Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

Resumo

Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.

Resumo

A barreira hemato - encefálica (BBB) é um tecido dinâmico barreira que responde a vários estímulos fisiopatológicos e farmacológicos. Tais alterações resultantes destes estímulos podem grandemente modulam a entrega da droga para o cérebro e, por extensão, causam consideráveis desafios no tratamento do sistema nervoso central (CNS) doenças. Muitas mudanças BBB que afetam a farmacoterapia, envolvem as proteínas que são localizadas e expresso a nível das células endoteliais. Com efeito, tal conhecimento sobre fisiologia do BBB na saúde e na doença gerou considerável interesse no estudo destas proteínas de membrana. Do ponto de vista de pesquisa de ciência básica, isto implica uma exigência para um método simples mas robusto e reprodutível para isolamento de microvessels de tecido cerebral, colhido em animais experimentais. Para preparar amostras de membrana de microvessels recentemente isolada, é essencial que os preparativos da amostra ser enriquecidos em células endoteliais mas limitados na presença de outros tipos de células da unidade neurovascular (i.e., astrócitos, micróglia, neurônios, pericitos). Um benefício adicional é a capacidade para preparar amostras de animais individuais, a fim de capturar a verdadeira variabilidade da expressão da proteína em uma população experimental. Neste manuscrito, detalhes a respeito de um método que é utilizado para isolamento de microvessels de cérebro de rato e preparação de amostras de membrana são fornecidos. Enriquecimento de Microvessel, de amostras derivadas, é conseguido usando quatro etapas de centrifugação onde dextrano é incluído no buffer de amostra. Este protocolo pode facilmente ser adaptado por outros laboratórios para suas próprias aplicações específicas. Amostras geradas a partir deste protocolo foram mostradas para produzir robustos dados experimentais de experimentos de análise de proteína que podem ajudar muito a compreensão das respostas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos.

Introdução

A barreira hemato - encefálica (BBB) existe na interface entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulação sistêmica e desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase do cérebro. Especificamente, as funções BBB para precisamente controle soluto concentrações no fluido extracelular de cérebro e eficientemente fornecer os nutrientes necessários para atender as demandas metabólicas consideráveis do CNS¹pelo tecido cerebral. Essas funções implicam que o BBB, que existe principalmente no nível da célula endotelial microvascular, deve possuir mecanismos discretos que permitem que algumas substâncias acessar o parênquima cerebral, garantindo simultaneamente que xenobióticos potencialmente prejudiciais não pode se acumulam. Com efeito, as células endoteliais microvascular do cérebro não são fenestradas e exibem pinocitose limitado, que garante uma falta de permeabilidade não-seletivo². Além disso, as células endoteliais do cérebro microvessel expressam apertado junção aderente junção proteínas e que agem para formar um físico "selar" entre células endoteliais adjacentes e restringir consideravelmente paracellular difusão de substâncias pelo sangue para o cérebro parênquima. Com efeito, permeabilidade seletiva de substâncias endógenas e exógenas requer expressão funcional de captação e efluxo de transportadores³. Globalmente, apertados cruzamentos, entroncamentos adherens e transportadores trabalham em conjunto para manter as propriedades de barreira exclusivo do BBB.

O BBB é uma barreira dinâmica que responde a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos. Por exemplo, estresse de hipóxia/reoxigenação foi mostrado para modular a expressão de proteínas críticas junção apertada (i.e., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), que está associado com aumento paracellular permeabilidade para marcadores vasculares tais como sacarose^4,5,6. Observações semelhantes foram feitas no BBB no cenário do de lesão cerebral traumática⁷ e dor inflamatória periférica^8,9. Essas mesmas doenças também podem modular os mecanismos de transporte para o BBB^{10,11,12,13,14}. De fato, lesão hipóxia/reoxigenação aumenta a expressão funcional de ânion orgânico transportando polipeptídeo 1a4 (Oatp1a4) no BBB, que pode levar a aumentos significativos no transporte de sangue-cérebro de substratos de transporte Oatp específicos tais como taurocholate e atorvastatina¹³. Propriedades BBB também podem ser alteradas por farmacoterapia em si, um mecanismo que pode servir de base para as duas mudanças profundas na eficácia da droga no cérebro e para interações medicamentosas. Por exemplo, paracetamol alvos receptor nuclear mecanismos de sinalização nas células endoteliais microvascular cerebral, aumenta a expressão funcional do transportador efluxo crítico P-glicoproteína (P-gp) e modifica a analgesia dependente do tempo conferidos pela morfina, uma droga analgésica opioide e P-gp estabelecida transportam substrato¹⁵. Uma compreensão completa das alterações BBB, que pode ser induzida por doenças ou drogas, também requer a identificação e caracterização de mecanismos regulamentares específicos que controlam estas modificações. Com efeito, as vias de sinalização discretas foram identificadas nas células endoteliais microvascular do cérebro que controlam a expressão molecular de junção apertada proteínas^16,17 e transportadores^{15, 18,19}. Tomados em conjunto, estas observações indicam que vias moleculares complexas estão envolvidas na regulação de junções apertadas de BBB e transportadores na saúde e na doença.

Um desafio significativo no estudo do BBB é a exigência absoluta de um método simples e eficaz para isolamento de microvessels de derivados de animais experimentais e posterior preparação de amostras de membrana de tecido cerebral. Estas amostras devem estar preparadas para que eles são ambos enriquecidos em células endoteliais microvascular do cérebro e limitados na presença de outros tipos de células. Ao longo dos últimos anos, várias metodologias para isolamento da microvasculatura do cérebro de roedor têm sido relatadas na literatura científica^13,20,21,22. Este artigo descreve um simples, robusto e o método reprodutível para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para preparação das amostras endoteliais de membrana-enriquecido que pode ser usado para a análise da expressão da proteína. Uma vantagem deste protocolo de isolamento de microvessel é a capacidade de obter preparações de amostras de alta qualidade e com rendimento de proteína suficiente de um animal experimental individual. Isto permite a consideração de animal para animal variabilidade na expressão da proteína. Tal adiantamento neste protocolo melhorou extremamente a robustez dos estudos do BBB porque sobreavaliação (ou Under estimativa) a verdadeira amplitude das alterações de proteína no BBB agora pode ser evitada. Além disso, a inclusão de várias etapas de centrifugação com dextran permite melhor enriquecimento de microvessels em amostras experimentais facilitando a remoção dos constituintes celulares indesejados como os neurônios.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados por um cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) e estar de acordo com o National Institutes of Health (NIH) e pesquisa Animal: Reporting In Vivo experimentos (chegada) orientações. O fluxo processual para o protocolo é descrito na Figura 1.

1. set-up para o procedimento

1. Prepare o buffer de microvessel do cérebro (BMB). Comece por pesagem 54,66 g D-manitol, 1,90 g EGTA e base de 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (ou seja, Tris) 1,46 g para um copo limpo. Adicione 1,0 L de água desionizada. Misture os componentes da reserva BMB utilizando um agitador magnético. Uma vez que a solução tem sido muito bem misturada, ajuste o pH para 7,4 usando 1,0 M de HCl.
2. Prepare a solução de dextran (75.000 MW) de 26% (p/v) antes de anestesiar animais. Prepare a solução de dextran conforme descrito nas etapas a seguir.
   Nota: É criticamente importante preparar esta solução antes do tempo porque dextrano pode levar cerca de 1,5 a 2 h para dissolver em tampão aquosa.
   1. Pese o dextran em pó (26 g por 100 mL de tampão) em um copo limpo.
   2. Meça o volume apropriado de BMB e diluir em um copo separado, limpo.
   3. Lentamente despeje o copo contendo o pó dextrano BMB. Misture manualmente o dextran em pó durante o derramamento de BMB usando uma vareta de vidro celeuma.
   4. Ajuste o pH para 7,4 com 1,0 HCl M imediatamente antes de usar.
      Nota: Um isolamento típico do cérebro microvessels de 12 ratos de Sprague-Dawley individuais (masculino ou feminino; 3 meses de idade; 200-250 g cada) requer 200 mL da solução de dextran (i.e., dextrano 52 g em 200 mL de BMB).

2. extração de tecido cerebral de ratos Sprague Dawley

1. Desejado no tratamento experimental, anestesiamos ratos Sprague-Dawley usando cetamina (50mg/kg; i.p. 2,5 mL/kg) e xilazina (10mg/mL; 2,5 mL/kg eu, p.). Dilua a ketamina e xilazina em soro fisiológico a 0,9% para concentrações finais de 20 mg/mL e 4,0 mg/mL, respectivamente. Eutanásia em animais por decapitação usando uma guilhotina afiada em conformidade com as diretrizes IACUC. Use o mesmo procedimento para masculinos e femininos ratos Sprague-Dawley.
2. Ressecar a pele do crânio do rato, fazendo um único corte transversal com uma tesoura cirúrgica.
3. Usando ruginas, Retire cuidadosamente a placa de crânio e expor o cérebro.
4. Remova o cérebro com uma espátula. Desanexe o encéfalo e coloque o tecido cerebral isolada em um tubo cónico de 50 mL contendo 5 mL de BMB. Adicione 1,0 μL de cocktail por 1,0 mL de tampão BMB imediatamente antes da utilização do inibidor da protease.

3. cérebro processamento

1. Transferi o tecido cerebral do tubo cónico de 50 mL para um tubo de ensaio limpo.
2. Usando fórceps, Rode suavemente o cérebro 12,5 cm de diâmetro, papel de filtro para remover o exteriores meninges, que são vagamente aderiu ao córtex cerebral. Delicadamente pressione o tecido cerebral contra o papel de filtro e rolar o tecido novo. Vire o papel de filtro com frequência durante esta etapa.
3. Separe os hemisférios cerebrais usando fórceps do plexo coroide.
   Nota: O plexo coroide aparece como um tecido claro membranoso localizado na superfície dos ventrículos cerebrais.
4. Delicadamente, achatar o tecido cerebral e remover restantes meninges e bulbos olfatórios usando fórceps.
5. Coloque o tecido cortical cerebral em um almofariz de vidro refrigerados. Adicione 5,0 mL de cocktail contendo inibidor da protease BMB a argamassa.
6. Usando um homogenizador eléctricas aéreas, homogeneizar o tecido cerebral usando 15 subindo e descendo traçados a 3.700 rpm. Realize a homogeneização usando um moedor de tecido de 10 mL almofariz e pilão. Entre a homogeneização de cada amostra individual, limpe o pilão usando etanol a 70%.
   Nota: Homogeneização traços devem ser consistentes em termos de ritmo e magnitude.
7. Despeje o homogeneizado em tubos de centrífuga rotulada.

4. centrifugação passos

1. Adicione 8,0 mL da solução de dextran de 26% para cada tubo de centrifugação rotulado que contém o cérebro homogeneizado.
2. Inverter o tubo duas vezes e então cuidadosamente a amostra de vórtice. Realizar a utilização do Vortex de cada amostra usando vários ângulos para assegurar uma mistura completa da solução de homogeneizado de cérebro com solução de dextran de 26%.
3. Centrifugar as amostras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
   Nota: Para algumas análises, é útil comparar o cérebro microvessels com parênquima cerebral. Deve ser a avaliação da expressão da proteína em células de parênquima cerebral necessária, o sobrenadante desta etapa de centrifugação (ou seja, cérebro parenquimatosa fração) pode ser recolhido e armazenado a-80 ° C para uso futuro.
4. Remover o sobrenadante usando um aspirador a vácuo e pipetas de vidro.
   Nota: O cuidado deve ser tomado para não perturbar a pelota. Caso contrário, a quantidade do cérebro microvessels coletados será reduzida, que diminuirá significativamente o rendimento de proteína deste procedimento.
5. Resuspenda o pellet em 5,0 mL de BMB contendo inibidor da protease cocktail (ou seja, 1,0 μL inibidor da protease cocktail por 1,0 mL de tampão BMB). A pelota para assegurar uma mistura completa de vórtice.
6. Adicione 8,0 mL de dextrano de 26% para cada tubo de centrifugação e vórtice, conforme descrito nas etapas 4.1-4.2 do presente protocolo.
7. Centrifugar as amostras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
8. Usando um balão de vácuo e pipeta de vidro, aspirar o sobrenadante e garantir aquela pelota contendo microvessel do cérebro não é interrompida.
   Nota: Excesso material que está aderido à parede do tubo não contém microvessels e deve ser cuidadosamente limpos e removido.
9. Repita as etapas 4.5 a 4.8 um adicional duas vezes.
10. Uma vez 4 dextrano centrifugação as etapas foram concluídas, adicionar 5,0 mL de BMB cada pellet e vórtice para Ressuspender a amostra.
    Nota: Após a conclusão da etapa 4.10, toda microvessels podem ser coletados para a análise da localização da proteína. Isso pode ser feito tomando um 50 μL alíquota de pelota microvessel re-suspensas e manchas em um vidro de microscópio. Microvessels são, então, calor-corrigido a 95 ° C por 10 min em um bloco de aquecimento seguido de fixação em etanol gelado para um adicional de 10 min. de Slides podem ser armazenados a 4 ° C até necessária para estudos de imagem.

5. ultracentrifugação para preparar amostras de cérebro Total Microvascular membranas

1. Transferi as amostras para o homogeneizador copo gelado...
2. Usando um homogenizador eléctricas aéreas, homogeneizar o tecido cerebral usando 8-10 e descer traçados a 3.000 rpm. Homogeneização é realizada usando um moedor de tecido de 10 mL almofariz e pilão. Limpe o pilão usando etanol a 70% após a homogeneização de cada amostra individual.
3. Transferi as amostras para limpar os tubos se. Número e pesar cada tubo individual. Equilíbrio e emparelhar os tubos previamente ao seu embarque para o rotor se.
   Nota: Todos os pesando emparelhamento dos tubos se devem proceder e com as tampas para garantir uma medição precisa de pesos de tubo.
4. Centrifugar as amostras a 150.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
5. Usando um balão de vácuo e vidro pipeta Pasteur, aspirar o sobrenadante usando o cuidado para não perturbar a pelota de membrana capilar.
6. Baseado no tamanho da pelota, adicione um volume adequado de buffer de armazenamento, que é composta de água desionizada e BMB na proporção de 1:1 (v/v). Normalmente, as pelotas são resuspended em 400-500 μL de tampão de armazenamento. Adicione o cocktail de inibidor de protease para o buffer de armazenamento na proporção de 1,0 μL por 1,0 mL de buffer de armazenamento.
7. Amostras de vórtice para resuspenda o pellet em buffer de armazenamento.
8. Usando um pipeta Pasteur de vidro, transferi amostras de membrana capilar para um tubo de microcentrifugadora rotulado de 1,5 mL.
9. Amostra de passagem através de uma agulha seringa 5 x para garantir que a amostra fique bem misturada e que não agregados celulares existem.
10. Armazenar as amostras a-80 ° C até necessária para análise.
    Nota: O conteúdo de proteína de cada amostra de membrana microvessel é medido usando o método de Bradford.

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Resultados

O fluxo experimental para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana de microvessel é mostrado na Figura 1. Usando o procedimento aqui apresentado, é demonstrado sucesso isolamento de microvessels intacto de cérebro de rato (Figura 2A). Estes navios foram obtidos após a conclusão de centrifugação com dextran e imediatamente antes de iniciar a ultracentrifugação para prepa...

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Discussão

Neste artigo, é descrito um método simples e eficaz de preparação de amostras de proteínas de membrana de microvessels recentemente isolada do tecido de cérebro de rato. Várias abordagens para isolamento de microvessels de cérebro de rato e/ou geração de preparações de membrana da microvasculatura isolada têm sido relatadas na literatura^{13,20,21,22 , 24...}

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340	Component of brain microvessel buffer
D-mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Component of brain microvessel buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Component of brain microvessel buffer
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	General anesthetic
Xylazine	Western Medical Supply	#5530	General anesthetic
0.9% saline solution	Western Medical Supply	N/A	General anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter)	VWR	#28320-100	Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge Tubes	Sarstedt	#60.540.386	Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder	DWK Life Sciences	#358039	Required for homogenization of samples
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	#H1758	Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher Scientific	#23210	Protein standard for Bradford Assay
Standard Forceps	Fine Science Tools	#91100-12	Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	#352070	Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur Pipets	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Used for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrous	Sigma-Aldrich	#459836	Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	#41121703	Used for ultracentrifugation of samples