Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Resumo

Aqui, apresentamos os protocolos para visualizar respostas de cálcio (Ca^{2 +}) eliciadas células HeLa infectadas por Shigella. Otimizando os parâmetros de infecção bacteriana e imagem latente com sondas fluorescentes de Ca^{2 +} , caracterizam-se atípica globais e locais Ca^{2 +} sinais induzidos por bactérias sobre uma escala grande da cinética da infecção.

Resumo

CA^{2 +} é um íon ubíquo envolvido em todos os processos celulares conhecidos. Enquanto^{globais Ca 2 +} respostas podem mudar o destino de célula, variações locais grátis Ca^{2 +} citosólico concentrações, ligada à liberação de lojas internas ou um influxo através dos canais da membrana plasmática, regulam processos de célula cortical. Patógenos que aderir ou invadir o hospedeiro células gatilho uma reorganização do citoesqueleto de actina subjacentes a membrana plasmática de anfitrião, que provavelmente afeta Ca^{2 +} sinalização globais e locais. Porque esses eventos podem ocorrer em baixas frequências de forma pseudo estocástica sobre cinética estendida, a análise de Ca^{2 +} sinais induzidos por patógenos gera grandes desafios técnicos que devem ser abordadas.

Aqui, nós relatamos protocolos para a detecção de Ca^{2 +} sinais globais e locais em cima de uma infecção de Shigella de células epiteliais. Estes protocolos, artefatos ligados a uma exposição prolongada e Fotodano associado com a excitação de sondas fluorescentes de Ca^{2 +} são solucionados problemas ao controlar rigorosamente os parâmetros de aquisição durante períodos de tempo definidos durante um Shigella invasão. Os procedimentos são implementados para analisar com rigor a amplitude e frequência da global citosólico Ca^{2 +} sinais durante a cinética de infecção prolongada usando a sonda química Fluo-4.

Introdução

CA^{2 +} regula todos os processos de célula conhecida, incluindo a reorganização do citoesqueleto, respostas inflamatórias e caminhos de morte celular relacionados ao hospedeiro-patógeno interações^1,2,3. Sob condições fisiológicas, basal citosólico Ca^{2 +} as concentrações são baixas, em centenas de gama nM, mas podem ser submetidas a aumentos transitórios mediante estimulação agonista. Estas variações frequentemente apresentam comportamento oscilatório através da ação das bombas e canais em membranas do plasma e retículo endoplasmático. O padrão dessas oscilações é caracterizado pelo período, duração e amplitude de Ca^{2 +} aumenta e é descriptografado por células que, por sua vez, provocam respostas específicas no que é conhecido como o Ca^{2 +} código^4,5 . Um aumento sustentado da citosólico Ca^{2 +} concentração sob condições patológicas pode levar à morte celular associada a permeabilização de membranas mitocondriais e o lançamento do pro-apoptotic ou fatores necróticos^{6, 7}.

Shigella, o agente causador da disenteria bacilar, invade células epiteliais injetando efetores em células hospedeiras, usando um tipo III secreção sistema (T3SS)^8,9. Uma invasão de Shigella das células do hospedeiro é associada com o locais e globais Ca^{2 +} sinais eliciados a T3SS. Quanto à formação de poros toxinas, o translocon T3SS que insere as membranas de pilha de anfitrião e é necessária para a injeção de efetores T3SS é provavelmente responsável para a ativação do PLC e do triphosphate do inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependente Ca^{2 +} lançamento. A combinação de estimulação localizada PLC e o acúmulo de actina polimerizada em sites de um resultado de invasão de Shigella em uma Ca InsP3 dependente atipicamente longa duração^{2 +} versão¹⁰. O efetor do III tipo IpgD, um bisfosfato fosfatidil 4,5 (PIP2) -4-fosfatase, limita a quantidade de local de PIP2, assim, controlar a quantidade de substrato disponível para PLC gerar InsP3, que contribui para o confinamento do local Ca^{2 +} respostas em sites de invasão bacteriana^11,12. ^{Estes locais Ca 2 +} respostas provavelmente contribuem para a polimerização de actina no Shigella invasão sites¹⁰. Global Ca^{2 +} respostas que são também provocadas pela Shigella, no entanto, são dispensáveis para o processo de invasão bacteriana, mas provocar a abertura de hemichannels connexin na membrana plasmática e a liberação de ATP no extracelular compartimento. Lançado ATP agindo de forma parácrina, por sua vez, estimula a^{Ca 2 +} oscilatórias respostas nas células ao lado da célula infectada. IpgD também é responsável pela formação^{globais Ca 2 +} respostas em erráticas respostas isoladas com dinâmica lenta. Eventualmente, após uma prolongada infecção bacteriana, IpgD leva para a inibição de InsP3 mediada por Ca^{2 +} sinais. Através de sua interferência com sinalização de Ca^{2 +} , IpgD atrasa um Ca^{2 +}-ativação Calpaína dependente, levando para a desmontagem de estruturas de adesão focal e o descolamento prematuro da infectado as células¹³.

Enquanto Ca^{2 +} sinais estão envolvidos em aspectos críticos da patogênese, a utilização de um microrganismo gera um número de desafios técnicos que não são encontrados em estudos clássicos agonista. Os protocolos descritos aqui usam o comumente usado fluorescente Ca^{2 +} indicador químico impresso Fluo-4 que nós produzimos para caracterizar o local de Ca^{2 +} sinais durante uma infecção de Shigella . Passos essenciais para a detecção destes sinais são discutidos, bem como procedimentos implementados para sua análise quantitativa que é necessário para caracterizar o papel de efetores bacterianas em sinalização de Ca^{2 +} .

Protocolo

1. preparações

1. Preparação de bactérias
   1. As bactérias da placa — estirpe do selvagem-tipoShigella expressando a adesina umFAE (M90T-umFAE) — para um trypticase agar soja (TCS) placa contendo 0,01% de vermelho de Congo (CR) e incube-os por 18 h a 37 ° C.
      Nota: Para aumentar a sua reprodutibilidade, as placas de Shigella obtidas na etapa 1.1.1 são armazenadas a 4 ° C e devem ser usadas dentro de uma semana, porque todas as colônias em meio de CR eventualmente girará o vermelhas ao longo do tempo.
   2. Inocule TCS caldo de pré-cultura escolhendo 3 colônias vermelhas das placas raia.
      Nota: Uma inoculação com 3 colônias é realizada para limitar a probabilidade de escolher um único clone plasmídeo cuja virulência sofreu uma recombinação genética.
   3. Cultivar culturas bacterianas líquidas numa incubadora tremendo para 16 h a 37 ° C a 200 rpm. Adicione ampicilina em uma concentração final de 75 mg/mL. Concentrações de antibiótico não devem exceder 3 x a concentração inibitória mínima, como um excesso de antibiótico pode levar à perda do plasmídeo grande virulência.
      Nota: A manutenção do plasmídeo de virulência a Shigella deve ser verificada pelo chapeamento as culturas bacterianas em placas CR suplementadas com concentrações de antibiótico adequadas. A presença de colônias brancas indica perda do plasmídeo.
   4. Inocule a cultura TCS com a cultura bacteriana prévia a uma diluição de 1: 100. -Incube a 37 ° C numa incubadora de agitação por 2 h a 200 rpm. Certifique-se de que a densidade óptica em 600 nm (OD_600nm) é de 0,2 - 0,4.
   5. Centrifugar a cultura bacteriana por 2 min a 13.000 x g a 21 ° C e resuspenda o pellet em uma quantidade equivalente de médio EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, glicose de 5 mM e 25mm HEPES pH = 7.3).
   6. Diluir a suspensão bacteriana em um buffer EM um final de OD_600nm de 0.1 e usá-lo imediatamente ou armazená-lo a 21 ° C e usá-lo dentro o próximo 60 min.
2. Preparação da pilha
   1. Cultura de células de HeLa em DMEM com 1 g/L de glicose suplementado com 10% de soro fetal bezerro (FCS) e cultivá-las a 37 ° C, com 10% de CO₂. Cresce TC-7 cultivadas em DMEM com 4,5 g/L de glicose, contendo 10% FCS e não aminoácidos essenciais em uma incubadora de 37 ° C contendo 10% de CO₂.
   2. Para a manutenção da célula, dividir as células regularmente para evitar uma inibição de crescimento-contato ligada aos Estados confluentes; Isto é crítico para uma Ca^{2 +} sonda carregamento/transfeccao eficiência elevada.
   3. Placa de células HeLa no estéril de 25 mm de diâmetro circular lamelas em placas de 6-poços em uma densidade de 3 x 10⁵ células/poço no dia anterior a experiência para as células HeLa.
   4. Para células de TC-7, trypsinize e contar as células. Semente-los em 4 x 10⁵ células/poço e incube-os 5-7 dias a 37 ° C em um 10% CO₂-incubadora antes os experimentos para permitir uma polarização.
      1. Atualize o meio de cultura celular todos os dias até o dia do experimento.
         Nota: Câmaras descartáveis de 35 mm de diâmetro inferior de vidro também podem ser usadas como uma alternativa aos poços contendo lamelas. Se os últimos são utilizados, controle de temperatura através de um estágio aquecido ou objetivo não é suficiente, e uma câmara de incubação termostato montado sobre o palco do microscópio é necessário.
3. No dia do experimento, remover o meio e lavar as células 3 x com média de 1 mL EM 21 ° c.
4. Carregar as pilhas com 3 mM de Fluo-4h¹⁴ em um buffer EM por 30 min a 21 ° C.
   Nota: Quando o carregamento de sub confluentes células HeLa não levanta grandes problemas, o carregamento de células polarizadas TC-7 é frequentemente heterogêneo e pouco eficiente. Para essas células, nós encontramos que a eficiência de carregamento é realçada pela adição do agente de dispersão — ácido pluronic — em uma concentração final de 0,1% e o ânion-transporte bromosulfophtalein de inibidor em uma concentração final de 20 µM para o EM fluo-4-AM-contendo. O uso de químico ratiometric sondas ou geneticamente codificado-FRET sondas que requerem dual-aquisição não é compatível com a velocidade de aquisição, necessária para o tratamento de imagens de locais Ca^{2 +} respostas.
5. Lavar as amostras 3 x com EM buffer e incube-os ainda mais em 1 mL de tampão na 21 ° C, para permitir que a hidrólise da fracção AM. Usar Fluo-4 carregado células imediatamente ou dentro do próximo 90 min (mantida a 21 ° C).

2. infecção e aquisição de imagens de locais de Ca^{2 +} respostas

1. Coloca a lamela contendo as células de Fluo-4 carregado em uma imagem de câmara ou câmara de vidro-fundo. Lavar as amostras na câmara de imagens ou descartável de vidro-fundo câmara 3x com buffer EM remover compostos potencialmente resultantes de lise celular. Adicione 1 mL de tampão de EM.
2. Coloque a câmara em um palco de microscópio de fluorescência invertido aquecido a 33 ° C.
   Nota: Esta temperatura é selecionada como um compromisso entre as temperaturas ideais compatíveis com o processo de invasão de Shigella e o abrandamento de^{Ca 2 +} respostas para visualizar respostas locais. Nós usamos um 63 X objetivo de óleo de imersão (at = 1.25) equipado com anéis de contraste de fase.
3. Selecione um campo de microscopia e configurar parâmetros de aquisição, incluindo o tempo de exposição e binning se necessário, para otimizar o sinal fluorescente Fluo-4.
   Nota: Os principais desafios de local Ca^{2 +} imagem são de baixa amplitude e a pequena duração das respostas, que exigem a aquisição pelo menos a cada 30 ms. várias disponíveis comercialmente back-iluminado EM-CCD ou C-MOS câmeras apresentam o necessário sensibilidade para a detecção de Ca^{2 +} respostas locais usando Fluo-4. Sensibilidade da deteção é também uma questão importante limitar Fotodano ou artefatos como respostas espontâneas ligadas à excitação fluorescente de Fluo-4 em uma alta frequência. Aqui, uma baseada em LED iluminação de 470 nm, com um filtro de excitação 480 ± 40 nm band-pass, um filtro dicroico 505 nm e uma 527 ± 30 nm passa-banda de emissão utilizados em 5% da sua máxima intensidade, combinada com um filtro de densidade neutra a 1,0 foram usados para minimizar estes problemas sob um fluxo de aquisições de duração limitada. Uma análise de Ca^{2 +} sinais locais por lotes de 120 fluxos de s foi realizada de rotina. Nestas condições de baixa iluminação, fluoróforo fotobranqueamento não foi observado durante as aquisições de min-fluxo 2. Aquisições sucessivas na mesma amostra podem ser realizadas, desde diferentes campos são utilizados. Como regra geral, um primeiro fluxo de aquisição é executado em um campo de controle na ausência de estimulação de bactérias para garantir a ausência de respostas espontâneas. Se observam-se respostas espontâneas, as amostras são lavadas com tampão EM até sem respostas são observadas.
4. Para adicionar bactérias para a amostra, remover 500 µ l de tampão EM da câmara e adicione 500 µ l da suspensão bacteriana preparada na etapa 1.1.6 para obter um final OD_600nm de 0.05, com os cuidados adequados para evitar se mover o campo da microscopia selecionado; os volumes de assegurar uma adequada mistura de bactérias e uma distribuição homogênea das bactérias em amostras de célula.
5. Realize uma aquisição mediante a adição de bactérias. Alternativamente, realize uma aquisição 10 min após a adição de bactérias, que corresponde ao tempo necessário para que as bactérias sedimentos nas células nas condições usadas. No final do fluxo de aquisição, adquira uma imagem de contraste de fase do campo seleccionado para visualizar as bactérias em contato com as células e os babados de membrana associados com sites de invasão bacteriana.
6. Repita o procedimento de aquisição como na etapa 2.5, em intervalos que são favoráveis à duração da caixa aquisições de imagem, arquivos, seleção de um novo campo para cobrir todo o processo.
   Nota: Para Shigella, encontramos que a aquisição transmite cada 5 min por 20 min, seguindo a sedimentação bacteriana 10 min, autorizada a cobrir a maior parte dos eventos de invasão.
7. No final do processo de aquisição, adicione uma concentração final de 2 µM de Ca^{2 +} ionóforo ionomycin amostras para determinar a amplitude máxima dos sinais de Ca^{2 +} . Adquirir imagens cada 3-5 s até a estabilização do sinal, geralmente para menos de 10 min.
8. Siga pela adição de Ca^{2 +} quelante EGTA em uma concentração final de 10 mM para determinar o sinal de fluorescência na ausência de Ca^{2 +}. Adquirir imagens cada 3-5 s até a estabilização do sinal, geralmente para menos de 10 min.
   Nota: Por causa da dinâmica relativamente lenta das variações Ca^{2 +} globais, execute estas aquisições cada 3-5 s (não no modo de streaming), permitindo a Ca^{2 +} imagem no mesmo campo microscópico durante os tratamentos sucessivos.

3. análise

1. Express citosólico Ca^{2 +} variações ao longo do tempo como a porcentagem de ΔF/F₀, onde ΔF representa a variação da intensidade da fluorescência média da região de interesse (ROI) e F₀ a fluorescência de base no ROI mesmo, para que um não relevantes para a região do campo desprovido de células é subtraído.
   1. Remover os níveis basais de fluorescência para cada célula em diferentes campos, correspondente aos níveis de base; Estes níveis podem ser determinados sem ambiguidade devido a baixa frequência e relativamente curta duração do^{locais Ca 2 +} respostas na aquisição de um determinado fluxo.
      Nota: Quantificar características marcantes das respostas relacionadas às perguntas feitas e o modelo patogênico estudado. Classicamente, vários parâmetros são levados em conta para analisar Ca^{2 +} sinais, incluindo a frequência de células mostrando^{locais ou globais Ca 2 +} respostas, bem como a duração, amplitude e frequência dessas respostas. No caso de Shigella e respostas locais, outro aspecto importante da análise é a associação espacial das respostas com sites de invasão bacteriana.
2. Para quantificar a percentagem de células responsivas apresentando respostas globais ou locais, desenhe ROIs em células, na série de tempo correspondente às variações de intensidade de Fluo-4.
   1. Definir parâmetros rigorosos para identificar Ca^{2 +} respostas locais, tais como uma amplitude de variações de fundo triplo acima a linha de fluorescência de média intensidade célula base, ou uma duração de pelo menos 200 ms, para evitar marcar um falso positivo.
      Nota: Como regra geral, mesmo pequenas Ca^{2 +} respostas locais podem ser distinguidas de qualquer ruído de fundo pelo seu perfil. O ROIs deve ser grande o suficiente para integrar suficientes sinais de fluorescência para permitir a detecção de variações locais. Dependendo da intensidade da detecção Fluo-4, estes ROIs podem corresponder a círculos com diâmetros variando de 2 a 5 mM.
   2. Medir as variações da média intensidade da fluorescência Fluo-4 em 2 regiões em uma área distinta da mesma célula, para determinar se as respostas são locais ou globais.
      Nota: A análise de um grande número de células é facilitada pela utilização de software que permite a exibição de tela on-line das variações da intensidade da fluorescência média ao longo do tempo para as regiões selecionadas de imagem. Software de imagem comercialmente disponível tem essa opção, mas isso também pode ser realizada usando o Icy freeware, usando o plugin de Evolução de intensidade de ROI .
   3. Determine a porcentagem de células apresentando respostas locais.
      Nota: Este percentual é calculado a partir do número total de células analisadas no campo de microscopia, que deve ser em número suficiente para suportar um estatisticamente significância usando um teste não-paramétrico.
   4. Determine a duração das respostas locais.
      Nota:^{Locais de Ca 2 +} respostas podem ser ainda mais distinguidas de acordo com os intervalos de duração (ou seja, menos de 500 ms, entre 5 e 10 s, ou acima de 10 s) e sua associação com sites de invasão de Shigella .
3. Quantificar a amplitude das respostas. Primeiro, calibre as máxima Ca^{2 +} e célula fundo níveis determinados como na etapa 2.1.7. Desde que a carga de Fluo-4 pode variar para cada célula, execute essas determinações para células individuais no campo.
   1. Expressa a amplitude das respostas em percentagem relativa da resposta máxima.
   2. Realizar testes estatísticos utilizando um teste de normalidade, seguido de um teste paramétrico para analisar possíveis diferenças na amplitude das respostas entre as amostras.
   3. Determine a associação dessas respostas em relação os sites de invasão bacteriana por sua respectiva localização para os babados de membrana induzida por bactérias visualizado nas imagens de contraste de fase correspondente.

Resultados

Invasão de Shigella está associado atípica duradouro Ca^{2 +} respostas locais:

Seguindo o protocolo mencionado acima, as células HeLa Fluo-4-carregado foram desafiadas com WT Shigella e aquisições de fluxo foram realizadas para analisar sinais de Ca^{2 +} . Um experimento de representante é mostrado na Figura 1, com uma série de imagens de lapso de tempo da in...

Discussão

Este manuscrito descreve o protocolo que estamos projetados para seguir Ca^{2 +} sinais locais durante a cinética relativamente curta de uma invasão de Shigella , bem como Ca^{2 +} respostas globais durante a cinética estendida de Shigella. Abaixo, a chave encontram problemas que precisam ser abordadas para otimizar a detecção de Ca^{2 +} sinais minimizando qualquer interferência com os processos biológicos.

Química vs geneticamente codif...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin