Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

Resumo

O objetivo do presente protocolo é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos isolados de não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Este protocolo envolve congelado amostras de tecido intestinal humano, cryosectioning, coloração etanólica e desidratação, LCM, a preparar e a extração do RNA.

Resumo

A finalidade desse método é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos colhidos não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Nós identificamos cinco etapas do fluxo de trabalho que são cruciais para a obtenção de RNA isolados de gânglios entéricos com qualidade e quantidade para RNA-Seq Em primeiro lugar, ao preparar o tecido intestinal, cada amostra deve ter excesso de líquido removido pela mancha antes de achatamento do serosa, tanto quanto possível através da parte inferior dos moldes base grandes. Amostras são então rapidamente congeladas em cima de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane. Em segundo lugar, quando cortar o tecido, é importante para a posição cryomolds para que seções intestinais paralelo ao plano completo do Plexo mioentérico, produzindo, assim, a maior área de superfície dos gânglios entéricos por slide. Terceiro, durante a LCM, polietileno napthalate (caneta)-slides de membrana para oferecer a maior velocidade e flexibilidade para delinear as formas não-uniforme dos gânglios entéricos quando coletando gânglios entéricos. Em quarto lugar, para visualização distinta dos gânglios entéricos dentro de seções, etanol-compatível com corantes, como Violet cresilo, oferecem excelente preservação da integridade do RNA em relação a corantes aquosos. Finalmente, para a extração de RNA de gânglios capturados, observamos diferenças entre jogos comerciais da extração do RNA que rendeu superior quantidade de RNA e de qualidade, ao eliminar a contaminação de DNA. Otimização desses fatores no atual protocolo grandemente acelera o fluxo de trabalho e produz amostras de gânglios entéricos com excepcional qualidade de RNA e quantidade.

Introdução

Este método foi projetado para obter amostras de RNA de alta qualidade dos gânglios entéricos do tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). O protocolo descrito aqui foi otimizado para fornecer qualidade de RNA e rendimentos suficientes para o RNA (RNA-seq) de sequenciamento e destina-se a ser usado com o recém-ressecados, não fixado, congelado tecido intestinal humano.

Transtornos da motilidade gastrointestinal e intestino funcional afetam um em cada quatro pessoas nos Estados Unidos. O sistema nervoso entérico (ENS), também conhecido como o segundo cérebro¹, muitas vezes está no centro desses distúrbios, como desempenha um papel fundamental na homeostase de intestino e motilidade. Manipulação da motilidade do intestino tem sido geralmente restrita a ressecção cirúrgica do tecido agangliônico/noncontractile, modificação dietética crônica e/ou medicamentos. Surpreendentemente, a transcriptoma cheia de ENS o adulto permanece para ser sequenciado, limitando grandemente a nossa capacidade de identificar moléculas dentro do ENS que podem ser direcionados farmaceuticamente ou utilizados em terapias de células-tronco.

Há relativamente poucos métodos para isolar o RNA de gânglios entéricos humanos. A primeira abordagem, a dissociação de célula², requer incubação alta temperaturas e tempos de incubação longo; ambos dos quais são conhecidos por promover a degradação de RNA e alterar o transcriptoma^2,3. Uma abordagem alternativa, LCM, mais confiantemente preserva a transcriptoma e protege a integridade do RNA. Embora diversos estudos utilizaram LCM para coletar gânglios do tecido intestinal humano fresco congelado^4,5,6, essas abordagens também foram prejudicados pela má qualidade do RNA e quantidade, foram bastante trabalhosas, ou necessária a modificação da coloração ou técnicas de extração de RNA para trabalhar nas nossas mãos. Outros protocolos de LCM projetados para a preservação do RNA que foram encontrados no produto LCM manuais fornecidos melhorias adicionais^7,8, mas a adaptação foi necessária quando aplicado ao isolamento dos gânglios entéricos^{8, 9}. por estas razões, nós desenvolvemos um protocolo otimizado com base nesses recursos que produz quantidades substanciais de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos humanos, tem um fluxo de trabalho relativamente rápido e produz resultados consistentes através de um grande número de amostras.

Neste estudo, apresentamos uma sinopse de procedimentos otimizados que facilitar o isolamento do RNA de alta integridade dos gânglios entéricos, originados de tecido intestinal humano ressecado. Nosso método incorpora cinco aspectos importantes. Primeiras, recém-ressecados, unfixed amostras intestinais humanas devem ser aparadas de tamanho, tem toda a umidade em excesso removido com um tecido de laboratório e achatada em um molde grande base antes do flash-congelamento em cima de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane (2 MB). Em segundo lugar, histológicas seções do intestino devem estar preparadas para obter o plano completo do Plexo mioentérico em um slide, que oferece uma grande carga de gânglios entéricos. Sucesso com este passo é largamente dependente do processo de preparação do tecido. Em terceiro lugar, a estrutura não-uniforme de gânglios no ENS requer o uso de polietileno napthalate (caneta) membrana slides⁶, que oferecem a maior velocidade e precisão durante o processo de LCM. Quarta, etanol-compatível com tinturas, tais como cresilo violeta, devem ser usadas para preservar a integridade do RNA enquanto coloração gânglios entéricos. Por último, o processo de extração de RNA é fundamental para um bom resultado com RNA-Seq Buscamos uma abordagem de extração de RNA que produz alta integridade do RNA, maximiza o rendimento do RNA quando começando com pequenas coleções de gânglios entéricos, elimina a contaminação de DNA e mantém o maior número de espécies de RNA quanto possível.

Tomados em conjunto, otimização desses fatores no presente estudo grandemente acelera o fluxo de trabalho e produz amostras dos gânglios entéricos com excepcional RNA de quantidade e qualidade. Os resultados foram amplamente consistentes entre um grupo considerável de amostras, indicando a consistência desta abordagem. Além disso, usamos essas abordagens para sequenciar com sucesso dezenas de amostras de RNA dos gânglios entéricos. As estratégias destacadas aqui também podem ser adaptadas em geral para a realização de LCM de gânglios desejados ou núcleos de periférico e sistema nervoso central e outros casos que requerem o isolamento do RNA de alta qualidade.

Protocolo

Todos os protocolos aqui descritos foram aprovados pela Vanderbilt University institucional Review Board (IRB).

1. preparação antes da chegada do tecido

1. Obter a devida aprovação do IRB e coordenar com as agências de doação de órgão humano para obter o tecido intestinal não fixado, recém-ressecados de doadores que atendam todos os critérios de pesquisa necessários para o estudo.
   Nota: Este protocolo pode ser adaptado para uso com ratos e outros roedores modelos.
   1. Imediatamente após a ressecção de cada segmento intestinal, lave minuciosamente o lúmen com PBS refrigerados ou meio de armazenamento de tecido para remover material residual luminal ou fezes.
   2. Após a lavagem e descarte de resíduos em um recipiente apropriado risco biológico, mergulhe o tecido em um volume suficiente de meio de tecido-armazenamento (por exemplo, 3 - 5 vezes o volume do tecido intestinal) e armazenar em plástico rotulados individualmente, à prova d'água recipientes, submerso em gelo ou refrigerada até o uso).
   3. Processo o tecido dentro de 18-26 horas do tempo de coleta para evitar degradação substancial de RNA.
      Nota: Dependendo da limpeza do segmento intestinal e armazenamento, pode ser possível estender nosso prazo sugerido.
2. Preparar todos os materiais necessários para coleta de tecido humano com antecedência, conforme indicado no presente protocolo (consulte a Tabela de materiais , para obter informações mais detalhado do produto). Certifique-se de que todos os necessários equipamentos de proteção individual é usado em todos os momentos.
3. Prepare os baldes de gelo seco, juntamente com uma pasta de gelo seco conforme mostrado na Figura 1.
   1. Esmague bastante gelo seco para preencher 4 padrão circulares baldes de gelo e um balde de gelo retangular. Um dos baldes padrão deve ter laboratório pequeno (11 x 21 cm) tecidos colocados na superfície do gelo seco. Se possível, use o novas, por abrir caixas de lenços de laboratório.
   2. Faça uma pasta de gelo seco por powderizing 2L de gelo seco em um balde de gelo limpo retangular.
   3. Adicione 2-MB previamente refrigerada até a superfície do gelo seco. Ligeiramente, misturar e achatar o chorume usando uma tampa de caixa de ponta de pipeta à superfície de forma do chorume em um canal cercado por pedaços grandes de gelo seco ao longo dos lados do balde retangular.
   4. Coloque vários blocos finos de gelo seco ao longo das bordas do balde de gelo para incentivar a congelação mais rápida. Deve haver espaço para ≥4 moldes base caber vagamente no balde de gelo seco de chorume em um determinado momento.
      1. Opcionalmente, pilha o balde de gelo dentro de outro balde de gelo Retangular preenchido ¼ com gelo seco. Este posicionamento ajuda a isolar melhor o chorume de gelo seco e evita a necessidade de ajustes frequentes de gelo seco e 2 MB durante o procedimento.
   5. Posicione os baldes de gelo seco em uma linha de montagem na seguinte ordem: 1) gelo seco balde de chorume, balde de gelo 2) laboratório tecido seco, 3 & 4) normais baldes de gelo secos, balde de gelo 5) retangulares (Figura 1A).

2. preparação do tecido Intestinal humano congelado

Nota: Todo esse processo pode levar entre 45-80 min por segmento intestinal, dependendo da qualidade do tecido intestinal. Recomendamos também que recolher amostras de controlo de qualidade para avaliar a qualidade do RNA e histologia antes de prosseguir com a LCM.

1. Encha uma grande bandeja com gelo molhado e colocar placas de corte cirúrgico em cima do gelo seco.
2. Nesta instalação, acalme-se um béquer de 500 mL e 100 mL para armazenar o tecido e segmentos aparados em solução de armazenamento de frio. Moldes de base pre-calma sobre as tábuas de corte para que eles estão prontos para receber o tecido.
3. Após receber o tecido intestinal fresco, despeje a mídia em que o tecido é transportado e retê-lo os copos previamente refrigerados. Deixe algum espaço nestes copos para o armazenamento temporário do tecido intestinal e segmentos aparados, que serão preparados em etapas subsequentes.
4. Corte o segmento intestinal a um comprimento de aproximadamente 20 cm, que fornece amplo tecido (40-60 cm²) para gerar o RNA para aplicações a jusante e amostras de controlo de qualidade. Dependendo da integridade do tecido, ela pode ser viável para realizar o isolamento de RNA para processamento a jusante, com um comprimento muito menor (ou seja, 5 cm do intestino).
5. Apare fora adiposo e tecido conjuntivo no intestino com uma tesoura cirúrgica. Adiposa junto o serosa intestinal residual compromete a capacidade de achatar totalmente tecido em etapas subsequentes. Apare cuidadosamente o tecido, a fim de evitar entalhar as membranas serosas durante a remoção da gordura e do tecido conjuntivo, que estruturalmente pode danificar o Plexo mioentérico ou fazer com que o exterior do tecido achatar desigualmente para corte.
6. Faça uma incisão longitudinal ao longo de todo o comprimento da amostra intestinal, de preferência no local de fixação mesentérica.
7. Dissecar afastado e descartar a ténia coli do cólon, para que ele achata mais facilmente, após ser liberado de tensão.
8. Splay lado mucosa do intestino para baixo em uma placa de corte refrigerado e cortar tiras de 1,25 cm de largura do comprimento total do tecido.
   Nota: Tecido Intestinal expande-se muitas vezes depois de aparelhar, assim deste tamanho deve ser ajustado em conformidade.
9. Armazene temporariamente as tiras em solução de armazenamento de tecidos refrigerados.
   Nota: Nós usamos a solução de armazenamento frio Belzer UW porque tem uma vida útil longa, é relativamente de baixo custo e podem ser armazenado à temperatura ambiente até que seja necessário.
10. Remova a solução de armazenamento frio uma tira de tecido e corte-o em segmentos ~1.5-2 cm de comprimento.
11. Rapidamente borre os segmentos intestinais sobre uma pilha de lenços de laboratório, para remover o excesso de líquido e evitar a formação de cristais de gelo ao longo do serosa intestinal durante congelamento flash. Se o tecido não é suficientemente secos, será difícil obter as seções de alta qualidade do Plexo mioentérico.
12. Deite o borrado peças intestinal mucosa-lado para um pre-refrigerado, grande, descartável base molde plástico (37 x 24 x 5 mm).
13. Achate cuidadosamente cada segmento levemente esticar o tecido sobre a superfície do molde base e usando pinça curva suavemente Pressione para baixo e expulsar quaisquer bolhas de ar que podem ser preso sob o serosa. Observe que o tecido se expande enquanto o achatamento. Se necessário, apare os segmentos e cortar as amostras restantes em um tamanho menor.
    Nota: Se o tecido for excessivamente esticado, isto irá distorcer o Plexo mioentérico. Após todas as bolhas de ar são removidas, avalie a espessura da amostra antes da congelação. Se necessário, empurre as bordas do interno a amostra até a amostra intestinal se aproxima de sua espessura original.
14. Coloque o molde base carregado para a superfície do gelo seco, chorume de 2 MB. O tecido deve congelar completamente dentro de 30-60 s, dependendo do tamanho e espessura do segmento intestinal.
15. Seque o fundo do molde base para remover residual 2-MB esfregando rapidamente o molde base sobre os tecidos de laboratório pré-refrigerados no segundo balde de gelo seco.
16. Transferir a amostra seca para a terceira banheira de gelo seco e enterrá-lo sob a superfície do gelo seco, até que esteja pronto para ser enrolado.
17. Rapidamente observe a parte inferior do molde base antes da embalagem, para examinar a qualidade da preparação da amostra. Anote quaisquer amostras que não aparecem plana ou tem bolhas de ar grandes, como estas devem ser evitadas para cryosectioning e LCM.
18. Enrole a amostra em papel de alumínio previamente rotulado que é colocada em cima de gelo seco em um balde, para que o envolvimento do tecido ocorre ao mesmo tempo sendo mantidas completamente congeladas.
19. Enrole a amostra com uma camada de plástico, para minimizar a desidratação do tecido durante o armazenamento a-80 ° C.
20. Armazenar as amostras no balde retangular até que estejam prontos para ser movido para o congelador.
21. Pre-rotular e pre-relaxar caixas de congelador a-80 ° C para armazenamento imediato das amostras após a coleta.
22. Pegue uma pequena porção de tecido de cada segmento intestinal para avaliação da integridade do RNA antes da realização de LCM.
    1. Pré-etiqueta um tubo de RNase-livre de 2mL para cada segmento, cheio de ≥500 µ l de tampão de Lise. Nós recomendamos usar o Kit de extração de RNA "D", constantes da Tabela de materiais.
    2. Homogeneizar um pedaço pequeno (2 mm x 2 mm) do intestino em um padrão micro-homogeneizador (20-40 s, até permanecem sem pedaços de tecido). Então, imediatamente congele o RNA lisado em gelo seco e loja a-80 ° C até prosseguir com a extração do RNA.
    3. Opcionalmente, incorpore algumas das seções no meio de congelamento de tecido (TFM) como um back-up. Preparar os cortes histologicos da mesma maneira descrita nesta seção, mas submergir as amostras no TFM dentro do molde base antes do congelamento flash.

3. Cryosectioning

1. Antes cryosectioning, preparar todos os materiais necessários para a coloração e a desidratação e transferir as amostras de tecido desejado do freezer-80 ° C num balde de gelo seco.
2. Preparar o criostato para uso definindo para a temperatura de corte ideal (-18 a-22 ° C) e limpar as superfícies com 100% de etanol e tratando a lâmina e escovar a bandeja com solução de descontaminação de RNase.
3. Para melhor aderir a amostra para o chuck, use a seguinte abordagem.
   1. Coloque a pinça em gelo seco para pelo menos 30 s antes de desembrulhar a amostra intestinal e colocando-o na superfície do gelo seco serosa-lado-acima.
   2. Encham um suporte de amostra grande criostato com um monte de 3-5mm de meio de congelamento de tecido (TFM) e imediatamente transferir a amostra intestinal serosa-lado-para cima para o TFM.
   3. Rapidamente transferi o suporte de amostra de gelo seco e cubra com powderized gelo seco depois permitindo o TFM aderir à amostra para 2-5 s à temperatura ambiente. Certifique-se que o TFM permanece abaixo do plano do Plexo mioentérico.
      Nota: Idealmente, a superfície exterior da mucosa intestinal totalmente aderirão o TFM antes o TFM começa a congelar sem descongelação da amostra.
4. Monte o suporte de amostra no cabeçote do criostato e alinhar a amostra com a lâmina do criostato, tal que o avião do Plexo mioentérico será paralelo à lâmina de corte.
5. Defina a espessura de corte no criostato para 8 µm. O objetivo de alinhar perfeitamente o espécime é obter a maior área de superfície possível do Plexo mioentérico em cada slide. Esta espessura é geralmente recomendada para tecidos humanos e roedores, mas pode ser ajustada conforme necessário.
6. Secção através da serosa e músculo longitudinal até atingir o Plexo mioentérico.
   1. Para localizar o Plexo mioentérico, montar uma seção de amostra numa lâmina e manchar a seção com uma tintura aquosa, tais como 1% cresilo violeta ou azul de toluidina, etc.
   2. Consulte a secção sob um microscópio de luz no 40-2000 X ampliação para identificar a junção entre as camadas musculares longitudinais e circulares. Microscópio parâmetros são fornecidos na Tabela de materiais. No início do corte, as membranas serosas serão marcada pela presença de tecido conjuntivo. Gordura mesentérica restante pode estar presente ao longo do serosa. Começa, então, uma folha da camada muscular longitudinal externa. Quando tiver alcançada a fronteira entre as camadas musculares longitudinal e circular, observar-se-á uma parte dos gânglios entéricos.
      Nota: Nas próximas seções diversas, o Plexo mioentérico vai se tornar muito evidente, com grandes áreas de gânglios estando presente dentro de uma única seção (Figura 2C). Se o tecido não é completamente plano no início do corte, então, apenas uma parte dos gânglios estará presente em cada seção em um determinado momento. Às vezes, a amostra intestinal pode ter um Plexo mioentérico inerentemente desigual, apesar do tecido aparecendo perfeitamente plana. Isto é especialmente verdadeiro para as amostras do duodeno. Em nossa experiência, estas amostras podem levar muito mais tempo para processar com LCM, mas suficiente RNA pode ser coletado dentro da sessão do dia. A localização exata do Plexo mioentérico pode variar consideravelmente entre as amostras, baseadas sobre o tecido e a sua preparação antes do congelamento.
7. Começa a recolher seções seriais para LCM, com coleções ideais, fornecendo o maior número de neurônios e glia por slide. Dependendo da área da superfície da amostra, várias seções podem ser combinadas em um único slide de caneta-membrana.
8. Monte as seções sobre guias de membrana de caneta, refrigeradas brevemente em criostato para 5-10 s. Durante a montagem, o tecido deve derreter ligeiramente, maximamente, preservando a integridade do RNA.

4. coloração

Nota: Para uma visão geral do processo de coloração, consulte a tabela 1. Todas as soluções utilizadas são preparadas em padrão frascos de Erlenmeyer de 50 mL. Tratar o exterior dos tubos com solução de descontaminação de RNase parece não melhorar os resultados (dados não mostrados).

1. Preparar uma solução saturada de violeta de cresilo 4% em etanol a 95% pelo menos um dia de antecedência e totalmente re-suspender a violeta cresilo antes de carregar a seringa.
   Nota: A concentração de etanol pode precisar ser reduzido para coloração eficaz, conforme descrito na seção de discussão. Nós não testamos se usar etanol 50% ou 75% durante coloração significativamente reduz a integridade do RNA. Violeta de cresilo é sensível à luz e, portanto, deve ser protegida da luz.
2. Depois de montar seções do Plexo mioentérico para o slide, imediatamente submergir o slide em um frasco Erlenmeyer de etanol a 95% (pre-refrigerado a-20 ° C) por 30 s.
   1. Se as seções não se aderiu totalmente ao escorregão na etapa anterior, aquecer ligeiramente o fundo do slide com uma mão enluvada (uma limpeza de laboratório deve ser colocado no meio do slide e luva), para total aderência antes submergindo em etanol a 95%. Esta solução pode ser reutilizada pelo menos 3-6 slides sem reduzir a integridade do RNA.
3. Coloque a slide viradas para cima em uma limpeza de laboratório colocada em cima de um recipiente previamente tratada, livre de RNase⁸.
4. Pre-encher uma seringa de 3mL com violeta de cresilo 4% e anexar um filtro de seringa 0,2 µm.
   Nota: Recomendamos filtros de acetato de celulose.
5. Aplicar 6-10 gotas de mancha diretamente sobre o tecido seções⁸ e incubar por 10-30 s, ou até tinta suficiente é retida quando de manchado. Enquanto a coloração, Rode suavemente o recipiente de slide manualmente para garantir que as secções de tecido são uniformemente revestidas com mancha.
6. Deite fora a mancha e imediatamente de manchar o slide em um frasco de 75% de etanol. Repetidamente submergi o slide até o corante em excesso se infiltrou na maior parte da amostra. Isto pode demorar entre 10-20 s.
7. Finalize de coloração mergulhando repetidamente a amostra em um frasco de etanol a 95% para 10 s. submergir a amostra várias vezes até que todo excesso mancha foi removida.
   1. Modifica a duração descoloração, conforme necessário, para otimizar a coloração dos gânglios. Se demasiado mancha é removida, a amostra torna-se muito transparente e pode ser difícil Visualizar
      Nota: Este protocolo de coloração foi otimizado baseado em várias publicações^5,8,10,11 que necessária modificação antes de que obtiveram-se resultados satisfatórios. Portanto, a concentração de álcool etílico utilizado na tintura e durante o processo de descoloração deve ser modificada, quando necessário, para obter um resultado ideal.

5. a desidratação

1. Imediatamente, mergulhe o slide em etanol 100% 2 - 3 vezes, para um total de 10-20 s.
2. Submergir o slide em 100% de etanol anidro pelo menos 30 s. Como o etanol anidro é muito higroscópico, adicione peneiras moleculares (malha de 8-12) para o frasco de etanol 100% antes do início do procedimento para remover toda a água absorvida e, portanto, mais completamente desidratar a amostra⁵.
3. Repetidamente, mergulhe o slide em xilol para 15-20 s. Esta etapa totalmente remove a camada de etanol no slide. Adicione os tubos de xileno, para adsorver totalmente o excesso de etanol e água moléculas⁵peneiras moleculares antes do tempo.
   Cuidado: Xilenos são classificados como um irritante para os olhos e trato respiratório superior e devem ser usados em uma coifa de química.
4. Submergi o slide em xilol (com peneiras moleculares, malha de 8-12) pelo menos 10 min.
   Nota: Uma breve pausa pode ser tomada após esta etapa, se necessário. Amostras podem ser deixadas no xilol para 4-5 horas sem efeitos prejudiciais à mancha, rendimento/integridade LCM ou RNA.
5. Opcionalmente, individualmente prepare vários slides adicionais neste momento. Se preparar uma segunda rodada de slides após completar LCM em todos os slides preparados, o tecido no criostato pode precisar de ser refaced, devido à desidratação da superfície do tecido. Um a quatro seções podem precisar de ser descartado antes de seções utilizáveis podem ser coletadas.

6. laser captura Microdissection (LCM)

1. Remover o slide de xileno e secar ao ar livre, em uma coifa química pelo menos 1 min. inserir um cartucho de caps LCM na fase de microscópio LCM. Carregar o slide para o palco e adquirir uma imagem panorâmica do slide.
2. Identificar o local desejado para LCM e carregar uma tampa sobre o slide.
3. Alinhe o laser de infravermelho (IR) e ajustar a sua alimentação e duração para fazer um 20-30 µm de diâmetro captura local.
4. Localize o laser ultravioleta (UV) e defina uma intensidade e velocidade de corte adequada.
5. Contorne os gânglios desejados para ser coletados usando o software de LCM, certificando-se de ficar dentro do limite da área de colecionável no tampão (retratado no geral slide do programa de software como um círculo verde).
6. Em cada um dos traços, ajuste os pontos IR tais que haja pelo menos um spot de IR todos os 100-500 µm.
7. Pressione o botão de corte de IR/UV para prosseguir com a coleção de todos os gânglios marcados.
8. Coleções são concluída, mova a tampa para um novo local e repita o processo de coleta ou examinar o cap LCM na estação de QC, uma vez que o limite é suficientemente preenchido com gânglios (ou até que seja atingido o limite de tempo recomendado de 60-80 minutos).
9. Se os restos estão presentes no tampão, limpá-lo usando um pincel de ponta fina que foi previamente tratado com solução de descontaminação de RNase, enxaguado com água livre de nuclease e completamente seco.
10. Cuidadosamente examinar a tampa a olho nu ou com ampliação sob um microscópio de campo claro para assegurar todos os detritos foi removido. Se os resíduos não podem ser removidos através da utilização do pincel previamente tratada, use uma ponta de pipeta fina (RNase-livre) para raspar os restos.
11. Fixe a tampa de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL cheio com 230 µ l de tampão de lise de RNA (RLT Buffer do Kit de extração de RNA "B", com β-Mercaptoetanol adicionado em uma concentração de 10 µ l/mL).
12. Inverter o cap, brevemente vortex e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
13. Centrifugar a ≥ 5.000 x g por 5 min e depois transferir a microcentrífuga de tubo de gelo seco.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Lisados de RNA podem ser armazenados a-80 ° C, sem um efeito substancial na degradação de RNA pelo menos 1 semana. Se a isolação do RNA é executada no mesmo dia, então relaxa as amostras no gelo até que estejam prontos para a extração.
14. Execute todas as coleções adicionais dentro do limite de tempo máximo recomendado de 80-90 min depois de remover o slide do xileno. Como as seções desidratadas são expostas à umidade do ambiente, RNases pode tornar-se gradualmente reativado. Restringir o período de coleta pode minimizar esses efeitos e màxima preservar a integridade do RNA.

7. isolação do RNA

1. Prepare uma estação de trabalho livre de RNase para extração de RNA.
2. Preparem-se todos os tubos e os reagentes de acordo com o manual para o Kit de extração de RNA.
   Nota: Enquanto há muitos kits disponíveis para isolamento de RNA seguindo LCM, tivemos sucesso melhor usando o Kit de extração de RNA "B", constantes da lista de materiais. Consulte a Figura 5 para uma comparação lado-a-lado dos reagentes de extração de RNA.
3. Retire amostras do freezer-80 ° C e descongelar rapidamente em banho maria a 37 ° C.
4. Imediatamente o vórtice descongelados amostras para 2-3 s para distribuir uniformemente os sais de tiocianato de guanidínio.
5. Combine cada amostra com igual volume de etanol a 70%. Juntar 2 ou mais lysates, se necessário, para atingir uma concentração suficiente de RNA.
6. Proceda conforme as instruções do fabricante no manual para o processo de extração de RNA, usando o protocolo otimizado para amostras microdissected.
7. Eluir RNA na etapa final para o volume mínimo recomendado de água livre de nuclease (14 µ l).
8. Após o isolamento do RNA, alíquota 1-2 µ l de RNA de cada amostra em uma nova pre-rotulado tubo livre de RNase para controle de avaliação de qualidade de qualidade com um dispositivo microfluídica que pode visualizar pequenas quantidades de RNA, como um Bioanalyzer. Alíquota um adicional 1 µ l em um tubo separado para quantificação com um kit de quantificação de RNA de alta sensibilidade.
   1. Ajuste estes passos, conforme necessário, para obter uma quantidade suficiente de RNA para análise a jusante (i. e., reunir um número maior de LCM caps antes da extração do RNA).
9. RNA de loja a-80 ° C até coletar suficiente amostras para análise a jusante.

Resultados

Fizemos várias melhorias para protocolos existentes que permitem a coleção relativamente rápida dos gânglios entéricos de amostras intestinais humanas usando LCM, atendendo aos padrões de RNA-Seq Primeiro, nós aperfeiçoamos a congelação rápida de segmentos de tecido intestinal em grandes moldes base colocados na superfície de uma suspensão de gelo seco em 2 MB (Figura 1B). O melhor sucesso durante cryosectioning e subsequente LC...

Discussão

Este procedimento possibilita a coleta eficiente de inúmeros gânglios entéricos como uma fonte para derivar do RNA para RNA-Seq Aqui, nós temos acelerado os processos descritos nos protocolos existentes, maximamente, preservando a integridade do RNA. Como todas as etapas neste procedimento são interdependentes, é importante que todas as questões sejam eliminados desde o início do estudo e que todas as amostras são preparadas como da mesma forma um ao outro quanto possível, para obter confiança RNA-Seq

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral-buffered formalin	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
3-mL syringe	BD	309628
50-mL conical tubes, polypropylene	Corning	05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable	Electron Microscopy Sciences	5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM caps	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal	Glad	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
Cutting Board	Electron Microscopy Sciences	63308
Ethanol, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Ethanol, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
Glass Microscope slides	Fisher	12-550-343
Gloves, extended cuff	Microflex	19010144
Gowns, surgical-disposable	Kimberly-Clark	19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (large)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (small)	Kimberly-Clark	34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.
Light Microscope	Olympus	CX43
Microscope objective (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Microscope objective (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Molecular Sieves	Acros Organics	AC197255000
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PicoPure RNA extraction kit	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, disposable faceshield	Fisher	17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"	Fine Science Tools	14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)	Nalgene	190-2520
Tissue Freezing Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL