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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar as células imunes, incorporadas em uma matriz de colágeno (3D) tridimensionais usando microscopia de luz-folha. Este protocolo também elabora como controlar migração celular em 3D. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células na matriz 3D.

Resumo

In vivo, ativação, proliferação e função de todas as células do sistema imunológico ocorrem num ambiente tridimensional (3D), por exemplo, nos gânglios linfáticos ou tecidos. Até à data, a maioria em vitro sistemas depende de bidimensional (2D) as superfícies, tais como placas de cultura de células ou lamelas. Otimamente imitar condições fisiológicas em vitro, utilizamos uma matriz de colagénio 3D simples. Colágeno é um dos principais componentes da matriz extracelular (ECM) e tem sido amplamente utilizado para constituir as matrizes 3D. Para geração de imagens 3D, a tecnologia de microscopia de luz-folha recentemente desenvolvidos (também referida como microscopia de iluminação único plano) é caracterizada com aquisição de alta velocidade, profundidade de grande penetração, branqueamento baixa e fotocitotoxicidade. Além disso, a microscopia de luz-folha é particularmente vantajosa para medição de longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo otimizado como configurar e manipular células do sistema imunológico humanas, por exemplo, primário humanos linfócitos T citotóxicos (CTL) e na matriz de colagénio 3D para uso com a microscopia de luz-folha para a imagem latente de célula viva células assassinas naturais (NK) e amostras fixas. O procedimento de aquisição de imagem e análise de migração celular são apresentados. Especial atenção é dada para destacar os passos críticos e factores para a preparação da amostra e análise de dados. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células em uma matriz de colagénio 3D e não está limitado às células do sistema imunológico.

Introdução

Mais conhecimento sobre a migração células vem de 2D experimentos1,2,3, que normalmente são realizados em um vidro ou superfície plástica de uma cultura/imagem prato. No entanto, um cenário fisiológico requer, na maioria dos casos, um microambiente 3D, em que a matriz extracelular (ECM) desempenha um papel decisivo. ECM não só fornece a estrutura 3D essenciais para manter a morfologia celular adequada, mas também oferece sinais de sobrevivência ou pista fiável para um óptimo funcionamento de muitas células4,5 . Portanto, um ambiente 3D é necessário para melhor identificar funções celulares e comportamento em um ambiente melhor, refletindo o contexto fisiológico.

No corpo humano, a maioria das células, especialmente células imunes, exercer as suas funções sob um cenário 3D. Por exemplo, células T ativadas patrulham tecidos procura nas células-alvo, ingênuo T células migram através dos gânglios linfáticos em busca de suas células apresentadoras cognatas durante o qual o modo de migração e máquinas são adaptados para o correspondente extracelular ambiente3,6,7. O gel de colágeno 3D tem sido amplamente utilizado como um sistema celular 3D bem estabelecido e bem caracterizadas de cultura8,9,10. Nosso trabalho anterior mostra que os linfócitos humanos primários são altamente móveis e migram a uma velocidade média de cerca de 4,8 µm/min em uma matriz baseada em colágeno de 0,25%11. Rearranjo do citoesqueleto desempenha um papel fundamental na migração celular12. Acumular evidências mostra que os linfócitos não se aplicam apenas um único modo de migração, no entanto, podem alternar entre um determinado comportamento de migração, dependendo do microambiente, citocinas, localização, gradientes Quimiotáticos e extracelular sinaliza qual música o comportamento migratório em maneiras diferentes de 3.

Para confiantemente analisar funções de células imunes e comportamento, por exemplo, migração, formação de protrusão ou transporte vesicular, é de grande vantagem para ser capaz de adquirir imagens em relativamente grandes volumes 3D de forma rápida e confiável. Para geração de imagens 3D, a tecnologia de microscopia de luz-folha recentemente desenvolvidos (também referida como microscopia de iluminação único avião) oferece uma solução satisfatória13,14. Durante a aquisição de imagem, uma folha fina de luz estática é gerada para iluminar a amostra. Desta forma, sobre o plano de foco, uma grande área pode ser iluminada simultaneamente sem afetar as células do avião. Esta característica permite uma velocidade de aquisição elevado com um branqueamento e fotocitotoxicidade drasticamente reduzida. Neste artigo, descrevemos como Visualizar células do sistema imunológico humanas primárias usando microscopia de luz-folha e como analisar a migração em um cenário 3D.

Protocolo

Pesquisa realizada para este estudo com o material humano (câmaras de sistema de redução de leucócitos de doadores de sangue humano) está autorizada pelo Comitê de ética local (declaração de 16.4.2015 (84/15; Prof Dr. Rettig-Stürmer)) e segue as diretrizes correspondentes.

1. preparação da solução neutralizada de colágeno (500 µ l)

  1. Transferi 400 µ l de solução colágeno refrigerados (10,4 mg/mL) para um tubo estéril 1,5 mL sob o capô de cultura de células. Lentamente, adicione 50 µ l de refrigerados 10 x PBS (pH 7.0-7.3) a 400 µ l de solução-mãe de colágeno refrigerados. Misture a solução por telha suavemente o tubo.
    Nota: Todos os passos na parte 1 devem ser feitos sob uma capa de cultura celular.
  2. Adicione 8 µ l de 0.1 M NaOH em 500 µ l da solução de colágeno de 1.1. para ajustar o pH entre 7,2-7,6. Use tiras de teste de pH (faixa de pH: 6-10) para determinar o valor de pH da mistura.
    Nota: Os Volumes podem variar para diferentes lotes de colágeno. Solução de NaOH deve ser misturado lentamente para evitar bolhas de ar. A mistura deve ser mantida no gelo para evitar gelificação de colágeno.
  3. Adicionar 2 µ l de DDQ estéril2O tornar-se o volume final de 500 µ l. Misture bem e armazenar esta solução de colágeno (8,32 mg/mL) no gelo ou a 4 ° C até utilização posterior.
    Nota: Sob esta condição, neutralizado colágeno pode ser usado por 24 h. alíquotas não são recomendadas para evitar bolhas de ar.

2. amostra preparação para microscopia de fluorescência de luz-folha usando capilares

  1. Etiqueta fluorescente as células vivas de interesse com os corantes fluorescentes primário desejado15 ou proteínas fluorescentes11 conforme descrito anteriormente.
  2. Transferência de 1 × 106 células para um tubo estéril 1,5 mL sob uma capa de cultura celular. Centrifugar o tubo a x 200 g por 8 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 200 µ l de meio de cultura.
    Nota: Recomenda-se a densidade celular de 5 × 106 células/mL para visualização da migração de células imunes humanas, especialmente de linfócitos T citotóxicos (CTL) e células assassinas naturais (NK).
  3. Adicione 85,9 µ l da solução neutralizada colágeno 1,3. para a suspensão de células de 2.2. e misturar corretamente para chegar a uma concentração de colágeno de 2,5 mg/mL. Deixe a mistura de célula/colágeno no gelo no capô.
    Nota: Suponha que a concentração desejada de colágeno é N mg/mL, o volume de neutralizado solução de colágeno (para suspensão de células 200 µ l) = 200 × N /(8.32-N)
  4. Em seguida, coloque o êmbolo correspondente em capilar (diâmetro ~ 1 mm) até que o êmbolo 1 mm fora do capilar. Molhe o êmbolo mergulhando no meio de cultura (figura 1A).
    Nota: Este passo poderia ajudar a evitar bolhas de ar quando o capilar é mergulhado na mistura de célula/colágeno. O capilar e o êmbolo não tem que ser estéril.
  5. Mergulhe o capilar na célula/colágeno mistura de 2.3. Puxe lentamente o êmbolo volta para 10-20 mm (figura 1B). Limpe a parede exterior do capilar com uma toalha de papel umedecida com spray de etanol 70% para remover a solução restante do colágeno.
  6. Montar o capilar com argila de modelagem na parede interna de um tubo de 5 mL e empurrar o mix de célula/colágeno para a borda do capilar (Figura 1).
  7. Manter o capilar a 37 ° C com 5% de CO2 por 1h para polimerização do colágeno.
  8. Adicione o meio de cultura (cerca de 1-2 mL) para um tubo de 5 mL. Empurre com cuidado a haste de colágeno polimerizado para fora no meio de cerca de 3/4 do colágeno pendurado no meio (Figura 1).
  9. Manter o capilar, assim, a 37 ° C com 5% de CO2 por mais 30 min equilibrar a haste de colágeno com o meio.
    Nota: Depois disso, a haste de colágeno pode ser puxada para trás no capilar e culta mais antes de nova utilização.

3. imagem aquisição usando microscopia de luz-folha

  1. Montagem da câmara de amostra de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Ligue a incubação e o microscópio para aquecer a câmara de amostra a 37 ° C (para célula viva de imagens apenas).
  3. Colocar o capilar na câmara de amostra e localize a amostra para encontrar a área de interesse para aquisição de imagens.
  4. Ative o correspondente laser(s). Defina as seguintes configurações: poder, tempo de exposição, passo-tamanho da posição z-pilha, o começo e o fim da z-pilha e o intervalo de tempo para a imagem latente de célula viva de laser.
    Nota: por exemplo, o exemplo na Figura 2 foi fotografado cada 40 s para 6 h a 37 ° C, com um tamanho de passo de 1 µm (total espessura: 538 µm). A potência do laser foi 1% com um tempo de exposição de 30 ms. O tamanho do pixel na direção de x-y é 0,23 µm.
  5. Inicie a aquisição de imagem.

4. automatizado de análise de rastreamento

  1. Abra o conversor de arquivo, clique em Add Files para escolher o arquivo de imagem (s) a ser convertido para o formato de arquivo de software (*.ims). Clique em procurar e selecione uma pasta para salvar o arquivo convertido (s). Clique em Iniciar todos.
  2. Abra o software de análise. Clique em superar. Vá ao menu arquivo e clique Opene, em seguida, escolher o arquivo de imagem para ser analisado.
    Nota: Se o tamanho do arquivo é grande esta etapa pode levar tempo. Arquivos maiores do que 1 Terabyte (TB) não são recomendados para uma única experiência como o processo são de tais arquivos de grandes capacidade computacional altamente exigente.
  3. Clique em Adicionar novos Spots. Marque a caixa de Processo toda imagem finalmente. Clique em seguinte.
  4. Digite as coordenadas x e y (em pixel) para definir a região de interesse. Digite o número de quadros (z-posição e tempo) para analisar. Clique em seguinte.
  5. Seleccione o canal de destino, que contém os objetos a serem controladas, na lista suspensa de Canal de origem. Entra estimado xy diâmetro (µm). Clique em seguinte.
    Nota: O diâmetro estimado xy é o diâmetro médio na dimensão x-y de objetos a serem controladas.
  6. Clique em qualidade. Defina um limite, em que a maioria das células (objetos) deve ser incluída. Clique em seguinte.
  7. Escolha o algoritmo desejado (Autoregressive movimento é recomendado). Insira a distância máxima (recomenda-se20 µm ) e o tamanho máximo de abertura (3 ou 2 é recomendado). Clique em todo o processo de imagem finalmente.
    Nota: Max distância e tamanho de abertura Max são dois limiares para quebrar faixas. Mais especificamente, em dois quadros contínuos quando a distância entre o objeto mesmo excede a distância de Max, este objeto no quadro posterior será considerado como um novo objeto. Às vezes durante a aquisição, o mesmo objeto pode desaparecer por alguns quadros e aparece outra vez. Neste caso, somente quando este objeto reaparece dentro o tamanho máximo de lacuna, será considerado como o mesmo objeto.
  8. Clique em Tipo de filtro e escolha a opção Excluir faixas indesejadas.
    Nota: Este passo é opcional.
  9. Clique em seguinte e clique em terminar.
    Nota: Este passo pode demorar horas até dias, dependendo do desempenho computacional.
  10. Clique em Editar faixas e escolha Correta de Drift. Selecione o algoritmo apropriado (Drift translacional é recomendado). Selecione o desejado Resultado Dataset tamanho (Novo tamanho igual ao tamanho atual é recomendado). Clique Okey.
    Nota: Esta etapa só é necessária quando o colágeno à deriva durante a aquisição de imagens.
  11. Clique em estatísticas e escolha Configurar lista de estatísticas valores visíveis. Verifique as opções de interesse para ser exportado (por exemplo, coordenadas, velocidade e assim por diante). Clique Okey.
  12. Clique em Exportar todas as estatísticas de arquivo e digite o nome do arquivo.

5. fixação e imunofluorescência coloração de células em matrizes de colágeno

  1. Transferi 1.000 µ l de paraformaldeído 4% (PFA, em PBS) para um tubo de 5 mL sob uma capa de química.
    Nota: PFA deve ser equilibrado à temperatura ambiente.
  2. Mergulhe o capilar com colágeno polimerizado de 2,9. em solução PFA (por ~ 5 mm) e montar o capilar na parede interna do tubo 5 mL com argila de modelagem (como mostrado na Figura 1).
  3. Pressione o êmbolo cuidadosamente até metade da haste de colágeno está pendurado na solução de PFA (Figura 1). Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 20 min.
  4. Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Retire o capilar e descartar PFA.
  5. Montar o capilar em um tubo de fresco e adicione 1 mL de PBS. Certifique-se de que o capilar é imerso na PBS.
  6. Pressione o êmbolo cuidadosamente até metade da haste de colágeno está pendurado na solução. Monte o capilar na parede interna com argila de modelagem.
  7. Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 5 min.
  8. Repita 5.4. -5,7 por outro 2 vezes.
  9. Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Descarte a PBS. Transferir 1-2 mL de tampão de bloqueio/permeabilização (PBS + 1% de BSA + 0,1% de tensoativo não-iônico) no tubo e repetir 5.6.
    Nota: A BSA (1%) pode ser substituída por 5% de soro do animal em que o secundário Ab foi criado.
  10. Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 30-60 min.
  11. Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Descarte o buffer de permeabilização. Transferência de 200-500 µ l do anticorpo primário no buffer de bloqueio/permeabilizacao e expele a vara na solução.
  12. Mantenha o tubo à temperatura ambiente durante 1 h.
  13. Lave a haste de colágeno 3 vezes com PBST (PBS + - 0,1% de surfactante não-iônico) conforme descrito no ponto 5.4. -5.8.
  14. Incube a haste no anticorpo secundário no buffer de bloqueio/permeabilização por 1h à temperatura ambiente. Mantê-lo de luz.
  15. Lave a haste de colágeno 3 vezes com PBS, conforme descrito no ponto 5.4. -5.8.
  16. Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Mantenha as amostras em PBS até imagens.
  17. Analisar as amostras conforme descrito em 3.

Resultados

Formação de protrusão durante a migração de células T é um processo altamente dinâmico, que é dependente de actina. Para visualizar a formação de protrusão de CTL humana primária, nós transfectadas transitoriamente uma proteína mEGFP fundido para rotular o citoesqueleto de actina no CTL conforme descrito antes das11. Um dia depois de transfeccao, as células foram incorporadas na matriz de colágeno. Pilhas de imagem foram adquiridas todos os 40 s co...

Discussão

A maioria em vitro ensaios é realizada em uma superfície 2D, por exemplo em placas de cultura de células, pratos de Petri ou em lamelas, Considerando que na vivo as células, especialmente células imunitárias, principalmente um microambiente 3D a experiência. Emergentes a evidência mostra que os padrões de migração das células imunitárias diferem entre 2D e 3D de cenários17. Além disso, os perfis de expressão de células tumorais também são diferentes em 2D e 3D-...

Divulgações

Os autores não declaram nenhum conflito de interesses financeiro ou comercial.

Agradecimentos

Agradecemos o Instituto de Hemostaseology clínica e medicina transfusional para o fornecimento de sangue de doadores; Carmen Hässig e Cora Hoxha para ajuda técnica excelente. Agradecemos a Jens Rettig (Universidade de Saarland) para o vetor modificado pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Universidade de Muenster) para a construção de LifeAct-Ruby original e Christian Junker (Universidade de Saarland) para gerar a construção de LifeAct-mEGFP. Este projecto foi financiado pelo Sonderforschungsbereich 1027 (projeto A2 para B.Q.) e 894 (projeto A1 para MH). O microscópio de luz-folha foi financiado pelo DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol, bovine collagen solutionAdvanced Biomatrix #5133-20MLCollagen matrix
0.5 M NaOH SolutionMerck1091381000for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agaroseAffymetrix32821-10GMSample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells KitThermo Fisher11348DIsolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher11132DActivation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2Thermo FisherPHC0023Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kitLonzaV4XP-30XXTransfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Orange Plasma membrane StainThermo FisherC10045Fluorescent cell label
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered salineThermo Fisher14190250IF
Bovine serum albuminSigmaA9418-100GIF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbitThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)ZeissN.A.
Cell culture hoodThermo FisherHeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i Thermo FisherN.A.
Centrifuge 5418 and 5452EppendorfN.A.
PippettesEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tipsVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubesSarstedt 62.554.002
Capillaries 50 µLVWR (Brand)613-3373Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillariesVWR (Brand)BRND701934"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stipsMerck1095430001to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringesBDZ230723 ALDRICHAlternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Imaris file converterBitplaneavailable at http://www.bitplane.com Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplaneavailable at http://www.bitplane.com Analysis of 3D and 4D imaging data

Referências

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