Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

Resumo

Apresentamos um modelo de câncer de mama murino ortotópico e modelo de mastectomia radical com tecnologia de bioluminescência para quantificar a carga do tumor para imitar a progressão do câncer de mama humano.

Resumo

Modelos de rato in vivo para avaliar a progressão do câncer de mama são essenciais para pesquisa do câncer, incluindo o desenvolvimentos de drogas pré-clínicos. No entanto, a maioria dos detalhes práticos e técnicos é comumente omitida em artigos publicados e que, portanto, torna difícil reproduzir os modelos, particularmente quando envolve técnicas cirúrgicas. Tecnologia de bioluminescência permite para a avaliação de pequenas quantidades de células de câncer, mesmo quando um tumor não é palpável. Utilizando as células cancerosas do luciferase-expressando, estabelecemos uma técnica de inoculação ortotópico de cancro da mama com uma taxa elevada de tumorigênese. Metástase pulmonar é avaliada utilizando uma técnica ex vivo . Nós, então, estabelecer um modelo de mastectomia com uma taxa baixa de recorrência local para avaliar a carga de tumor metastático. Aqui, descrevemos, em pormenor, as técnicas cirúrgicas de implantação ortotópico e mastectomia por câncer de mama, com uma taxa elevada de tumorigênese e taxas de recidiva local baixo, respectivamente, para melhorar a eficiência de modelo de câncer de mama.

Introdução

Modelos animais desempenham um papel chave na investigação do cancro. Quando uma hipótese é comprovada in vitro, devem ser testado in vivo para avaliar a sua relevância clínica. Metástase e progressão de câncer muitas vezes melhor capturados por modelos animais em comparação com modelos in vitro, e é essencial para testar uma nova droga em um modelo animal, como um estudo pré-clínicos para desenvolvimento de drogas^1,2. No entanto, os detalhes técnicos das experiências com animais muitas vezes não são bem descritos em artigos publicados, tornando-se desafiador para reproduzir o modelo com sucesso. Com efeito, os autores que criaram estes modelos de inoculação e mastectomia ortotópico passaram longos e rigorosos processos de tentativa e erro. A taxa de sucesso de tumorigênese após inoculação de células de câncer é um dos fatores-chave para determinar o sucesso e a eficiência de um animal estudo³. A linha de celular e o número de células para inocular, local de inoculação e a tensão dos ratos são fatores importantes. É sabido que existem enormes variações nos resultados das experiências com animais devido às diferenças individuais, em comparação com técnicas in vitro. Portanto, usar um modelo bem estabelecido com uma norma técnica é importante para obter resultados estáveis, para melhorar a eficiência das experiências com animais e para evitar resultados enganosos.

Este documento fornece técnicas bem estabelecidas⁴ para gerar modelos de rato mama câncer ortotópico e mastectomia. Os objectivos destes métodos são 1) para imitar a progressão do câncer de mama humano e cursos de tratamento e 2) para conduzir experimentos in vivo com maior eficiência e maiores taxas de sucesso em comparação com outra inoculação de câncer de mama ou técnicas de mastectomia. Em ortotópico inoculação de células de câncer, para imitar a progressão do câncer de mama humano, nós escolhemos a almofada de gordura mamária #2 como um site de inoculação, que está localizado no peito. Na maioria dos estudos, células de câncer de mama são inoculadas subcutaneamente⁵. Esta técnica não requer cirurgia e, assim, é simples e direta. No entanto, o microambiente subcutâneo é bastante diferente do microambiente da glândula mamária, o que resulta na progressão do câncer diferentes e perfis molecular até^6,7. Alguns estudos utilizam a glândula mamária #4, que está localizada no abdômen, como um local de inoculação⁶. No entanto, uma vez que as glândulas mamárias #4 estão localizadas no abdômen, o padrão mais comum de metástase é Carcinomatose peritoneal⁷, que ocorre com menos de 10% do câncer de mama metastático⁸. Câncer de mama, gerado pela técnica apresentada aqui, na glândula mamária #2, metastatiza para o pulmão, que é um do mais comum da mama câncer metastático sites⁹.

Com esta técnica, o objetivo é também alcançar uma maior taxa de tumorigênese com variabilidade de tamanho de tumor mínima em comparação com outras técnicas de inoculação de câncer de mama. Para isso, células cancerosas, suspendidas em uma mistura gelatinosa da proteína são inoculadas sob visão direta através de uma incisão da parede torácica anterior mediana. Esta técnica produz uma taxa alta de tumorigênese com menor variabilidade no tamanho do tumor e a forma em comparação com injeção subcutânea ou não-cirúrgicos, como relatado anteriormente^3,7.

Também apresentamos uma técnica de mastectomia radical de rato em que o tumor de mama ortotópico é ressecado com os tecidos circundantes e linfonodos axilares. Na prática clínica, o padrão de atendimento para pacientes de câncer de mama sem doença metástase é mastectomia^10,11. Antes de uma mastectomia, metástase linfonodal axilar é pesquisado por biópsia de linfonodo sentinela e imagens. Se não há nenhuma evidência de metástase linfonodal axilar, o paciente é tratado então com uma mastectomia total ou parcial, em que a ressecção linfonodal axilar é omitida. Mastectomia total é uma técnica de ressecção em bloco, o câncer de mama com o tecido do peito inteiro enquanto mastectomia parcial é a ressecção de câncer de mama, com uma margem de tecido mamário normal apenas, assim conservando o restante tecido mamário normal na paciente. No entanto, pacientes que preservar o restante tecido mamário normal após uma mastectomia parcial requerem radioterapia pós-operatória, para evitar a recorrência local¹⁰. Os pacientes que têm metástase linfonodal axilar realizar mastectomia radical, que remove o câncer de mama com normal todos os seios linfáticos tecido e axilar e invadiram os tecidos pt bloco^10,11. No modelo de rato, vigilância por radiação de metástase e/ou pós operatório linfonodal axilar não é praticável ou razoável. Assim, utilizamos a técnica de mastectomia radical para evitar metástase linfonodal axilar ou local.

Inoculação de células de câncer através da veia da cauda é o mais comum pulmão metástase do mouse modelo¹², o so-called "metástase experimental". Este modelo é fácil de gerar e não requer cirurgia; no entanto, não imitar a progressão de câncer de mama humano que pode resultar em um comportamento diferente de doença metastática. Para imitar o curso de tratamento de câncer de mama humano onde metástase ocorre frequentemente após a mastectomia, o tumor primário é removido após a inoculação de células de câncer ortotópico. Esta técnica produz menos recorrência local em comparação com ressecção simples de tumor, como relatado anteriormente,¹³e é útil para novela terapêutica, estudos pré-clínicos e para estudos de pesquisa do câncer de mama metastático. As técnicas descritas aqui são aplicáveis para a maioria dos experimentos de modelo mama câncer ortotópico. No entanto, é importante considerar que a mistura de proteína gelatinoso pode afetar o microambiente e cirurgia pode afetar a resposta de stress/imunológico¹⁴. Portanto, pesquisadores estudando o microambiente e/ou a resposta imune/stress devem estar cientes do potencial de fatores de confusão.

Protocolo

Aprovação do Comité de uso e Roswell Park abrangente Cancer Center institucional Animal Care obteve-se para todos os experimentos.

Nota: Nove a doze semanas de idade fêmea BALB/c os ratos são obtidos. 4T1-luc2 células, uma rato adenocarcinoma mamário linhagem celular derivada de camundongos BALB/c que foi projetada para expresso do luciferase, são usadas. Estas células são cultivadas em meio de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% de soro fetal bovino (FBS).

1. preparação dos instrumentos

1. Descongele uma mistura congelada proteína gelatinosa (por exemplo, Matrigel) no gelo em uma capa de cultura de tecidos.
2. Limpar e autoclave dois conjuntos de instrumentos cirúrgicos (microdissection tesoura pinça Adson e um porta-agulha) antes da cirurgia. Prepare 5-0 esterilizado suturas de seda e secar esterilizante (quando seriais cirurgias são planejadas).
3. Cortar o cabelo no peito médio dos ratos usando um clipper e marcar os ratos para identificação, perfurando o ouvido antes do momento da cirurgia.
4. Prepare a mesa de procedimento, que pode ser usada imediatamente para a operação.
   1. Espalhar um absorvente e corrigir os cantos com fita, consertar cones de nariz anestesia com fita, coloque esterilizante e desinfetante (Clorexidina, iodo e 75% de etanol), ao lado do espaço de manobra e coloque os ratos em ordem de funcionamento.

2. preparação das pilhas (para 10 ratos)

Nota: As células devem ser inoculadas dentro de 1h após serem soltos do prato para evitar a viabilidade celular diminuída. Especificamente, a suspensão de células deve ser misturada a mistura de proteína gelatinoso dentro de 15min após desanexação das células do prato para manter a sua viabilidade.

1. Cultura de células 4T1-luc2, uma linhagem de células de adenocarcinoma mamário rato expressando luciferase, na mídia RPMI 1640 com 10% FBS numa incubadora umidificado a 37 ° C em 5% CO₂.
2. Lave as células aderentes 4T1-luc2 em um prato de 10 cm com fosfato salino (PBS) utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Adicione 1 mL de tripsina 0,25%, com uma pipeta P1000 e, em seguida, incubar a amostra a 37 ° C por 5 min. Em seguida, adicione 4 mL de mídia de crescimento (RPMI-1640 com 10% FBS) usando um 5ml serológico Pipetar e transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL em uma capa de cultura de tecidos. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 180 x g por 5 min.
3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de PBS; em seguida, conte as células usando o hemocytometer.
4. Suspenda a 2 x 10⁶ células 4T1-luc2 40 μL de frio PBS (pH 7,4, 4 ° C) do bairro de cultura de tecidos.
5. Misture a suspensão de células de 40 μL com 360 μL da mistura gelatinosa da proteína em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo do capuz de cultura de tecidos.
   Nota: A concentração final é 1 x 10⁵20 μL (1:9 PBS: mistura gelatinosa da proteína). Para o modelo ortotópico (sem mastectomia), 1 x 10⁴20 μL da concentração final foi utilizado, para evitar chegar a critérios de eutanásia (tumor tamanho > 2 cm) dentro de duas semanas.

3. inoculação de células de câncer

1. Coloque os ratos na câmara de indução de anestesia com fluxo de oxigênio de isoflurano e 0,2 L/min 2-4%, até os ratos respirar calmamente (2 – 3 min).
2. Segure o mouse e injetar buprenorfina 0,05 mg/kg em seu ombro, por via subcutânea.
3. Confirme a anestesia adequada pela falta de reação a uma pitada de dedo do pé. Inserir o nariz do rato no orifício da máscara do mouse, que permite que a anestesia inalatória com isoflurano 2-4% e 2 L/min de fluxo de oxigênio ligado a uma unidade de cilindro do carvão vegetal.
4. Conter os membros do rato utilizando fita de laboratório e esterilizar sua pele usando clorexidina, iodo e 75% de etanol, usando cotonetes.
5. Faça uma incisão de pele de 5 mm no meio da parede torácica anterior utilizando microdissection estéril tesoura, elevador, o lado direito junto a incisão de pele e retire a pele da parede torácica, usando a tesoura e então, inverta a pele para expor a direita #2 do tecido mamário.
6. Cuidadosamente, injete 20 μL da suspensão de células de câncer usando uma seringa de insulina 1 mL com agulha 28,5 G para a almofada de gordura sob visão direta através da ferida.
   Nota: A agulha atravessa a ferida, não a pele. Mantenha segura a agulha no bloco de gordura para 5 antes de s para puxá-lo para fora, que permite que o tempo para a mistura de proteína gelatinoso para solidificar.
7. Feche as incisões na pele por costura, usando suturas não absorvíveis esterilizados 5-0.
8. Após a cirurgia, devolver os animais para uma gaiola limpa e monitorá-los até que eles se recuperaram e estão movendo-se livremente (depois de ~ 1-2 min). Se um animal não parece estar em boa saúde até 24 horas após cirurgia, administre a buprenorfina (0,2 mg/kg).
9. Remover as suturas sob anestesia (ver passo 3.1) 7D após a cirurgia.

4. mastectomia

Nota: O momento da mastectomia é muito importante. Se for feito muito cedo, metástase pulmonar não ocorre. Se for feito muito tarde, o tumor primário invadiu vasos sanguíneos, que fazem uma completa ressecção oncológica desafiador. Assim, vários pontos de tempo foram testados para mastectomia determinar a qual ponto de tempo produzido o equilíbrio adequado na espera de metástase antes ressecção tornou-se muito desafiador. Depois de fazê-lo em mais de 50 experimentos de rato, demonstrou-se que a mastectomia em 8 dias após a inoculação de células de câncer (ou quando o tamanho do tumor atinge 5 mm) era o ideal tempo pontos para alcançar o equilíbrio¹³.

1. Anestesiar um mouse com 2-4% inalado isoflurano e injetar buprenorfina (consulte as etapas 3.1 e 3.2).
2. Conter o mouse e esterilizar sua pele (ver passo 3.4).
3. Faça uma incisão de pele de 5 mm 2 mm à esquerda da cicatriz cirúrgica que foi feita para a inoculação de células de câncer inicial, usando a tesoura microdissection. Estender a incisão em direção a raiz do membro anterior para remover o tumor, a pele incluindo a cicatriz cirúrgica e a lesão em contato com o tumor, bem como a bacia linfonodal axilar em que na maioria das vezes não visível do linfonodo existe no momento do mastect e¹³. Tenha atenção para não danificar a veia axilar.
4. Feche os defeitos da pele por costura, usando suturas não absorvíveis esterilizados 5-0 em forma de "Y".
5. O mesmo que no passo 3.8, retornar o mouse para uma gaiola limpa e monitor até que eles recuperaram.
6. Remover as suturas sob anestesia (ver passo 3.1) 7 dias após a cirurgia.

5. bioluminescente quantificação do Tumor primário (ortotópico inoculação sem mastectomia) ou metástase pulmonar (modelo de mastectomia)

Nota: Para a quantificação de carga do tumor primário, a bioluminescência é medido 2 x por semana a partir do dia após a inoculação ortotópico. Para a quantificação de metástase pulmonar, a bioluminescência é medido 2 x por semana a partir do dia após a mastectomia.

1. D-luciferina, dissolva em fosfato salino de Dulbecco (DPBS) a uma concentração final de 15 mg/mL em uma capa de cultura de tecidos. Alíquota-a em luz blindado 1,5 mL microcentrifuge tubos. Armazenar a solução diluída a-80 ° C.
   Nota: Para um mouse de 20 g, 200 µ l de D-luciferina diluído é necessária.
2. Abra o software de imagem e clique em inicializar.
   Nota: Demora cerca de 15 min para esfriar o dispositivo de carga acoplada (CCD). Quando o CCD atinge a temperatura programada, a cor da barra de temperatura muda de vermelho para verde.
3. Anestesiar os ratos com 2-4% de isoflurano em uma câmara de indução dedicado antes da imagem latente (ver passo 3.1).
4. Pese os ratos.
5. Injete 150 mg/kg D-luciferina intraperitonealmente no ponto do meio do abdômen, usando uma agulha de 28,5 G.
6. Cabe a cada rato com um cone de nariz dentro do sistema da imagem latente na posição supina (lugar um máximo de cinco ratos ao mesmo tempo). Manter a anestesia no 1-3% de isoflurano (em 100% de oxigênio) através dos cones de nariz durante a imagem latente.
7. Capture uma imagem a cada 5 min para detectar a bioluminescência de pico por 50 min (ou até a bioluminescência pico confirmado).
   1. Selecione a luminescência como Auto, Binning como meioe o campo de visão como D.
   2. Clique em Acquire para capturar a imagem.
8. Retornar os ratos para seus cage(s) e monitorá-los até que eles recuperaram (ver passo 3.8).

6. pulmão metástase Tumor fardo quantificação por Ex Vivo Imaging

Nota: Quantificação de metástase pulmonar é aplicável para inoculação ortotópico com e sem modelos de mastectomia. No modelo de mastectomia, ex vivo de imagem ou sobrevivência observação é escolhida, dependendo da finalidade. No modelo de inoculação (sem mastectomia) ortotópico, a maioria dos casos produzir critérios de eutanásia de tamanho de tumor primário (> 2 cm) aproximadamente 21 dias após a inoculação.

1. Quantificar a lesão metastática pulmonar 21 dias após a inoculação de células de câncer por ex vivo de imagem.
2. Anestesiar os ratos com 2-4% de isoflurano em uma câmara de indução dedicado (ver passo 3.1).
3. Pese os ratos.
4. Injetar 150 mg/kg D-luciferina intraperitonealmente (consulte a etapa 5.6).
5. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical, 15 min após as injeções.
6. Abrir o abdômen, cortando a pele e peritônio, no meio do abdômen, usando curvas tesoura de Mayo. Estenda a incisão para tanto à direita como à esquerda. Retire o fígado com pinça até o diafragma é visualizado; em seguida, corte o diafragma.
7. Usando a tesoura Mayo curva, corte as costelas bilaterais de caudal (12ª costela) para cefálica (1º costelas) para expor os pulmões lançando a parede anterior do tórax.
8. Identificar o esôfago torácico, que se parece com um cabo conectando os pulmões à espinha, levantando os pulmões usando fórceps e, em seguida, corte o esôfago usando a tesoura microdissection.
9. Levantar as bilaterais pulmões e coração usando fórceps (aplicação de tração, puxando para baixo, na direção de cefálica à caudal) e, em seguida, cortar a traqueia e grandes vasos para o ápice do pulmão na cefálica, usando tesouras microdissection.
   Nota: Isto permite o isolamento do pulmão e do coração do corpo.
10. Remova o coração o pulmão usando uma tesoura microdissection.
11. Colocar os pulmões em uma placa de Petri de 10 cm.
12. Capturar a imagem de bioluminescência (consulte as etapas 5.7.1 e 5.7.2) 5 min após eutanásia (20 min após a injeção de luciferina).

Resultados

A finalidade do modelo de ortotópico é imitar a progressão do câncer humano (ou seja, o crescimento do tumor primário seguido por metástase linfonodal e metástases de pulmão então distante)¹⁵. Após a inoculação de células de câncer, a bioluminescência é quantificada regularmente (duas a três vezes / semana) (figura 1A). A bioluminescência nos pulmões é menor do que a lesão primária e mais profundo. A biol...

Discussão

Na última década, temos vindo a estabelecer vários modelos de murino de câncer, incluindo mama câncer modelos^{3,7,13,16,20,21}. Anteriormente, temos demonstrado que a inoculação de ortotópico de células de câncer de mama no tecido da glândula mamária, sob visão direta produziu um tumor maior com menor variabilidade...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture