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Resumo

Um sistema hidropónico simples, versátil e baixo custo em vitro foi otimizado com sucesso, possibilitando experiências em grande escala, sob condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em uma solução e sua eficiente absorção pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicas e fisiológicas.

Resumo

Uma vasta gama de estudos em biologia vegetal são executadas utilizando culturas hidropônicas. Neste trabalho, é apresentado um sistema hidropônico crescimento em vitro concebido para avaliar as respostas de fábrica de produtos químicos e outras substâncias de interesse. Este sistema é altamente eficiente na obtenção de mudas saudáveis e homogêneas do C3 e C4 modelo espécies Arabidopsis thaliana e Setaria viridis, respectivamente. O cultivo estéril evita algas e contaminação de microorganismos, que são conhecidos fatores limitantes para o crescimento normal da planta e desenvolvimento em hidroponia. Além disso, este sistema é escalável, permitindo a colheita de material vegetal em grande escala com pequenos danos mecânicos, bem como a colheita de peças individuais de uma planta, se desejado. Um protocolo detalhado, demonstrando que este sistema tem uma montagem fácil e de baixo custo, como ele usa a pipeta cremalheiras como a plataforma principal para o cultivo de plantas, é fornecido. A viabilidade deste sistema foi validada utilizando mudas de Arabidopsis para avaliar o efeito da droga AZD-8055, um inibidor químico do alvo da rapamicina (TOR) quinase. Inibição de TOR eficientemente foi detectada logo em 30 min depois de um tratamento de AZD-8055 em raízes e brotos. Além disso, plantas de AZD-8055-tratados exibido o fenótipo de amido-excesso esperado. Propusemos este sistema hidropónico como um método ideal para pesquisadores de planta com o objetivo de monitorar a ação da planta indutores ou inibidores, bem como avaliar fluxos metabólicos usando isótopos-rotulagem compostos que, em geral, requer o uso de caro reagentes.

Introdução

As vantagens de crescer plantas usando hidroponia tem sido amplamente reconhecidas na produção de plantas grandes e uniformes, possibilitando experiências reprodutíveis1,2,3. Neste sistema, a composição da solução nutritiva pode ser adequadamente controlada e reciclada ao longo de todas as fases de desenvolvimento e crescimento das plantas. Além disso, as raízes não estão sujeitos ao estresse abiótico, como pode acontecer em plantas de solo cultivado, como nutriente fome e água deficiência4. Como as plantas crescidas hydroponically presentes morfológicas e fisiológicas características bastante semelhantes da cultivadas no solo, este sistema tem sido amplamente empregado em pesquisa porque permite o acompanhamento do crescimento da raiz/fotografar e sua colheita sem lesões de2,5.

Devido à possibilidade de alterar a composição e a concentração da solução nutritiva, a maioria da pesquisa usando condições hidropônicas tem sido realizado para caracterizar as funções de micro e macronutrientes1,3 ,6,7,8. No entanto, este sistema provou para ser muito útil para uma ampla gama de aplicações em biologia vegetal, tal como para elucidar as funções dos hormônios e substâncias químicas em plantas. Por exemplo, a descoberta de estrigolactonas como uma nova classe de hormônios9 e o fenótipo de crescimento acelerado, desencadeada por brassinosteroid aplicação10 foram realizadas em condições hidropônicas. Além disso, este sistema permite experimentos com isótopos rotulados (por exemplo, 14N /15N e 13CO2)11,12 , para avaliar sua incorporação de proteínas e metabólitos por espectrometria de massa.

Considerando a importância deste sistema na pesquisa da planta, foi projetado um elevado número de culturas hidropônicas nos últimos anos, incluindo sistemas que usam a (i) a transferência de mudas de placas para recipientes hidropônico3, 13; (ii) rockwool que limita o acesso aos estágios iniciais de desenvolvimento do raiz2,14,15; (iii) polietileno granulado como o corpo flutuante, o que torna a aplicação homogênea de pequenas moléculas/tratamentos difíceis16; ou (iv) um reduzido número de plantas9,17. O volume dos tanques hidropônicos descrito em muitos desses protocolos são geralmente grandes (pequenos volumes que variam de 1 a 5 L, até 32 L)18, que faz a aplicação de produtos químicos extremamente caro. Embora alguns estudos descrevem um cultivo hidropônico sob condições assépticas8,19, a montagem do sistema é geralmente bastante trabalhoso, consistindo o ajuste perfeito de malhas de nylon em plástico ou vidro recipientes de5,8,17,20.

Devido à importância de Arabidopsis thaliana como uma planta modelo, a maioria dos sistemas de hidroponia foram projetada para esta espécie1,2,8,14,18, 19 , 20. no entanto, existem poucos estudos relatando as características de crescimento hidropônico de outras espécies de plantas com um pré-tratamento de sementes para melhorar sua germinação e taxas de sincronização em vitro8,16 . Para trabalhar em grande escala, desenvolvemos um protocolo para a criação de um sistema hidropónico manutenção simples e de baixo custo que permite condições estéreis para o cultivo de plantas, incluindo a. thaliana e outras espécies, como a grama Setaria viridis. O método descrito aqui é apropriado para experiências diferentes, como o crescimento do seedling pode ser maximizado, sincronizado e facilmente controlado. Além disso, este sistema tem muitas vantagens como: (i) a sua montagem é simples e seus componentes podem ser reutilizados; (ii) permite a fácil aplicação de produtos químicos diferentes para o meio líquido; (iii) as mudas germinam e crescem diretamente no meio de cultura sem a necessidade de transferência para o sistema de hidroponia; (iv) o desenvolvimento/crescimento atirar e raiz pode ser estreitamente vigiado e as mudas são colhidas sem danos; e (v) torna possível trabalhar em grande escala, mantendo condições fisiológicas.

Protocolo

1. preparação de meios de cultura líquidos e sólidos

  1. Preparar um meio líquido, usando o meio de Murashige e Skoog (MS) de meia-força com vitaminas [0,0125 mg/L de cloreto de cobalt(II) penta-hidratado, 0,0125 mg/L de sulfato de cobre (II) penta-hidratado, 18,35 mg/L de sódio férrico de tetrassódio, 3,10 mg/L de ácido bórico, 0,415 mg/L de iodeto de potássio, 8,45 mg/L de manganês sulfato monohidrato, 0,125 mg/L de molibdato de sódio di-hidratado, 4,30 mg/L de sulfato de zinco hepta-hidratado, 166,01 mg/L de cloreto de cálcio, 85 mg/L de dihidrogenofosfato de potássio, 950 mg/L de nitrato de potássio, 90,27 mg/L de sulfato de magnésio, 825 mg/L de nitrato de amónio, 1 mg/L de glicina, 50 mg/L de mio-inositol, 0,25 mg/L de ácido nicotínico, 0,25 mg/L de cloridrato de piridoxina e 0,05 mg/L de cloridrato de tiamina] suplementado com 0,25 g/L de MES e ajustar o pH a 5.8 com 10 M de KOH.
  2. Adicione 10 g/L de agar para fazer um meio de MS-sólido de meia-força. Autoclavar o meio a 121 ° C durante 20 min antes de usar.

2. hidropônico sistema de montagem

Nota: Estas etapas devem ser seguidas meticulosamente para construir o sistema hidropônico.

  1. Esterilização de material
    1. Embale no saco de autoclave a ponta da pipeta racks (sem capas) que serão usados como minitanks. Autoclave os racks a 121 ° C por 20 min, 15 libras por polegada quadrada.
      Nota: O rack de ponta de pipeta polipropileno usamos tinha as seguintes dimensões: 120 mm (comprimento) x 89 mm (largura) x 55 mm (altura). A superfície plana de ponta de pipeta deve ter uma área para a adição de meio de cultura. Outras cremalheiras de ponta podem ser usadas (ver Tabela de materiais).
      Nota: Durante todo o procedimento de montagem do sistema hidropônico, é necessário usar uma capa de fluxo laminar, que deve ser limpos e desinfectada com prévio de 70% de etanol para usar. O experimentador deve vestir um jaleco, lavam as mãos e qualquer expostas da pele e desinfete-os com etanol a 70%. As luvas são opcionais, exceto para a aplicação da droga.
    2. Limpe todos os acessórios descritos acima (caixas de plástico descartáveis, fita adesiva, pipetas, tesoura e pinça) com etanol a 70% antes de entrar o capuz de fluxo laminar. Se o capô permite, acenda a luz de UV para 10 min antes da montagem do sistema hidropônico para manter a área de trabalho descontaminada.
  2. Minitank montagem
    1. Sele a superfície superior da ponta da pipeta, plana, com fita adesiva (figura 1B). Se possível, deixá-lo sob UV luz por 10 min.
    2. Adicione 180 µ l de derretido meio de cultura MS sólido (morno) a cada poço usando uma pipeta multicanal (Figura 1).
      Nota: Ao preparar muitos tanques, use uma placa de aquecimento para impedir a solidificar o meio MS.
    3. Permita a médio e a solidificar completamente (por cerca de 30 min).
      Nota: Durante o período de solidificação, a luz UV pode ser girada sobre.
    4. Encher o rack de ponta de pipeta completamente com meio de cultura líquido MS (Figura 1) e garantir que não há contato entre o sólido e o meio líquido.
    5. Retire as fitas adesivas da superfície superior da ponta da pipeta plana e enquadrá-la na grelha com cuidado. O sistema hidropônico está agora pronto para receber as sementes esterilizadas.

3. semente esterilização

  1. Coloque 500 sementes de Arabidopsis em um microtubo de 1,5 mL. Uso como muitos microtubos conforme necessário de acordo com o número de plantas necessário para o experimento.
  2. Lave as sementes com etanol a 70% por 2 min com uma agitação suave. Deixe as sementes acalmem-se, em seguida, remover o etanol com cuidado.
  3. Adicione 1 mL de uma solução de hipoclorito de sódio 10% contendo 2 µ l de um detergente de polissorbato 20. Agite a solução durante 5 min. remover a solução cuidadosamente.
  4. Enxague as sementes com água destilada estéril até que todo o resíduo de água sanitária é completamente removido (cerca de 5x).
    Nota: Após a esterilização de superfície, as sementes foram imersas em água destilada estéril e estratificadas a 4 ° C, no escuro para a 5D sincronizar a germinação.
    Nota: As sementes de Setaria viridis (adesão A10.1) foram pré-incubada em ácido sulfúrico concentrado por 15 min (quebrar a dormência física), lavadas em água destilada estéril e então desinfestadas com solução de hipoclorito de sódio a 5% contendo 0,1% polissorbato 20 por 5 min com uma agitação suave21. As etapas restantes de esterilização foram idênticas às descritas para as sementes de Arabidopsis .

4. semente aplicação

  1. Corte um pouco a extremidade de uma dica de 200 µ l, com o auxílio de um bisturi estéril.
  2. Pipete as sementes de Arabidopsis para o meio de cultura sólido na superfície superior da ponta da pipeta plana. Cuidar para que o meio não se solta do apartamento; caso contrário, as sementes serão sombreadas e as mudas não crescerá corretamente (Figura 1E).
    Nota: Utilize uma pinça estéril para sementes de Setaria (com o embrião posicionado para cima).
  3. Loja minitanks tantos quanto possível dentro de uma caixa de plástico descartável para manter uma alta umidade e manter o ambiente livre de microorganismos (Figura 1F).
  4. Sele a caixa plástica descartável completamente usando fita adesiva para evitar a contaminação.
  5. Coloque os sistemas hidropônicos em uma câmara de crescimento com as condições adequadas de crescimento para a planta de interesse.
    Nota: Neste trabalho, as seguintes condições foram utilizadas: 75% de umidade e 150 µmol m-2 s-1 de irradiância e equinoctial condições de luz de 12 h (21 ° C) / 12h escuro (19 ° C) de Arabidopsis, ou 300 µmol m-2 s-1 de irradiância e 12 h luz (28 ° C) / 12h escuro (25 ° C) para Setaria (Figura 1 e 1 H).

5. validar o uso deste sistema hidropônico para inibir o alvo de rapamicina quinase

Nota: Este sistema hidropônico foi inicialmente desenvolvido para facilitar a gestão dos produtos químicos às plantas, que, em geral, são muito caros ser aplicado em experimentos em grande escala. Como uma prova de conceito, o inibidor competitivo ATP AZD-8055, que é conhecido para alvejar especificamente o sítio de ligação do ATP do TOR proteína quinase22, foi contratado para seguir a repressão da atividade TOR em mudas da . thaliana Columbia-0 ( O centro de estoque de Arabidopsis Nottingham, NASC ID: N22681). Aqui, o protocolo usado é brevemente descrito.

  1. Cresce sementes hydroponically até palco 1,04 de acordo com o BBCH escala23 (para cerca de 11 d) sob as condições climáticas acima descritas. Substituir a solução nutriente, seja com fresco médio contendo 0.05% DMSO (controle), 2 µM AZD-8055 (inibidor de TOR) diluído em DMSO, ou sem tratamento (simulação), no final da noite (pt).
  2. Colher algumas mudas em pontos diferentes de tempo após o tratamento e separá-los em raízes e brotos. Congelar as amostras em nitrogênio líquido, triturá-los a um pó fino em um moedor de robótico (ver Tabela de materiais) e armazenar o pó a-80 ° C até o uso.
  3. Immunoblot contra fosforiladas e não-fosforilada formas de 40S proteína ribosomal S6 (RPS6) de acordo com Dobrenel et al . 24.
  4. Bleach mudas intactas para despigmentação de amostra, lavar em água destilada, mergulhe-os em uma solução de iodo por 5 min25e fotografar as mudas em um estereomicroscópio (0,63 X objetivo, a aproximação de x 20 e a magnitude de x 7,5) para um avaliação qualitativa do teor de amido.
  5. Quantificar o amido após a degradação enzimática e a medição da glicose liberada por espectrometria por acoplamento-lo para a redução do NADP+ a NADPH26,27.
  6. Realizar uma extração de RNA total, uma síntese do cDNA, e ensaios de RT-PCR quantitativo, conforme descrito por Caldana et al 28 para avaliar o nível de expressão de genes relacionados com os diferentes tipos de tensões.
  7. Opcionalmente, cultivar mudas em um substrato hortícola em potes de plástico com uma capacidade de 0,1 L sob condições climáticas similares [60% de umidade, 150 µmol m-2 s-1 de irradiância e equinoctial condições de luz de 12 h (21 ° C) / 12h escuro (19 ° C )] para compará-los com mudas crescidas hydroponically.
    Nota: Os genes alvo utilizados para os ensaios de expressão do gene foram ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), e TPS5 (At4g17770) e seus níveis de expressão foram normalizados empregando o método delta-Ct29 usando ACT2 (At3g18780) ou PDF2 (At4g04890) como os genes de referência interna, assumindo 100% de eficiência de amplificação do PCR em todas as amostras. Os pares do oligonucleotide usados para o PCR quantitativo foram: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) e PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Resultados

A quinase TOR é um regulador importante que integra os nutrientes e energia sinalização para promover a proliferação celular e crescimento em todos os eucariontes. Esforços para elucidar as funções TOR em plantas incluem a geração de Arabidopsis linhas transgénicas contendo repressão condicional do TOR através da interferência do RNA ou artificial microRNA28,30,31, dado o f...

Discussão

Essa estrutura hidropônica otimizada permite a cultura de sucesso em vitro de plantas. As sementes germinam bem sobre o meio sólido na superfície plana de ponta de pipeta, um ganho considerável em comparação com sistemas onde as sementes estão encharcadas com a solução nutriente. Uma grande vantagem deste sistema é que durante o desenvolvimento das mudas, raízes diretamente em contato com o meio líquido sem a necessidade de transferência. Além disso, tratamento químico pode ser facilmente aplicado...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa de São Paulo (FAPESP; Conceder 12/19561-0) e a sociedade Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), e Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) é grato para as bolsas. Os autores agradecer Christian Meyer do Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, França) generosamente fornecendo anticorpos contra RPS6. Os autores agradecer RTV UNICAMP e Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza, pelo apoio técnico durante o áudio de gravação.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolMerck100983
Sodium hypochlorite solutionSigma-Aldrich425044
Polysorbate 20  Sigma-AldrichP2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrateDuchefa BiochemieM1503
Agar Sigma-AldrichA7921
Potassium hydroxideSigma-Aldrich484016
Laminar flow hoodTelstarBH-100
HotplateARECF20510011
Growth chamberWeiss TechnikHGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 μL pipette tip racks KasviK8-200-5 *
300 μL multichannel pipetteEppendorf3122000060
300 μL pipette tipsEppendorf30073088
200 μL pipette Eppendorf3120000054
200 μL pipette tipsEppendorf30000870
ScissorsTramontina25912/108
TweezerABC Instrumentos702915
Scalpel bladeSigma-AldrichS2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m)Scotch 3M5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H)Maxipac32771

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