchoninic ácido (BCA).
  12. Adicionar o padrão de albumina de soro bovino (BSA) 2 mg/mL (variam de 0,5-2 µ l para a curva padrão, dependendo do grau de confluência das células) aos poços vazios (linhas G e H), em seguida, adicionar o reagente BCA a todos os poços.
  13. Quantificar os dados via nmol de redução WST-1 por µ g de proteína. Use 37 mM-1 cm-1 22 como o coeficiente de extinção para WST-1 reduzido a 438 nm.

2. ensaio de redução DPIP

  1. Crescem e se diferenciam células aderentes de C2C12 com o mesmo procedimento como passo 1.1.
  2. Prepare a solução DPIP de 10mm estoque como segue. Dissolver 0,029 g de DPIP (FW: 290.08 g/mol) em 10 mL de diH2Confirm O. a concentração de DPIP medindo a absorbância em 600 nm com um espectrofotômetro. Use 1 mM-1 cm-1 23 como o coeficiente de extinção para DPIP reduzido em 600 nm. Loja a 4 ° C.
  3. Adicione 0,0108 g de glicose a 11,880 mL de PBS para uma concentração final de 5 mM. Adicione 120 µ l de 10mm DPIP para uma concentração final de 100 µM.
  4. Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicione 6 µ l de diH2O e para outra alíquota adicionar 6 µ l de 2 kU/mL para uma concentração final de 2 U/mL.
  5. Ao monitorar o envolvimento de superóxido em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicionar 55 µ l de tampão de4 de KPO 0,1 M e para a outra alíquota adicionar µ l 55 de 6,5 kU/mL SOD para uma concentração final de 60 U/mL.
  6. Aspirar a mídia e lavar as células em 150 µ l de PBS. Aspire a PBS e adicionar 100 µ l de solução DPIP (-) SOD ou (-) de colunas 1-6 e adicionar 100 µ l de solução DPIP (+) SOD ou (+) de colunas 7-12 na placa de 96 poços. Usar linhas G e H vontade como controles de fundo (ou seja, para monitorar a mudança em absorvância no reagente sozinho em poços sem células).
  7. Medir a absorvância a 600 nm utilizando espectrofotômetro cada 10 min para 1 h. quantificar a mudança de absorvância em relação ao controle em semelhante etapas 1.9-1.13 60 min.

3. a determinação se os aceitadores de electrões reduzida são substratos para AO ou SOD

  1. A 5,436 mL de PBS ou HBS, adicione 240 µ l de 10mm WST-1 para uma concentração final de 400 µM e 24 µ l de 5mm PMS para uma concentração final de 20 µM.
    1. Para DPIP, adicione 60 µ l de 10mm DPIP, para uma concentração final de 100 µM, a 5,940 mL de PBS ou HBS.
  2. Adicione 100 µ l de solução para cada um bem em uma placa de 96 poços de fundo plano na ausência de células e medir a absorvância em espectrofotómetro a 438 nm, para WST-1, ou 600 nm, para DPIP.
  3. Adicione 1 µ l de ascorbato de 10mm a metade dos poços para uma concentração final de 100 μM. Monitore a absorvância até estabiliza.
  4. Após estabilização, adicionar 1 µ l de 200 U/mL para uma concentração final de 2 U/mL para cada poço ou adicionar 1 µ l de kU/6ml SOD para uma concentração final de 60 U/mL para cada bem e monitorar a absorvância por 1h.

Resultados

As estatísticas foram realizadas com ANOVA com medidas repetidas utilizando RStudio software estatístico25. Tamanhos de amostra são indicados nas lendas figura.

Para monitorar tPMET, C2C12 myotubes foram utilizados juntamente com aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP. AO foi usado para determinar qual parte do WST-1 e redução de DPIP foi devido ao efluxo de ascorbato e SOD foi usada pa...

Discussão

Apresentamos dois métodos para a utilização de aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP, em ensaios espectrofotométricos para monitorar tPMET em C2C12 myotubes. Com o crescimento de linhagens celulares em procedimentos padrão de cultura e um leitor de placa de espectrofotômetro, é possível monitorar tPMET com estes aceitadores de electrões em um ensaio de microplacas simples. WST-1 redução é reprodutível de para-bem dentro de um ensaio, mas não há variabilidade do dia a dia. O dia-a-coeficiente...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer seu apoio técnico Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de serviço de saúde pública dos Estados Unidos R15DK102122 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças do rim (NIDDK) e digestivo para Jonathan Fisher. O conteúdo do manuscrito é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDDK ou o National Institutes of Health.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

Referências

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