JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método de parafina seccionamento e counterstaining. Este é um procedimento fácil e rápido para monitorar a expressão gênica durante o desenvolvimento, o que também pode ser aplicado às secções de tecidos, órgãos ou células cultivadas.

Resumo

O gene de Escherichia coli LacZ , codifica a β-galactosidase, é largamente utilizado como um repórter para a expressão de gene e como um tracer em estudos de linhagem celular. A clássica reação histochemical baseia-se a hidrólise do substrato X-gal em combinação com íons férricos e ferrosos, que produz um precipitado azul insolúvel que é fácil de Visualizar. Portanto, atividade de β-galactosidase serve como um marcador para o padrão de expressão do gene de interesse como o desenvolvimento prossegue. Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método subsequente para parafina de seccionamento e counterstaining. Além disso, está previsto um procedimento para clarificar todo embriões para visualizar melhor o X-gal em regiões mais profundas do embrião. Resultados consistentes são obtidos por meio deste procedimento, apesar de otimização das condições de reação é necessária para minimizar as atividades do fundo. Limitações no ensaio devem ser também consideradas, particularmente sobre o tamanho do embrião no monte de toda mancha. Nosso protocolo fornece um sensível e um método confiável para detecção de β-galactosidase durante o desenvolvimento do mouse que pode ser mais aplicado para as seções do criostato, bem como os órgãos inteiros. Assim, os padrões de expressão de gene dinâmico durante todo o desenvolvimento podem ser facilmente analisados usando este protocolo em embriões de todo, mas também detalhada expressão a nível celular pode ser avaliada após corte de parafina.

Introdução

A fim de descrever os padrões de expressão de genes específicos, o uso de genes repórter como marcadores tem sido fundamental da drosófila para mamíferos. Em experimentos envolvendo animais transgénicos e nocaute, o gene bacteriano β-galactosidase (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) é um dos mais amplamente utilizado1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalisa a hidrólise da β-galactosidioss (por exemplo, lactose) em seus monossacarídeos (glicose e galactose)5. Seu substrato mais comumente usado é o X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), um glucosídeo que é hidrolisado por β-galactosidase fundadas 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galactose. O primeiro é oxidado em um dímero que, quando usados combinados com potássio ferri- e ferro-cianeto, produz uma característica insolúvel, o precipitado de cor azul (Figura 1)6.

O gene LacZ começou a ser usado como um gene repórter, há mais de trinta anos de7,8. Geralmente, LacZ é inserida a jusante de um promotor endógeno no lugar do frame de leitura aberto, então ele pode ser usado na cultura bacteriana e célula para visualizar células contendo um encarte especial, bem como em animais transgénicos como um traçador de endógena padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento,9. A este respeito, a visualização da atividade de β-galactosidase tem sido usada extensivamente em Drosophila para compreender os processos de desenvolvimento e celulares de células únicas para tecidos. Genética da Drosophila favorece a geração de linhas estáveis em que uma construção P-elemento modificada, contendo o gene repórter que lacZ é inserido aleatoriamente posições no genoma. Assim, quando colocado sob a influência de elementos potenciador pode dirigir sua expressão de maneira específica de tecido, que permitiu a análise sistemática dos padrões de expressão de diversos genes durante as duas décadas passadas10. Além disso, o uso de ratos transgênicos para monitorar a expressão do gene LacZ também permite a detecção de eventos de recombinação genética por Cre-loxP mediada por recombinação e localização dos derivados de células-tronco embrionárias mutante em análises quiméricoes 11, que facilita o controle da expressão de LacZ em tecidos específicos, bem como temporalmente. Além disso, em todo embriões, deteção da atividade β-galactosidase pode produzir padrões de coloração diferenciais em intensidades diferentes que podem ser convenientemente observados em diferentes estádios de desenvolvimento para analisar mudanças temporais na expressão do gene 8,12.

Neste artigo, apresentamos um protocolo para visualizar a expressão do gene através do X-gal mancha no tecido toda montagem em estágios iniciais de desenvolvimento de embriões do rato. Apresentamos este método histoquímico como uma técnica altamente sensível e de baixo custo que favorece a detecção precisa das pilhas etiquetadas em espécimes de montagem inteira ou a nível celular, depois incorporado de parafina tecidos ou embriões. O método permite a visualização directa da mancha no tecido do mouse com o plano de fundo mínimo quando comparado com outros métodos de13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal o CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) e da Comunidad Autónoma de Madrid, para garantir o mínimo sofrimento dos animais.

1. coleta de embriões de ratos grávidas (de 8.5 para E12.5)

  1. Sacrificar os ratos grávidas por deslocamento cervical ou inalação de CO2 . O dia do primeiro observado plug vaginal foi considerada embrionária dia 0,5 (E0.5).
  2. Colocar o animal em posição supina na almofada absorvente e limpar a pele abdominal do mouse com etanol a 70%.
    Nota: A esterilidade não é necessário nas etapas a seguir.
  3. Beliscar e levantar a pele abdominal usando pinça dente de rato.
  4. Fazer uma incisão através da pele e da parede abdominal, 2 a 4 cm, verticalmente, do outro lado da linha mediana do abdômen com uma tesoura cirúrgica.
  5. Expor o abdome e remover os cornos uterinos da mãe com fórceps vasos sanguíneos de corte ao longo da curvatura interna do útero com uma tesoura cirúrgica.
  6. Remover a sequência de caracteres de embriões e transferi-lo para um prato de Petri no gelo contendo 10 mL gelada 0,01 M tampão fosfato salina pH 7,4 (PBS).
  7. Disse cuidadosamente os embriões para fora do útero sob um estereomicroscópio em uma placa de Petri com 10 mL de PBS gelado fresco. Segure a parede muscular com fórceps dos relojoeiros para expor o saco amniótico e então rasgar a membrana amniótica para remover o embrião fechado e o saco vitelino, usando as pontas da pinça.
  8. Coletar os embriões littermate de ratos grávidos em estágios iniciais (a partir de 8.5 para E12.5) (Figura 2).
  9. Transferir os embriões para um prato fresco com 10ml frio 1X PBS usando fórceps curvo ou, muito pequenos embriões (8.5-E9.5), usar pipetas de transferência plástico para coletar as amostras sem danos de embrião.
  10. Antes de iniciar a fixação, tirar uma amostra embrionária em um tubo de microcentrifugadora para a genotipagem cortando um pequeno pedaço do embrião ou levando a membrana amniótica nos menor dos seus embriões (8.5 para E9.5) com fórceps dos relojoeiros.
    Nota: Genotipagem LacZ é determinada pelos iniciadores de reação em cadeia (PCR) polimerase: avanço, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; reversa, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fixação dos embriões do rato

  1. Transferi cada embrião para um tubo de microcentrifugadora de 2 mL com uma base arredondada contendo 1 mL 1X PBS.
    Nota: Execute todas as etapas do protocolo nesses tubos com agitação, utilizando um agitador de rolamento.
  2. Lave os embriões em PBS 1x por 1 min à temperatura ambiente para eliminar o sangue restante. Uso de pipetas de transferência plástica para alterar líquidos nos tubos.
  3. Corrigi o embrião em 1 mL de 0,125% de glutaraldeído no gelo.
    Nota: O tempo de fixação depende do tamanho do embrião: 20 min para 8.5-E9.5 embriões, 30 min para embriões E10.5 e 1h para E12.5 embriões.
  4. Retire o fixador e lave os embriões em 1X PBS duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente antes de processar a amostra para coloração X-gal.

3. toda montagem β-galactosidase histoquímica de embriões do rato

  1. Buffer de preparar X-galão enxaguar e solução de coloração X-Gal antes de iniciar o procedimento (ver tabela 1 e Tabela de materiais). Use um embriões de littermate do selvagem-tipo (WT) como controles negativos para a reação enzimática.
  2. Incube os embriões no buffer X-galão enxaguar por 10 minutos em temperatura ambiente (Figura 2).
  3. Incube os embriões na solução de coloração X-Gal de 2h durante a noite a 37 ° C, protegido da luz. Monitore a reação de cor periodicamente através de um microscópio de dissecação até intensidade suficiente de coloração azul é observada sem o fundo no embrião. Manter o pH da solução entre 8 e 9 para reduzir a fundo durante toda a mancha. Se a solução de coloração começa a virar luz, substituí-lo com solução de substrato fresco para ampliar a reação enzimática.
  4. Pare a reação quando o sinal desejado é obtido por lavagem embriões em um tubo de microcentrifugadora com 1 mL 1X PBS duas vezes por 10 min à temperatura ambiente.
  5. Transferir os embriões manchados de paraformaldeído 4% de 1 mL (PFA) re-corrigi-los, durante 1 h durante a noite a 4 ° C.
    Nota: Os embriões podem ser armazenados em 4% PFA/PBS para tempos mais longos, a 4 ° C ou pode ser processada imediatamente para a corte. Essa etapa final da fixação é crucial para a conservação a longo prazo do padrão de coloração.
  6. Lave os embriões em 1 mL 1X PBS duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  7. Opção 1: Limpar os embriões por imersão em uma série de soluções com concentrações crescentes de glicerol (20%, 40%, 60% e 80% de glicerol em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente em cada solução.
    Nota: Lave os embriões em 80% de glicerol para tempos mais longos, até mesmo dias, até que eles são limpas e em seguida, armazene-os em 80% de glicerol a 4 ° C, a esta etapa (Figura 2). Adicionando uma quantidade muito pequena de cristal de ora de azida de sódio de timol para os embriões armazenados a 4 ° C em glicerol ou 1X PBS é recomendado para evitar o crescimento de molde. Após limpeza, embriões de montagem inteira podem ser usados para fotografar (passo 4).
  8. Opção 2: Processo de embriões para parafina incorporação e corte usando um micrótomo (Figura 2). Documente o padrão de expressão em toda manchados embriões antes de seccionamento (passos 4 e 5).

4. fotografia de toda montagem de embriões

  1. Para fotografar o monte todo manchado embriões antes da corte, transferi-los para um prato de Petri preparada com uma base de solidificou-se 1-2% de agarose em 1X PBS.
  2. Cobrir o embrião completamente com 10 mL 1X PBS nos pratos agarose-revestido para evitar desidratação e reflexão enquanto fotografa através do líquido.
  3. Oriente o embrião imergido em 1X PBS usando fórceps. Para os mais antigos embriões (E10.5-E12.5), faça um pequeno furo no agarose com pinças para colocar e posicionar a amostra dentro dele, em ângulos diferentes e para evitar a livre flutuação durante a fotografia.
  4. Coloque o prato no palco estereomicroscópio, usando a luz transmitida (fase Under). Mudar entre o 'campo escuro' e ajustes 'brilhante-campo' para definir a iluminação desejada durante a fotografia e para otimizar a translucidez da amostra.
    Nota: Uso da fibra óptica iluminação para fase posterior embriões evitar a reflexão na superfície do embrião. Quando fotografar embriões limpos, siga o mesmo procedimento mas transferi-los para uma placa de Petri contendo 100% de glicerol e imergi-los completamente.

5. parafina incorporação e seccionamento de X-galão manchado de embriões

  1. Incorporação de cera de parafina
    1. Remover o X-gal manchado embriões a partir de 4 ° C (passo 3.5) e lave-os com 1 mL 1X PBS três vezes para eliminar o excesso de fixador.
    2. Transferi cada embrião para uma gaveta de histologia usando fórceps.
    3. Coloque as fitas contendo os embriões em um copo e depois desidrata-se, passando-os através de uma série gradual do etanol na temperatura de quarto: etanol a 70%, uma vez por 30 min; etanol a 96%, duas vezes por 30 min cada; 100% de etanol, duas vezes por 30 min cada.
      Nota: Os embriões podem ser armazenados em etanol a 70% por um tempo indeterminado a 4 ° C até iniciar o processo de desidratação.
    4. Incube a gaveta inteira em isopropanol por 30 min à temperatura ambiente.
    5. Com o uso de fórceps, transferir as fitas para um vidro de coloração calha contendo isopropanol previamente aquecido e deixar na estufa a 60 ° C por 30 min.
    6. Coloque as fitas em um vidro novo coloração calha contendo uma mistura de isopropanol 50% / 50% derreteu a cera de parafina e deixe por 4 horas em um forno de 60 ° C.
    7. Incube as fitas com os embriões com duas mudanças de cera de parafina derretida, 30 min a 60 ° C.
    8. No final da lavagem final de parafina, abrir a gaveta e transferir cada embrião para um tecido separado incorporação molde para exibir a amostra sob um estereomicroscópio.
    9. Encher o poço com cera de parafina fundida a 60 ° C. Use pinça aquecida para manter a cera derretida e orientar cuidadosamente o embrião no molde.
      Nota: A orientação adequada da amostra é uma etapa crítica para secionar o embrião no plano desejado.
    10. Antes parafina solidifica no molde, coloque uma fita sem a tampa na parte superior do bloco e preenchê-lo com cera de parafina derretida. Deixe arrefecer o restante da cera até que solidificou a noite à temperatura ambiente.
    11. Uma vez que a parafina é completamente solidificada, remover o bloco sólido do molde e armazenar os blocos de parafina ou à temperatura ambiente ou a 4 ° C até14de seccionamento.
  2. Corte de parafina
    1. Orientar a lâmina sobre o micrótomo e configurar 5-7 µm de espessura. 5.2.2. esfriar o bloco de parafina no gelo e aparar para produzir um cubo ou uma pirâmide.
    2. Coloque o do titular do micrótomo, usando uma pequena quantidade de cera derretida.
    3. Oriente o bloco para o corte ideal. Os blocos de parafina em 5-7 µm de espessura em temperatura ambiente usando padrão micrótomo de seção.
    4. Usando um pincel fino, coloca as seções em um banho de água à temperatura ambiente para manipulação e seleção de fatias.
    5. Buscar em seções do banho de água com uma lâmina de microscópio e transferi-los para um banho-maria a 42 ° C para alongamento.
    6. Remover seções do banho e gentilmente colocá-los em corrediças do microscópio de adesão.
    7. Secar as lâminas bem em estufa a 37 ° C durante a noite para permitir que as seções de aderir completamente, caso contrário, eles podem se perder durante a coloração.
      Nota: Guarde os slides a 4 ° C até iniciar procedimentos de coloração.
  3. Deparaffinization e Counterstaining de cortes de parafina X-Gal-manchado
    1. Coloque os slides em uma bandeja de lâmina de microscópio em estufa a 60 ° C durante pelo menos 45 min fazer a cera de parafina mais fluido.
    2. Transferir os slides em um rack e usar vidro, pratos de coloração para executar as seguintes etapas: submergir o rack nos potes de coloração álcoois de diminuir as concentrações de parafina completa remoção e hidratação dos tecidos: isopropanol durante 5 min à 60 ° C; isopropanol para 3 min; 100% de etanol por 2 min; etanol a 96% para 1 min; etanol a 70% por 1 min à temperatura ambiente.
    3. Enxague as seções em água destilada duas vezes para ter certeza de que não se encontram álcool.
    4. Counterstain seções com uma mancha (por exemplo, solução de vermelho de Nuclear-Fast) por 5 min (geralmente entre 3-8 min) à temperatura ambiente (Figura 2).
      Nota: Esta coloração ajuda a revelar a estrutura geral do tecido nas seções.
    5. Depois da coloração, lavar as lâminas em água destilada por 1 min e verifique a seção coloração no microscópio.
      Nota: Se a coloração desejada é muito fraca, corante de contraste das seções novamente por mais tempo.
    6. Desidrata-se seções na série seguinte com concentrações crescentes de etanol: duas lavagens em etanol a 95% por 2 min cada, dois lava em etanol 100% por 2 min cada, e, para evitar a dissolução do azul cor precipita-se, apenas uma lavagem rápida em xilol.
    7. Remover as lâminas de um rack e colocá-los em um pedaço de papel. Em seguida, monte e lamela cada deslize usando um meio de montagem sintética, permanente.
      Nota: O xileno é um produto inflamável, cujos vapores são irritantes e nocivas para a saúde humana e para os organismos aquáticos. Tem de ser manipulada dentro de uma capa e requer o uso de equipamento de proteção adequado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Aqui nós mostramos os resultados da aplicação do protocolo padrão para a reação de β-galactosidase histochemical usando X-galão como substrato em embriões de rato inteiro (Figura 1 e Figura 2). Usando este protocolo, podemos examinar a membrana tipo 4-matriz de metaloproteinase (mmp-Mt4) expressão em diferentes fases do desenvolvimento embrionários (E9.5, E11.5 e E12.5) usando Mt4-mmp ratos mutantes que expressam o rep...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O gene LacZ Escherichia coli tem sido amplamente utilizado como um repórter em estudos de padrões de expressão de gene, devido à sua alta sensibilidade e facilidade de deteção. O presente protocolo descreve um método clássico para detectar a expressão de β-gal, baseado em uma reação enzimática que é fácil e rápido para executar, bem como o baixo custo. Esse método pode ser aplicado também sem grandes modificações em embriões de toda montagem, órgãos intactos, seções do criostato do tecid...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro concorrente.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer o serviço histopatológico para sua assistência técnica com o Centro Nacional de investigações Cardiovasculares (CNIC). Também agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para fornecer gentilmente Mt4-mmpLacZ ratos e Dr. Alicia G. Arroyo para apoiar nosso projeto e para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer Peter Bonney para revisão deste artigo. Este trabalho foi apoiado pela Universidad Europea de Madrid por meio de uma subvenção (# 2017UEM01) atribuída a C.S.C

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
2-PropanolSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting mediumVECTOR LABSH-5501
Synthetic mounting mediaMERCK100579
96% EthanolPROLABO20824365
99.9% Ethanol absoluteSCHARLAUET00021000
50% Glutaraldehyde solutionSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85% GlycerolMERCK104094
99.9% GlycerolSIGMA-ALDRICHG5516
Magnesium chloride hexahydrateSIGMA-ALDRICH63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Nuclear Fast Red counterstainSIGMA-ALDRICHN3020
Paraffin pastillesMERCK111609
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICH158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Potassium ferrocyanateMERCK1049840500
Potassium ferrocyanideMERCK1049731000
Sodium azideSIGMA-ALDRICHS8032
Sodium deoxycholateSIGMA-ALDRICH30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSIGMA-ALDRICH106346
Sodium phosphate dibasic dihydrateSIGMA-ALDRICH71638
ThymolSIGMA-ALDRICHT0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
XyleneVWR CHEMICALSVWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mmSAKURA4566
Rotatory MicrotomeLeicaRM2235
CassettesOxford TradeOT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mmVWRECN631-1575
Microscope slidesThermo Scientific, MENZEL-GLÄSERAGAA000001#12E
Adhesion microscope slidesThermo Scientific, MENZEL-GLÄSERJ1820AMNZ
Flotation Water bathLeicaHI1210
Disposable Low Profile Microtome BladesFeatherUDM-R35
Paraffin ovenJ.R. SELECTA2000205
Wax Paraffin dispenserJ.R. SELECTA4000490
StereomicroscopeLeicaDM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mLSIGMA-ALDRICHT2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLSIGMA-ALDRICHT9661
Orbital shakerIKA LabortechnikHS250 BASIC
Stirring Hot PlateBibbyHB502
Vortex ShakerIKA LabortechnikMS1
Laboratory scaleGRAMFH-2000
Precision scaleSartoriusISO9001
pHmeterCrisonBasic 20
Optic fiberOptechPL2000

Referências

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Biologia do desenvolvimentoquest o 136LacZgalactosidaseseccionamento de parafinadesenvolvimento de ratoesclarecimento embrion rioexpress o g nica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados