Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Resumo

Este trabalho fornece um método para a fabricação de plataformas baseadas em gotículas microfluidic e a aplicação de microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. O método de PCR-microesfera torna possível obter single-stranded DNA amplicons sem separar o DNA de cadeia dupla.

Resumo

Baseado em gotículas microfluídica permite a produção confiável de microesferas homogêneas no canal microfluídicos, fornecendo controlado tamanho e morfologia da microesfera obtida. Uma microesfera copolymerized com uma sonda de acrydite-DNA foi fabricada com sucesso. Diferentes métodos como PCR, digestão do exonuclease e isolamento em grânulos magnéticos streptavidin-revestido assimétrica podem ser usados para sintetizar o DNA de cadeia simples (ssDNA). No entanto, estes métodos eficientemente não utilizam grandes quantidades de ssDNA altamente purificado. Aqui, descrevemos um protocolo de microesfera-PCR detalhando como ssDNA pode ser eficientemente amplificado e separado do dsDNA simplesmente por pipetagem de um tubo de reação de PCR. A amplificação do ssDNA pode ser aplicada como reagentes potenciais para a DNA microarray e processos de DNA-SELEX (evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial).

Introdução

Single-stranded DNA (ssDNA) tem sido amplamente considerado como um elemento de reconhecimento molecular (ERM) devido a suas propriedades intrínsecas para hibridação de DNA-DNA^1,2. O desenvolvimento de sistemas sintéticos ssDNA pode levar a aplicações biológicas, tais como o DNA microarrays³, oligotherapeutics, diagnóstico e detecção molecular integrada com base em interações complementares^4,5.

Até à data, as partículas de polímero do micrômetro-escala tem sido com sucesso demonstradas usando dispositivos microfluídicos. Várias técnicas de microfluidic tem sido provadas para ser poderoso para produzir altamente homogêneas microesferas em fluxo contínuo no ambiente microchannel^6,7.

No estudo de Lee et al . ⁸, uma plataforma baseada em gotículas microfluidic para a síntese de microfluidic de amplificação oligo-microesfera e ssDNA copolymerizable foi relatado. A plataforma microfluidic consiste de duas camadas PDMS (polidimetilsiloxano): uma parte superior com uma rede de canais microfluídicos para gerar microesfera e um parte plana de fundo. Estes consistem de três tipos de canais fluídico PDMS: 1) um fluxo de focagem canal para geração de gotículas, 2) é um canal de serpentino para misturar as duas soluções e 3) um canal de polimerização sequencial para solidificação de microesfera. Uma vez que dois fluxos imiscíveis são introduzidos em um único canal PDMS fluídico, os fluxos podem ser forçados através da estrutura de orifício estreito. Os comportamentos de fluxo como geometria do canal, taxa de fluxo e viscosidade afetam o tamanho e morfologia da microesfera. Portanto, o principal fluxo de líquido pode ser dividido em microescala monospheres^9,10.

Aqui, um protocolo detalhado microesfera-PCR é fornecido para a amplificação do ssDNA. Em primeiro lugar, um processo de design do dispositivo baseado em gotículas microfluidic é descrito. Então, a maneira na qual poliacrilamida microesferas podem ser acrescidas com modelo de DNA aleatório de modo complementar, é explicada. Finalmente, um protocolo de microesfera-PCR para amplificação ssDNA é mostrado.

Protocolo

1. fabricação de uma plataforma de Microfluidic PDMS

1. Prepare-se 20 mL de líquido pré-polímero PDMS pela mistura de polímero base e catalisador em uma relação de volume de 10:1. Despeje 10 mL do líquido PDMS em um molde de SU-8 preparado em uma bolacha de silício para a parte superior da rede microfluidic. Para a parte inferior plana, despeje o mesmo volume de líquido PDMS na bolacha de silicone sem uma estrutura de molde.
   Nota: A rede microfluídicos é projetada em um programa de CAD e então convertida em uma Fotomáscara para fabricar um mestre usando o processo de fotolitografia típico (veja as Figuras suplementar). Este mestre é composto do molde negativo fotorresiste SU-8 sobre a bolacha de silício¹¹.
2. Coloque dois wafers de silício revestidos com líquido pré-polímero PDMS na chapa quente e cura a 75 ° C por 30 min.
   1. Manualmente, retire a camada PDMS curada do molde SU-8. Alinhe um 1,5 mm de diâmetro redondo buraco ferramenta de perfuração para o porto de óleo na rede microfluidic replicada para interfaceamento canais de fluxo mícron-escala com as amostras de fluido de macro. Um soco do através de-furo manualmente.
   2. Repeti este processo três vezes para a formação de duas soluções e a abertura de saída de perfuração.
3. Realizar o tratamento de superfície hidrofílico no superior e camadas PDMS de fundo usando um Hand-Held corona tratador¹² durante vários segundos por exemplo.
   1. Pilha de dois tratados com plasma camadas PDMS e calor a 90 ° C por 30 minutos usando uma chapa quente para o processo de ligação de PDMS-para-PDMS. Fornecer a água pressurizada usando a bomba de seringa nas três portas de entrada para a colagem estrutural e teste de vazamento do dispositivo fabricado.

2. produção de poliacrilamida Oligo-microesferas

1. Prepare o grânulo-mistura detalhada na tabela 1.
2. Vórtice e brevemente centrifugar o acrydite ssDNA padrão rotulado sonda (Ap, 100 μM) e acrylamide:bis (19:1) solução.
3. Preparar a solução eu misturando 25 μL de 40% do acrilamido bis solução, 10 μL de ssDNA (sonda de acrydite), 10 μL de tampão de x TBE 5 (1,1 M Tris borato de 900 mM; 25 mM EDTA) e 5 μL de água. Prepare a solução II com 50 μL de persulfato de amónio de 20%.
4. Preparar duas seringas individualmente preenchido com solução eu e a solução II e montá-los para a bomba de introduzir a plataforma microfluidic fluxos de solução. Preparar o óleo mineral misturado com 0,4% TEMED para solidificação da superfície da microesfera.
   Nota: TEMED é conhecido como um estabilizador de radicais livres. Os radicais livres pode acelerar a taxa de formação do polímero com persulfato de amónio (APS) a fim de catalisar a polimerização da acrilamida.
5. Encha a garrafa de vidro com 4 mL de óleo mineral para gerar um fluxo contínuo.
6. Inserir dois tubos para duas portas na tampa da garrafa de vidro como um reservatório de microfluidic: porta pneumática para aplicação de ar comprimido para o frasco de vidro para o compressor de ar e o porto de fluido para o fornecimento de óleo pressurizado para a rede de micro canal a garrafa de vidro. Conecte os tubos entre o frasco de vidro e o porto de óleo no dispositivo microfluidic.
   1. Conecte os tubos para as portas de duas solução no dispositivo microfluidic para suprir as duas soluções de bombas de seringa. Inserir os tubos à porta de saída a fim de transferir a microesfera gerada para o copo.
7. Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,4 - pressão de ar comprimido de ajuste de 0,7 mL/h. o compressor usando um regulador (82-116 kPa). Defina a velocidade de rotação (500 rpm) da barra de agitador magnético no copo de vidro em uma chapa quente. Acione a bomba de seringa e fornecer o ar comprimido gerado por um compressor externo para o frasco de vidro usando o controle ON/OFF de uma válvula eletromagnética¹³.
8. Observe a formação de microesferas na geometria de fluxo-foco e solidificação de microesferas geradas no copo de vidro com um microscópio digital.
   Nota: A velocidade de produção e tamanho da microesfera dependem do caudal de soluções e a pressão aplicada para o fluxo de óleo mineral (tabela 2).

3. realização de poliacrilamida Oligo-microesferas conta

1. Para quantificação de hemocytometer, tomar uma pequena quantidade (aproximadamente 100 μL) de solução aquosa de poliacrilamida oligo-microesferas e coloque sobre o vidro hemocytometer e preencher suavemente a microesfera suspensão até o poço da câmara de contagem.
   Nota: Para obter mais detalhes, consulte http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Use um microscópio e mão contador de contagem para contar microesferas em um conjunto de 16 quadrados. Em seguida, mover a hemocytometer para o próximo conjunto de câmara e continue contando até que todos os quatro conjuntos de 16 cantos são contados.
3. Determinar a contagem média microesfera e calcular o número de microesferas a suspensão original do grânulo.
4. Transferi 100 μL de microesferas para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Remova o sobrenadante com centrifugação (400 x g) suave e pipetagem.

4. realização de hibridização de DNA na superfície do Polyacrylamide Oligomicrosphere

Nota: Uma idêntico DNA sonda com uma 5'-NH₂-grupo em vez de 5'-acrytide modificação é adicionado na solução e testado para Ap-contendo microesferas em paralelo. Hibridização de DNA é mostradas na Figura 2. A solução de sondas (cAp) de Cy3-rotulado complementares do oligonucleotide deve ser colocada em um quarto escuro.

1. Resuspenda Cy3-cAp usando 100 μL de tampão de 1xTE (tampão TE: 10 mM Tris e 1μM EDTA, pH 8.0) para atingir uma concentração final de 100 μM. Por exemplo, resuspenda 1 pmol de cAp em 100 mL de tampão TE e transferir para um tubo de microcentrifugadora coberto com papel alumínio.
   Nota: Para sequências de vertente, consulte a tabela 3.
2. Adicione 100 μM de Cy3-cAp para um tubo de microcentrifugadora estéril de 1,5 mL contendo microesferas de Ap-copolymerized.
3. Bater os tubos algumas vezes para misturar e incubar a temperatura ambiente no escuro durante 1 h.
4. Desprezar o sobrenadante e remover o buffer residual através de pipetagem.
5. Lavar três vezes com 500 μL de tampão TE.
6. Resuspenda microesferas tocando suavemente o tubo de microcentrifugadora. Em seguida, repita a etapa 4.4.
7. Coloque microesferas sobre a lâmina de vidro (75 x 50 mm) e cubra com folha de alumínio antes da imagem latente.

5. assimétrica PCR para amplificação ssDNA

1. Prepare uma mistura de reagente PCR assimétrica para amplificar ssDNA para ser analisado. Descongele os reagentes no quadro 4 no gelo. Não mantenha a enzima de Taq polimerase (50 U / µ l) no gelo, mas prefiro guardá-la a-20 ° C até ser necessário.
2. Vórtice delicadamente todos os reagentes e brevemente centrifugar tubos a 10.000 x g por 10 s.
3. Combine todos os reagentes como descrito no tabela 4.
4. Colocar as amostras em um thermocycler e começar o PCR assimétrico nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, segure a 4 ° C.

6. micro-PCR para a amplificação ssDNA

Nota: Esta seção descreve o protocolo para amplificar ssDNA em um tubo de reação de PCR. Reações de microesfera-PCR foram realizadas em 50 μL de volume de reação. As sequências detalhadas usadas para amplificar ssDNA estão listadas na tabela 5. Neste caso, Ap na superfície das microesferas pode anneal para modelos aleatórios de DNA de forma complementar. Este é um passo muito importante para a produção de DNA complementar (cadeia de DNA antisentida, Figura 3). O DNA estendido é usado como um modelo para amplificação por PCR-microesfera.

1. Prepare a mistura de reagente microesfera-PCR. Descongele os reagentes na tabela 6 no gelo; no entanto, não mantenha a enzima de Taq polimerase no gelo. Armazená-lo a-20 ° C até ser necessário.
2. Vórtice delicadamente todos os reagentes e brevemente centrifugar tubos a 10.000 x g por 10 s.
3. Obter cerca de 25 ~ microesferas através de contagem microscópica.
   Nota: O número de microesferas no tubo de uma reação é calculado utilizando um microscópio com ampliação de 40 X. Cerca de 25 ~ microesferas são utilizadas para amplificação por PCR-microesfera. Informações mais detalhadas é na etapa 3.
4. Combine todos os reagentes como descrito no tabela 6.
5. Colocar as amostras em um thermocycler e começar o PCR assimétrico nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, segure a 4 ° C.
6. Amplificação de seguir, adicionar 8 μL de 6 x tampão de carregamento e carregar 15 μL de cada amostra em gel de agarose 2%. Em seguida, executar eletroforese a 100 V por 35 min em 1 x TAE (Tris-Acetato-EDTA, 40 mM Tris Acetato, EDTA 1 mM, pH 8,2) reserva.

7. confocal microscopia aquisição

Nota: Os resultados da hibridização da sonda de microesfera-DNA são imagens de um microscópio confocal. Análise de imagem é executada usando o ImageJ.

1. Corrigi hibridizadas microesferas para o palco do microscópio em um suporte.
2. Selecione o laser (laser de hélio/Neon, linha de 543 nm) e ligá-lo no controle do laser.
3. Selecione a lente objetiva no controle do microscópio.
4. Selecione o filtro desejado para Cy3 e canal de controle de configuração.
5. Começar o experimento e observar a amostra. Configurações para o microscópio confocal estão resumidas na tabela 7.

Resultados

A plataforma fabricada poliméricos baseados em gotículas microfluidic consiste de duas camadas PDMS (Figura 1a). Três tipos de redes de canais microfluídicos são usados para a geração de microesferas: geometria 1) fluxo de focagem como mostrado na Figura 1b, 2) é um canal de serpentino para misturar a solução, eu e a solução II e 3) um canal de polimerização para microesfera solidificação. A altura de todos os can...

Discussão

Contaminantes de dsDNA são um grande problema no ssDNA amplificação. Continua a ser difícil minimizar dsDNA amplificação em PCR amplificação assimétrica convencional¹⁵. Além disso, apesar de melhorias técnicas para gerar ssDNA permitiram-na aumentar a eficiência da taxa de transferência de amostra, ssDNA isolamento ainda é problemático devido a seus elevados custos e rendimentos de purificação incompleta.

PCR assimétrico é um dos métodos mais desafia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres