Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Resumo

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Resumo

Zebrafish embriões são transparentes e desenvolvem rapidamente fora da mãe, permitindo assim excelente na vivo por imagens do processos biológicos dinâmicos em um vertebrado intacto e em desenvolvimento. No entanto, a imagem detalhada das morfologias de tipos distintos de células e estruturas subcelulares é limitada em montagens de toda. Portanto, nós estabelecemos um protocolo eficiente e fácil de usar para as células primárias ao vivo de cultura de embriões de peixe-zebra e tecido adulto.

Em breve, 2 dpf zebrafish embriões são dechorionated, deyolked, esterilizados e dissociado de células únicas com colagenase. Após uma etapa de filtração, as células primárias são banhadas em pratos de vidro inferior e cultivadas por vários dias. Culturas frescas, diferenciada de termo tanto quanto tempo os, podem ser usadas para estudos de imagiologia confocal de alta resolução. A cultura contém diferentes tipos de células, com miócitos estriados e neurônios sendo proeminente no revestimento de poli-L-lisina. Para especificamente rótulo subcellular estruturas por proteínas marcador fluorescente, também estabelecemos um protocolo de eletroporação que permite o transfeccao de Plasmideo DNA em diferentes tipos de células, incluindo neurônios. Assim, na presença do operador definido de estímulos, comportamento complexo celular e dinâmica intracelular de células primárias zebrafish pode ser avaliada com alta resolução espacial e temporal. Além disso, usando o cérebro adulto zebrafish, demonstramos que a técnica de dissociação descrita, bem como as condições básicas de cultivo, também trabalham para tecido adulto zebrafish.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio, d. rerio) é um modelo popular vertebrado para inúmeros campos de pesquisa básica e biomédico¹. Zebrafish embriões se desenvolvem rapidamente ex utero, são transparentes e ajuste sob um microscópio, proporcionando excelentes pré-requisitos para estudar o desenvolvimento de vertebrados em um organismo vivo. Devido a rastreabilidade genética de zebrafish², foram criadas muitas linhas de repórter transgénicos estável com expressão de tipo específico de célula de vários marcadores fluorescentes permitindo a observação de populações de células específicas. A comunidade de zebrafish oferece uma ampla variedade de chamados linhas Gal4-motorista que carregam um transgene expressando o Kal4TA4 sintético (ou o equivalente de KalTA3-GalFF) gene com o domínio de Gal4-DNA-ligando de levedura fundido a ativação transcricional viral domínios sob o controle dos realçadores de tipo específico de célula. Estas linhas de motorista se cruzam linhas de efetor que carregam transgenes consistindo de uma definido upstream ativando sequência (UAS) fundida a um gene repórter. A proteína Kal4TA4 vincula-se ao elemento UAS, ativando assim a expressão seletiva-tipo de célula do gene repórter^3,4. Esta abordagem permite estudos combinatórios altamente diversificados de quase todos os elementos disponíveis enhancer e repórter em animais transgénicos-duplo.

No entanto, imagens ao vivo em profundidade com foco em células individuais ou seus conteúdos subcellular é limitada em um embrião inteiro e constante mudança. Para abordar questões biológicas de célula específica com maior resolução, o uso de culturas de células, muitas vezes é preferível. Existem algumas linhas de célula de zebrafish, mas eles são considerados como altamente selecionado^5,6,7 e sua propagação geralmente é demorada. Além disso, todas as linhas de celular disponíveis são fibroblastos derivados, limitando os experimentos utilizando cultura de células de um tipo de células. Portanto, estabelecemos um protocolo eficiente e fácil de usar para preparar as células primárias diretamente do zebrafish embriões e cérebro adulto zebrafish, juntamente com abordagens para aumentar a longevidade da cultura e ampliar a diversidade de cultivo tipos de células. Além disso, apresentamos um procedimento para transfect embrionário as células primárias com construções de expressão para marcadores fluorescentes organela. Assim, estruturas subcelulares e morfologias celulares podem ser analisadas com alta resolução espacial e temporal em tipos de células distintas que retêm suas principais características.

Protocolo

Todo trabalho animal aqui descrito está em conformidade com regulamentos legais (EU-Directiva 2010/63). Manutenção e manipulação de peixes foi aprovado pelas autoridades locais e o bem-estar dos animal representativo da Universidade Técnica de Braunschweig e Baixa Saxônia estado escritório de defesa do consumidor e da segurança alimentar (elevam, Oldenburg, Alemanha; AZ. parágrafo 4º (02.05) TSchB TU BS).

1. preparação da escola primária de células de embriões de peixe-zebra

1. Preparação de 2 dias pós fertilização (dpf) embriões de zebrafish
   1. Dia 1: Configure vários cruzamentos da estirpe do zebrafish de escolha e de acordo com as especificações de sua facilidade de zebrafish gerente⁸.
   2. Dia 2: Acasalar peixe e coletar ovos⁸ diretamente após a desova em uma placa de Petri (plástico) de 10 cm. Remova ovos mortos ou contaminados com uma pipeta Pasteur (plástico). Lavagem de ovos 1 x com Danieau 30% (5,8 mM de cloreto de sódio, 0,07 mM de cloreto de potássio, sulfato de magnésio de 0,04 mM, nitrato de cálcio 0,06 mM, 5 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic ácido, pH 7,2)⁸ com azul de metileno de 0,0001% (p/v). Trocar a médio Danieau 30% sem azul de metileno, azul de metileno pode causar autofluorescência e incubar ovos durante a noite a 28 ° C.
      Nota: Comece com um mínimo de 100 ovos por linha de peixe, a fim de obter uma quantidade suficiente de células. Não aumente mais de 150 embriões em uma placa de Petri.
   3. Dia 3: Remover embriões mortos ou contaminados e trocar a médio e a Danieau de 30%. Determine o número de embriões por contagem. Incubar os embriões durante a noite a 28 ° C.
      Nota: Ao usar uma linha transgênica expressando um repórter fluorescente, triagem no 1 dpf ou 2 dpf pode ser necessária.
      Nota: Para quantidades maiores de embriões, é recomendável tomar uma imagem em preto e branco da caixa de Petri respectivos (figura 1A) e para quantificar o número de embriões com um software de imagem.
   4. Dia 4: Embriões são agora 2 dpf. Remover chorions, adicionar 1 mL pronase com uma concentração de 1 mg/mL a 10 mL de Danieau 30%⁸ e incubar embriões num agitador, à temperatura ambiente até que todos os chorions são desanexados (20 – 40 min dependendo da temperatura ambiente). Lave com Danieau para remover tanto pronase e chorions e manter embriões à temperatura ambiente até o uso de mais de 30%.
2. Preparação de pratos de fundo de vidro revestido de poli-L-lysine reutilizável
   Nota: Pratos de fundo de vidro disponíveis comercialmente são projetados para uso único só e são caros. O procedimento a seguir descreve como preparar pratos de fundo reutilizável vidro self-made de materiais de laboratório padrão.
   1. Faça um furo com um diâmetro de 10 mm na parte inferior dos pratos de cultura de célula padrão (diâmetro de 6 cm, plástico) (figura 1B). Lave o prato fundo abundantemente com água corrente para remover o pó da perfuração.
   2. Espalhar a graxa de silicone em torno do furo na parte inferior do fundo do prato e anexar uma lamela usando a gordura como cola. Certifique-se de que a graxa foca a lacuna entre o fundo do prato e lamela.
      Nota: Certifique-se que a espessura das lamelas utilizadas é apropriada para a aplicação depois de imagem.
   3. Lave pratos de self-made vidro inferior completamente, mas cuidadosamente, com água fria e sabão. Lave pratos de vidro fundo três vezes com água desionizada para remover o sabão. Secar ao ar livre as tampas do prato e prato fundo e armazená-los em uma caixa limpa até nova utilização.
   4. No dia da preparação da cultura (dia 4, ver 1.1.4): umedecer o interior das duas tampas do prato e prato fundo com etanol a 70% (v/v). Coloque as tampas do prato e prato de fundo virado para o lado interno em uma bancada estéril com fluxo laminar e luz UV. Secar ao ar livre até que o etanol é evaporado e, em seguida, aplicar UV luz por 20 min. Após este tratamento, os pratos são montados e considerados como estéril.
   5. Para o revestimento, pipetar 200 µ l de poli-L-lisina (0,1 mg/mL) no meio de cada prato fundo de vidro e espalhar o líquido na lamela por quebrar a tensão superficial com a ponta da pipeta. Deixe secar por 60 min, em seguida, lavar 1x com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS). Remova o líquido. Manter pratos debaixo do banco até utilização posterior.
      Nota: Outros revestimentos podem ser testados dependendo o objetivo do experimento. Encontramos o suficiente para suportar o crescimento de neurônios poli-L-lisina, Considerando que o Tratado de plástico sem qualquer revestimento adicional parecia ser favorável para o crescimento de células de fibroblastos (Figura 1E, F).
      Nota: Pratos de vidro self-made inferior podem ser usados muitas vezes. Para trocar a lamela, lave com água morna da torneira, cuidadosamente desanexar a lamela e remover a gordura restante com etanol a 70% (v/v) e sabão.
3. Preparação e chapeamento de células primárias
   1. No dia da preparação da cultura (dia 4, ver 1.1.4): transferir os embriões em um prato de cultura de células estéreis (diâmetro 6 cm), usando uma pipeta de Pasteur de plástico fresca. Remova o líquido step-wise, até que todos os embriões são reunidos em uma grande gota com um diâmetro de cerca de 2 cm ou menos.
   2. Coloque o prato com embriões em bancada de trabalho estéril e adicionar CO₂-médio independente (suplementado com 10% (v/v) filtrado soro bovino, 1 x glutamina e 1,2% (v/v) 10.000 U penicilina-estreptomicina; médio com todos os suplementos é no seguinte conhecido como "meio de cultura celular") até que o prato está meio-cheio.
      Nota: Alternativas para CO₂-médio independente pode ser testado dependendo o objetivo do experimento, como por exemplo neurobasal médio, meio DMEM ou meio de Leibovitz L-15. CO₂-independente médio e médio de L-15 do Leibovitz têm a vantagem de não exigir uma incubadora de CO₂ .
   3. Para remover a gema, pipetar embriões acima e para baixo usando uma ponta de 200 µ l-pipeta. Deyolking bem sucedido pode ser reconhecido pela turvação do meio.
   4. Encha um prato de cultura celular com etanol a 70% (v/v) e um outro prato de cultura celular com meio de cultura celular fresco. Use uma ponta de pipeta-µ l de Cut-off 1.000 para transferir os embriões em um coador de célula estéreis com punho (40 µm; A Figura 1). Pegue o filtro pelo punho e mergulhá-lo no prato com etanol, para que todos os embriões são submergidos por 5 s. imediatamente depois, mergulhe o filtro com embriões no prato com meio de cultura celular fresco.
      Nota: Filtros de célula possam ser reutilizados várias vezes. Limpe com uma escova macia sob corrente de água da torneira, loja em etanol a 70% e seca e UV-tratá-los sob o trabalho estéril no banco diretamente antes de usar (ver 1.2.4).
   5. Transferência de embriões nos tubos de reação estéril 1,5 mL (aproximadamente 100 embriões em um tubo). Adicione a colagenase (tipo 2) diluída em meio de cultura celular para uma concentração final de 4 mg/mL em um volume total de 1 mL. Incube os tubos com embriões em rotacao tubo vertical com 30 rotações por min para 45 min à temperatura ambiente.
   6. Dissocia os restantes aglomerados de células pipetando a mistura de embrião-colagenase acima e para baixo com uma ponta de 1.000 µ l-pipeta. Em seguida, filtrar a suspensão de células através de um filtro de célula estéril com ranhura de ventilação (40 µm; Figura 1.) em um tubo cónico de 50 mL. Lave o filtro com aproximadamente 10 mL de meio de cultura celular fresco.
   7. Granule células por centrifugação por 3 min a 180 x g. O sedimento pode ser quase invisível. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura de células frescas µ l 200 por 30 embriões originalmente usados.
      Nota: Para obter um sedimento visível, é aconselhável começar com um mínimo de 100 embriões.
   8. Pipetar 200 µ l de suspensão de células obtida na etapa 1.3.7 diretamente sobre a área de vidro de um prato fundo de vidro self-made poli-L-lisina-revestido (ver 1.2). Incube durante 60 min à temperatura ambiente sob a bancada de trabalho estéril. Adicione 6 mL de meio de cultura celular fresco e incubar as células primárias a 28 ° C.
   9. Executar a aplicação de imagem desejada, usando um microscópio invertido a 28 ° C. Troca o meio de cultura celular diariamente. Culturas podem ser usadas para a imagem latente durante vários dias depois de chapeamento (dap).

Figura 1: cultura de células primárias de embriões de zebrafish. (A) imagem em preto e branco de 1 dap embriões, que podem ser processados por uma ferramenta de software para analisar o número de embriões. (B) pratos de cultura de células (diâmetro 6cm) com um orifício perfurado (diâmetro 10 mm) são usados para preparar pratos de fundo de vidro reutilizáveis de self-made. (C) filtros de célula (40 µm), com um simples identificador são usados como "pontas de camaroeiro" para mergulhar deyolked embriões em etanol e transferi-los rapidamente para o meio de cultura celular fresco. (D) célula filtros (40 µm), com ranhuras de ventilação são usados para filtrar as células após dissociação mediada por colagenase. (E) após 5 dap, as células primárias semeado no vidro revestido com poli-L-lysine principalmente formar neurônios com extensões pronunciados. Barra de escala = 100 µm. (F) depois de 5 dap em plástico tratado sem revestimento, fibroblasto, como células overgrow a cultura. Barra de escala = 100 µm. (E) e (F) foram adquiridos por um microscópio de epifluorescente. (G) transmissíveis luz imagem de células primárias derivado tipo selvagem zebrafish em 1 dap. Miócitos estriados e aglomerados de neurônios estender processos finos podem ser facilmente observados. Barra de escala = 50 µm. (H) pilhas cultivadas da linha transgénica Tg (ptf1a: eGFP) jh1, que expressa eGFP em progenitores neuronais de neurônios gabaérgica principalmente o rombencéfalo e um subconjunto de células da retina populações^{29, 30 , 31}. barra de escala = 50 µm. (G) e (H) foram adquiridos por um laser confocal microscópio usando os pratos de fundo de vidro feitos conforme ilustrado em (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. transfection da escola primária de células com plasmídeo

1. Ressuspender filtrado e peletizadas células obtidas no passo 1.3.7 em 1X PBS em vez de meio de cultura celular. Manche uma alíquota da suspensão celular com Trypan azul para determinar o número de células em uma contagem de câmara⁹.
2. Misturar 0,5 milhões de células com 10 µ g ultra-pura plasmídeo em um tubo de reação de 1,5 mL e ajustar o volume total de 100 µ l com PBS 1x.
   Nota: Para nossos experimentos, principalmente utilizado constrói de expressão com base no plasmídeo pCS2 +¹⁰. Expressão de frames de leitura abertos clonado no local de clonagem múltipla de pCS2 + é conduzido pelo promotor onipresente do citomegalovírus humano (promotor CMV). Outras construções de expressão e promotores podem ser testados (ver também resultados de representante e a Figura 2 e Figura 3).
3. Mistura de transferência do celular-DNA imediatamente para uma cubeta de eletroporação (0,4 cm), colocar a cubeta em um dispositivo de eletroporação e electroporate com as seguintes configurações: pulso único, decaimento exponencial, 280 V, 950 µF.
4. Diretamente após a eletroporação, transferi a mistura de DNA de células em um tubo de reação de 1,5 mL com 300 µ l de meio de cultura celular fresco.
5. 200 µ l de suspensão de células da placa conforme descrito em 1.3.8 e proceder conforme descrito em 1.3.9 dependendo da construção da expressão utilizada, expressão de proteínas fluorescentes pode ser detectável após algumas horas, ou no dia seguinte.

3. coloração de fixa as células primárias

Nota: Estruturas subcelulares também podem ser visualizadas por imunocoloração clássica em vez de usar os repórteres de proteína de fusão fluorescente. Para as células primárias de zebrafish, usamos o seguinte protocolo padrão para núcleo exemplar mancha, F-Actina e tubulina acetilada com marcadores fluorescentes.

1. Células de placa em lamínulas revestidas de poli-L-lysine colocada em uma placa de prato ou multiwell de cultura celular conforme descrito anteriormente (ver 1.3.8).
2. Para a fixação, remover o meio e cobrir as células com paraformaldeído 4% em 1X PBS. Incube as celulas por 10 min a 4 ° C, um agitador. Lavagem de células 3 x por 5 min com PBS 1x à temperatura ambiente. Certifique-se de que o PBS 1x cobre as células completamente e execute as etapas de lavagem em uma coqueteleira.
3. Bloquear e para permeabilize as células fixas, cobrir as células com 1X PBS contendo 5% de leite desnatado e 0,3% Triton X-100. Coloque as células durante 10 minutos à temperatura ambiente em um shaker. Lave as células conforme descrito no ponto 3.2.
4. Para rotular tubulina acetilada, um marcador para axônios¹¹, diluir o 1:2,000 do anticorpo primário em 1X PBS contendo 1% de leite desnatado. Cobrir as células com esta solução e incube-os durante a noite a 4 ° C, um agitador. No dia seguinte, lave as células conforme descrito no ponto 3.2.
5. Diluir o anticorpo secundário conjugado com fluorochrom verde fluoresceína isotiocianato (FITC) 1: 100 em 1X PBS contendo 1% de leite desnatado e incube as celulas com esta solução por 1h à temperatura ambiente no escuro (cobrir o prato , por exemplo, com uma caixa ou folha de alumínio) em uma coqueteleira. Lave as células conforme descrito no ponto 3.2.
6. Para simultaneamente manchar o citoesqueleto de actina e núcleos, Incube as celulas em PBS 1x suplementado com faloidina¹² conjugados com um fluorocromo vermelho (01:50) e 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)¹³ (100 ng/mL) por 10 min no quarto temperatura no escuro em um shaker. Lave as células conforme descrito no ponto 3.2.
7. Para preparar células para tratamento de imagens, colocar um portador de objeto de vidro (microscópio) sobre uma superfície limpa e coloque na gota de meio de montagem nele. Tirar uma lamela com células coradas e fixas um prato usando uma pinça e coloque-o sobre a queda com as células que enfrenta o portador de objeto. Certifique-se que esse meio de montagem se espalha sobre toda a área da lamínula. Deixar secar no escuro.
8. Loja fixa e montado células no escuro a 4 ° C até que o aplicativo de imagem desejado é executado.

Figura 2: Transfection de expressão de construções por eletroporação. (A) Jesus Rodrigues Putative neurônio transfected com pCS-eGFP em 1. (B) estriado miócito (2 dap) expressando a proteína retículo endoplasmático-alvo ss-RFP-KDEL. (C) dois neurônios dentro de um cluster neuronal transfectadas com pCS-MitoTag-YFP em 2 dap. (D) Cell (dap 2) triplo-transfectadas com pCS-DCX-tdTomato, pCS-MitoTag-YFP e pCS-H2B-mseCFP. (E) pSK-UAS:mCherry electroporated em células primárias (1 dap) derivadas de embriões duplo-transgénicos, carregando os transgenes Tg (atoh1a: Gal4TA4) hzm2²² e Tg (4xUAS:KGFPGI) hzm3³² , resultando na expressão de GFP em neuronais progenitores do rombencéfalo. Barras de escala = 10 µm. (A-E) foram adquiridos por um laser confocal, microscopia usando os pratos de fundo de vidro feitos conforme ilustrado na figura 1B. (F) coloração fluorescente de neurônios primários zebrafish fixo em 5 dap. Azul: DAPI (núcleo); Vermelho: Faloidina (F-Actina); Verde: Acetilado tubulina (neurônios). Barra de escala = 10 µm. (G) neurônio-como células transfectadas com pCS-do amor. Em 2 dap, sem extensão é visível. Em 5 dap, formou-se uma estrutura de axônio. Barra de escala = 25 µm. (H) neurônio da mesma preparação como a célula em (F), rodeado por células fibroblastos. Barra de escala = 10 µm. (eu) neurônio derivado de um embrião geneticamente modificado carregando o transgene Tg (XITubb: DsRed) zf148²⁸ transfected com pCS-do amor. Entre 12 e 15 dap, os neuritos sofrem degeneração massiva. Barra de escala = 100 µm. células mostradas na (F-eu) foram semeadas em vidro revestido de poli-L-lisina (F, H) ou plástico (G, eu), cultivado em meio de L-15, na presença de 10% de soro bovino de filtrado e o suplemento neuronal B-27 (diluídos 01:50) e fotografada com um microscópio de epifluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. preparação de células primárias do cérebro adulto de Zebrafish

1. Extração do cérebro
   1. Selecione um peixe adulto de pelo menos 90 dias de idade. Se trabalhar com um tipo de célula específica é necessária, escolha uma linha de transgénica na qual expressão fluorescente repórter célula específica permitirá visualizar as células desejadas.
   2. Coloque o peixe num copo cheio de 200 mL do anestésico tricaina⁸ (0,2%) em Danieau 30%. Espere até que o peixe para de se mover. Mergulhe o peixe anestesiado num copo cheio de gelo de 200 mL de água por 15 min para sacrificá-lo.
   3. Encha um prato de Petri (diâmetro 6cm) com etanol a 70% (v/v). Segurar o peixe pela cauda com um par de pinças e mergulhá-lo em etanol. Garantir que o peixe está completamente submersa em etanol por 5 s.
   4. Extrair o cérebro de acordo com o protocolo de Gupta e Mullins¹⁴ com as seguintes adaptações: use somente ferramentas autoclavadas ou estéril-embalados e dissecar a cabeça em PBS 1x estéril.
   5. Diretamente após a extração, colocar o cérebro em uma placa de Petri (diâmetro 3 cm) preenchido com PBS 1x estéril e mover o prato sob uma bancada de trabalho estéril para cultura de células.
2. Dissociação do cérebro e chapeamento de células primárias
   1. Coloque dois conjuntos de pinças estéreis (autoclavadas), uma placa de Petri estéril (diâmetro 6cm) preenchido com etanol a 70% (v/v), uma placa de Petri estéril (diâmetro 10 cm) preenchido com meio de L-15 do Leibovitz suplementado com 10% (v/v) filtrado soro bovino, B-27 (01:50) e 1,2% (v / v) 10.000 U penicilina-estreptomicina e um filtro de célula estéreis com punho (40 µm; Figura 1.) sob o banco limpo.
   2. Lugar o coador de célula para o prato de Petri preenchida com etanol e garantir o nível de líquido é maior que a parte inferior do filtro pelo menos 5 mm.
   3. Usando o primeiro conjunto de pinças, transferir o cérebro para o filtro já colocado em etanol e certifique-se de que está totalmente coberto pelo líquido. Depois de 1 s, transferência do filtro com o cérebro para a placa de Petri contendo meio de Leibovitz L-15 com o acima descrito suplementos.
   4. Usando o segundo conjunto de pinças, transferência o cérebro em um tubo de reação estéril 1,5 mL preenchido com média do 500 µ l Leibovitz L-15 com o acima descrito suplementos. Adicione colagenase (tipo 2) a uma concentração final de 4 mg/mL em um volume total de 1 mL.
   5. Incube o tubo em rotacao tubo vertical com 30 rotações por minuto para 35 min à temperatura ambiente. Mecanicamente, dissocia as touceiras de tecido restante pipetando acima e para baixo usando a ponta da pipeta 1.000 µ l para auxiliar o processo de dissociação.
   6. Pare a dissociação quando sem partículas visíveis permanecem em solução. Filtrar a suspensão através de um filtro de célula estéril com ranhura de ventilação (40 µm; Figura 1.) em um tubo cónico de 50 mL. Lave o filtro com aproximadamente 10 mL de meio de cultura celular fresco.
      Nota: Quando a suspensão de célula única é alcançada, a etapa de filtração não é tão necessária como no caso de dissociação de embriões. O cérebro é um tecido mole e como tal é mais propenso a ser dissociado homogeneamente em suspensão de célula única.
   7. Células de pelotas por centrifugação por 5 min a 180 x g e ressuspender as células em 1 mL de meio de L-15 do Leibovitz fresco com os suplementos descritos acima.
   8. Pipetar 500 µ l de suspensão de células (50% das células obtidas) em um prato fundo de vidro revestido de poli-L-lysine self-made (ver 1.2) ou em um poço de uma placa de 24. Downscale no caso de superfícies menores (ou seja, 125 solução µ l para um poço de uma placa de 96 poços). Incube durante 60 min à temperatura ambiente sob a bancada de trabalho estéril. Em seguida, adicione o volume necessário de meio fresco para encher o recipiente específico e incubar as células primárias a 28 ° C.
   9. Executar a aplicação de imagem desejada, usando um microscópio invertido a 28 ° C. Culturas podem ser usadas para a imagem latente durante vários dias depois do chapeamento. Substitua 50% do meio em uma base diária.

Resultados

A Figura 1 mostra uma imagem de luz transmitida de uma cultura típica derivada de embriões de tipo selvagem com miócitos estriados e aglomerados de células neurônio-como sendo o mais abundante. Para identificar determinados tipos de células mais facilmente, uma linha de transgênica com expressão de tipo específico de célula de uma proteína fluorescente pode ser usado (Figura 1 H).

Discussão

Aqui, apresentamos dois protocolos diferentes de cultura primária de células de 2 embriões de zebrafish dpf ou cérebro adulto zebrafish.

A preparação das culturas de célula primária de 2 dpf zebrafish é relativamente fácil de executar para qualquer pessoa com experiência em técnicas de cultura de célula básica. No entanto, para obter resultados reprodutíveis e boas, um número suficiente de embriões como material de partida é crucial (100 é o mínimo). Durante o levantamento ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish lines
AB (wild-type)			established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC)
Tg(ptf1a:eGFP)jh1			stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007)
Tg(XITubb:DsRed)zf148			stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed  (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
centrifuge	Eppendorf		model 5804 R
ChemiDoc MP imaging system	BioRad		model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos
confocal laser scanning microscope	Leica microsystems		model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective
epifluorescent microscope	Leica microsystems		model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective
Gene Pulser Xcell with capacitance extender	BioRad	1652661	electroporation device
Horizontal shaker	GFL		model 3011
incubator for cell culture (28 °C)	Memmert		model incubator I
incubator for embryos (28 °C)	Heraeus		type B6120
light microscope	Zeiss		model TELAVAL 31
micro pipettes	Gilson
sterile work bench	Bio Base		with laminar flow and UV light
tweezers	Dumont		Style 5, Inox
vertical tube rotator	Labinco B.V.		model LD-79
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image Lab Software	BioRad		for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad
ImageJ	National Institutes of Health		used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).
LAS X	Leica Microsystems		for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pCS-DCX-tdTomato	Köster Lab	# 1599	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-eGFP	Köster Lab	# 7	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-H2B-mseCFP	Köster Lab	# 2379	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-mClover	Köster Lab	# 3865	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-MitoTag-YFP	Köster Lab	# 2199	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-ss-RFP-KDEL	Köster Lab	# 4330	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-VAMP1-mCitrine	Köster Lab	# 2291	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pSK-UAS:mCherry	Köster Lab	# 1062	based on the pBluescript-backbone of Stratagene
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic and glass ware
BD Falcon Cell Strainer (40 µm)	FALCON	REF 352340	distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium
1.5 mL reaction tubes	Sarstedt	72690550
24-well plate	Sarstedt	83.3922
50 mL falconic tube	Sarstedt	62.547.004
96-well plate	Sarstedt	83.3924.005
EasyStrainer (40 µm)	Greiner Bio-One	542 040	with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation
electroporation cuvette (0.4 cm)	Kisker	4905022
glass coverslips	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051201
Microscope slides	Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser)	631-0845
Neubauer chamber	Henneberg-Sander GmbH	9020-01
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL)	A. Hartenstein	PP05
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	821473	for zebrafish embryos
pipette tips	Sarstedt	Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm)	TPP Techno Plastic Products AG	93040
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm)	Sarstedt	72690550
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	83.3902	for brain dissection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and Reagents
sodium chloride	Roth	0601.1
4 % paraformaldehyde in 1x PBS	Sigma-Aldrich	16005
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	C1396
ethanol p.a. 100%	Sigma-Aldrich	46139
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated	Thermo Fisher Scientific	31547
HEPES	Roth	9105.4
high vacuum grease	DOW CORNING	3826-50	silicon grease used for self-made glass bottom dishes
magnesium sulfate heptahydrate	Merck	105886
methylene blue	Serva	29198.01
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody	Sigma-Aldrich	T6793
Aqua-Poly/Mount (mounting medium)	Polyscience	18606
poly-L-lysine	Biochrom	L 7240
potasssion chloride	Merck	104938
Skim milk	Roth	68514-61-4
Texas Red-X Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	T7471
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate
Triton X-100	BioRad	1610407
Trypan Blue	Gibco by Life Technologies	15250061
Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzymes
collagenase (Type 2)	Thermo Fisher Scientific	17101015	dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C
pronase (from Streptomyces griseus)	Roche	11459643001	distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium and solutions for cell culture
1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Gibco by Life Technologies	14190-169	distributed by Thermo Fisher Scientific
CO2-independent medium	Gibco by Life Technologies	18045054	distributed by Thermo Fisher Scientific
filtrated bovine serum (FBS)	PAN-Biotech		individual batch
glutamine 100x	Gibco by Life Technologies	25030081	distributed by Thermo Fisher Scientific
Leibovitz's L-15 medium	Gibco by Life Technologies	11415049	distributed by Thermo Fisher Scientific
PenStrep (10,000 U/mL)	Gibco by Life Technologies	15140148	distributed by Thermo Fisher Scientific