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Resumo

Sprays de fungicida em plantas de floração podem expor abelhas solitárias para altas concentrações de resíduos do fungicida transmitidas pelo pólen. Usando experimentos baseados em laboratório, envolvendo-se em vitro-larvas de abelha criados, este estudo investiga os efeitos interativos de consumir pólen tratada com fungicida derivado de host e host não plantas.

Resumo

Embora as abelhas solitárias fornecem serviços de polinização crucial para culturas selvagens e gerenciados, este grupo de ricos em espécies foi negligenciado em grande parte em estudos de regulamento de pesticidas. O risco de exposição a resíduos do fungicida é provável que seja especialmente elevado se o spray ocorre em ou perto de plantas hospedeiras, enquanto as abelhas estão coletando pólen para provisionar seus ninhos. Para espécies de Osmia que consomem pólen de um seleto grupo de plantas (oligolecty), a incapacidade de usar o pólen de plantas não-hospedeiras pode aumentar seu fator de risco para toxicidade relacionadas com fungicida. Este manuscrito descreve protocolos usados com sucesso criar abelhas oligolectic mason Osmia ribifloris sensu lato, do ovo à fase prepupal em placas de cultura de células em condições laboratoriais padronizados. O em vitro-abelhas criadas posteriormente são usadas para investigar os efeitos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão de abelha. Baseado em um experimento fatorial 2 x 2 totalmente atravessado, o experimento examina os efeitos principais e interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão larval, quantificada por biomassa prepupal, tempo de desenvolvimento larval e sobrevivência. Uma grande vantagem desta técnica é que usando em vitro-abelhas criadas reduz a variabilidade natural de fundo e permite a manipulação simultânea de vários parâmetros experimentais. O protocolo descrito apresenta uma ferramenta versátil para hipóteses testes envolvendo o conjunto de fatores que afetam a saúde das abelhas. Para os esforços de conservação a ser cumprido com sucesso significativo e duradouro, tais insights sobre a complexa interação de fatores fisiológicos e ambientais que levam a abelha declínios provarão para ser crítico.

Introdução

Dado o seu papel como o grupo dominante de insetos polinizadores1, a perda global em populações de abelhas é uma ameaça para a segurança alimentar e o ecossistema estabilidade2,3,4,5,6 ,7. As tendências em declínio em ambas as populações de abelhas gerenciado e selvagens têm sido atribuídas a vários factores de risco compartilhados, incluindo fragmentação de habitat, emergentes, parasitas e agentes patogénicos, perda de diversidade genética e a introdução de espécies invasoras3 ,,4,7,8,9,10,11,12. Em particular, o aumento dramático no uso de pesticidas, (por exemplo, neonicotinoides) tem sido diretamente associado a efeitos prejudiciais entre abelhas13,14,15. Vários estudos têm mostrado que o sinergismo entre neonicotinoides e fungicidas de (EBI) inibindo a biossíntese de ergosterol pode levar a alta mortalidade entre múltiplos abelha espécie16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. não obstante, fungicidas, consideradas por muito tempo para ser 'abelha-safe', continuam a ser pulverizado nas culturas no-flor sem muito controlo23. As abelhas operárias foram documentadas para rotineiramente trazer cargas de pólen contaminadas com resíduos de fungicida24,25,26. O consumo de tal fungicida-ladenpollen pode causar alta mortalidade larval abelhas27,28,29,30e um conjunto de efeitos sub-letais entre abelhas adultas16 , 31 , 32 , 33 , 34. um estudo recente sugere que fungicidas podem causar perdas de abelha, alterando a comunidade microbiana na colmeia-armazenado o pólen, rompendo assim, a crítica simbiose entre abelhas e pólen transmitidas por micróbios35.

Embora as abelhas solitárias são vitais para a polinização de diversas plantas silvestres e agrícolas36,37,38, este grupo diverso de polinizadores tem recebido muito menos atenção em estudos de monitoramento de pesticidas. O ninho de uma fêmea solitária adulta contém câmaras ninhadas seladas de 5-10, cada abastecida com uma massa finita de maternalmente coleta de pólen e néctar e um único ovo39. Após a eclosão, as larvas dependem da prestação de pólen alocado e a microbiota associada transmitidas por pólen para obter uma nutrição adequada40,41. Porque eles não possuem os benefícios de um estilo de vida social, as abelhas solitárias podem ser mais vulneráveis à exposição de pesticidas42. Por exemplo, enquanto os défices em abelhas sociais seguindo um spray podem ser compensados para estendem a alguns trabalhadores e novos emergentes, ninhada, a morte de uma única fêmea solitária adulta termina todas as atividade reprodutiva43. Tais diferenças de susceptibilidade destacam a necessidade de incorporar táxons de abelha diversificada em estudos ecotoxicológicos para garantir proteção adequada para as abelhas selvagens e gerenciadas parecidas. No entanto, além de um punhado de estudos, investigações sobre os efeitos da exposição de fungicida tem focado principalmente nas abelhas sociais18,23,32,44,45 ,46,,47,,48,49.

Abelhas solitárias, pertencentes ao gênero Osmia (Figura 1) têm sido utilizadas no mundo inteiro como polinizadores eficientes de vários frutos importantes e porca culturas39,50,,51,53, 53. como com outros polinizadores gerenciado grupos24,54,55,56,57,58, abelhas adultas Osmia são rotineiramente expostos aos fungicidas pulverizadas sobre as culturas em-flor44. Fêmeas adultas forrageamento em culturas recentemente pulverizadas podem coletar e estocar seus aposentos ninhados com fungicida-carregado de pólen, que posteriormente forma a dieta exclusiva para as larvas em desenvolvimento. Consumir as disposições de pólen contaminados posteriormente pode expor as larvas de fungicida resíduos42. O risco de exposição pode ser maior entre espécies de oligolectic que forragem somente em alguns anfitrião estreitamente relacionadas plantas59,60,61. Certos megachilid de abelhas, por exemplo, parecem preferencialmente forragem para o pólen de Asteraceae de baixa qualidade, como um meio de reduzir o parasitismo62. No entanto, a extensão a que fungicidas impacto larval adequação entre abelhas solitárias oligolectic não foi empiricamente quantificada. O objetivo deste estudo é desenvolver um protocolo para testar as principais e efeitos interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão do in vitro criadas abelhas solitárias. Para investigar, ovos de ribifloris o. sensu lato (s.l.) podem ser obtidos comercialmente (tabela de materiais). Esta população é ideal por causa de sua importância como um polinizadores nativos e sua forte predileção para o néctar rico Mahonia aquifolium (uva de Oregon) encontrado dentro da região53,63,64 (Figura 2).

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Figura 1. Uma foto de alta resolução de um adulto Osmia ribifloris. Foto de crédito Dr. Jim Cane, pesquisa entomologista, USDA-ARS , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Aninhamento de palhetas de Osmia ribifloris (s.l.) com uma fêmea de nidificação em primeiro plano,. de Phragmite Partições de câmara e buchas terminais para as palhetas são construídas a partir de folhas mastigadas. Foto crédito Sr. Kimball Clark, NativeBees.com , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O primeiro objectivo deste estudo é avaliar o efeito de consumir pólen tratada com fungicida na aptidão larval (medido em termos de tempo de desenvolvimento e biomassa de prepupal). Enquanto a exposição para o propiconazol fungicida comumente aplicada tem sido associada ao aumento da mortalidade entre abelhas adultas através de várias espécies de 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,,66,67, seu impacto sobre as abelhas larvas é menor conhecido. O segundo objectivo deste estudo é avaliar os efeitos de consumir pólen não-host na aptidão larval. Estudos anteriores indicam que as larvas de abelhas oligolectic não conseguem desenvolver quando forçado a consumir pólen host não68. Tais resultados podem ser atribuídos às variações na fisiologia de abelha69, pólen bioquímica70e o benéfico microbiome associado com pólen natural disposições71. O terceiro objectivo deste estudo é avaliar os efeitos interativos de tratamento fungicida e pólen dietético na aptidão larval.

Numerosos traços biológicos, incluindo o tamanho do corpo materno, provisionamento de taxa, estratégia de forrageamento e pólen quantidade72,73,,74,75 são conhecidos por afetar a aptidão larval entre abelhas solitárias. Esses fatores podem introduzir variabilidade significativa entre juncos, que constitui um desafio no desenvolvimento de projetos experimentais defensáveis quando avaliação saúde larval. Além disso, dado que desenvolvimento larval ocorre dentro de juncos aninhamento selados, os efeitos de tal variabilidade na progenitura são difíceis de Visualizar e quantificados sem o uso de técnicas não-letais (Figura 3). Para superar este desafio, todas as hipóteses dentro deste estudo são testados usando larvas criadas fora suas linguetas de aninhamento. O delineamento experimental representa um totalmente cruzados 2 × 2 fatorial set-ups, com cada fator, consistindo em 2 níveis; Fator 1: Exposição fungicida (fungicida; Nenhum fungicida); Fator 2: Fonte de pólen (Host pólen, pólen de Non-host). As abelhas são disparadas do ovo à fase prepupal placas de cultura de célula do multiwell estéril sob condições controladas de laboratório. Cada um bem individualmente é abastecido com uma quantidade padronizada de um único ovo e disposições de pólen. Após a eclosão, a larva alimenta-se o pólen alocado dentro do poço, conclui desenvolvimento larval e inicia a pupa. Após estudos têm mostrado que inexplicáveis de mortalidade é menor entre abelhas levantadas dentro deste ambiente de criação artificial do que o encontrado no selvagem49,,76. O uso do in vitro-abelhas criadas tem diversas vantagens sobre os estudos de campo baseada: 1) minimiza os efeitos de confundimento de variabilidade natural e descontrolados fatores associados tipicamente com os estudos de campo baseada; 2) permite que vários níveis de manipulação para cada factor de interesse a serem testadas simultaneamente em grupos de tratamento; 3) o número de repetições pode ser predeterminado, e fatores experimentais para cada replicar podem ser manipulados individualmente; 4) variáveis resposta larval podem ser facilmente visualizadas e gravadas independentemente sem perturbadoras larvas adjacentes; 5) o protocolo pode ser modificado para acomodar mais complexos desenhos experimentais envolvendo múltiplos fatores e variáveis de resposta.

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Figura 3. Conteúdo dentro de uma palheta de nidificação natural de Osmia ribifloris (s.l.). Perto da (A) um reed dissecado mostrando câmaras individuais, disposições de pólen e as partições e (B) recém colhidas disposições de pólen e os ovos associados (indicados com um círculo preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. prepare soluções propiconazol para experimentos de exposição de fungicida

  1. Prepare 0,1 x solução fungicida dissolvendo volumes adequados de propiconazol adquiridos comercialmente 14,3% em água estéril no dia do experimento. Certifique-se de que a única solução recentemente preparada de fungicida é usada para todos os tratamentos.
  2. Adicione 23 µ l de 0,1 x solução fungicida por grama de provisão de pólen para obter a concentração máxima de propiconazol anteriormente relatado de pólen de abelha-coletados24 (0,361 PPM ou µ g de ingrediente ativo g-1 de pólen).

2. colher ovos e disposições de pólen Host de Osmia juncos

  1. Usando um bisturi esterilizado, disse recém ligado aninhando canas de Osmia, dividi-la em duas partes ao longo do comprimento da cana para expor as câmaras individuais.
    Nota: Cada ninho pode conter entre 8 a 14 câmaras e um ovo dentro de uma câmara.
  2. Inspecione os juncos visualmente para identificar as câmaras contendo ovos masculinos com base em diretrizes previamente publicados77. Uso uma agulha esterilizada dobrada para remover cada disposição de pólen juntamente com o ovo associado o nidificação reed e coloque em um ambiente limpo pesar o barco.
  3. Suavemente separa a prestação usando um pincel limpo bem o ovo e gravar o peso fresco de uma prestação pólen e utilizando uma balança de laboratório padrão do ovo. Calcule o peso médio das disposições pólen masculino.
  4. Execute as etapas subsequentes com prazo mínimo para reduzir as chances de danos para o ovo da exposição à temperatura excessiva e desidratação.

3. prepare a disposições de pólen de plantas de Host

  1. Inspecione visualmente o pólen planta hospedeira maternalmente coletados escavado das câmaras de nidificação para não garantir que nenhum parasitas presentes78. A fim de reduzir qualquer potencial viés materna, combinar as disposições de pólen em uma massa única em uma placa de Petri estéril e misture bem, usando uma agulha esterilizada.
  2. Divida a massa combinada em novas disposições de pólen, garantindo que o peso de cada prestação reconstituído é aproximadamente igual ao peso médio de uma disposição masculina naturalmente alocada (média ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42).
    Nota: Porque Osmia sp. aloca menores disposições de pólen para a prole masculina, isso resulta em menor peso corporal das larvas masculinas comparadas de fêmeas77. Para evitar qualquer tal preconceito resultantes de diferenças específicas do sexo, apenas use ovos masculinos nos experimentos.

4. prepare a planta hospedeira não provisão de pólen

  1. Pulverizamos adquiridos comercialmente mel abelha coleta pólen a um pó fino, usando um padrão de laboratório com moinho de esfera.
  2. Com base no teor de umidade disposições de pólen coletado maternalmente anfitrião (~ 20%), hidrate o pó de pólen usando volumes adequados de solução de açúcar de 40% esterilizado79 e misture cuidadosamente para formar uma consistência de massa.
  3. Divida em massas de pólen individuais, cada um pesando aproximadamente o mesmo que o peso médio de uma disposição masculino naturalmente alocado.
    Nota: De humidade do pólen de anfitrião maternalmente coletados disposições podem ser padronizadas em antes comparando o peso fresco e seco, de disposições de pólen de 30 câmaras masculino selecionado aleatoriamente80. Para obter o peso seco, disposições de pólen devem ser liofilizadas em um Liofilizador (1,5 Pa para 72 h).

5. preparar placas de cultura de células do Multiwell

  1. Poços individuais de linha da placa de cultura de 48-bem estéril com copos de estanho autoclavados (5 × 9 cm). Usando a pinça estéril, toque suavemente para fora da borda superior da cápsula para que ele pode acomodar a provisão de pólen.
  2. Coloque uma massa única de host ou o host não prestação de pólen dentro do copo lata usando ferramentas estéril com base no grupo de tratamento.
    Nota: Para evitar contaminação cruzada, use chapas separadas por grupos tratamento e controle.

6. Adicione fungicidas

  1. Faça uma depressão centralmente posicionada dentro da massa de pólen usando uma vara de madeira estéril. Use um stick para cada prestação de pólen.
  2. Adicione volumes adequados de solução fungicida (para tratamento), ou água esterilizada (para controles) para a depressão. Beliscar a abertura da depressão usando Pinças esterilizadas para minimizar o contato entre o fungicida de superfície / estéril água e o ovo.
  3. Certifique-se de que a afinação fatorial do design experimental alinha com isso retratado na representação esquemática (Figura 4).

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Figura 4. Representação esquemática da instalação experimental. O experimento representa um totalmente cruzada 2 × 2 fatorial configurações. Fator 1 representa a exposição do fungicida e consiste em 2 níveis: (i) nenhum fungicida (N = 10) e (ii) fungicida (N = 10). Fator 2 representa a fonte de pólen e consiste em 2 níveis: pólen (i) Host (N = 8) e (ii) não-acolhimento de pólen (N = 8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. traseira e observar larvas

  1. Coloque um ovo masculino selecionado aleatoriamente na superfície superior da prestação pólen utilizando um pincel limpo bem. Uma vez que os ovos foram colocados em todas as disposições, substitua a tampa da placa de cultura de célula, fixando-a com fita nas esquinas de rotulagem.
  2. Coloque as placas bem em uma bandeja limpa e cubra com um pano escuro para obstruir o contato com luz direta. Lugar um poço 6 placa contendo 30 mL de água estéril dentro da bandeja para evitar a dessecação. Bandejas de incubação deixe intacta dentro de uma incubadora à temperatura ambiente.
  3. Observe bem placas diariamente sob um microscópio dissecação sem retirar a tampa das placas bem. Certifique-se de que as larvas estão vivas, verificando para o movimento. Se nenhum movimento for detectado, descarte a caneca contendo as larvas mortas e a restante oferta de pólen. Permitir que todas as larvas sobreviventes desenvolver imperturbado dentro as placas bem até que eles atinjam o estágio de prepupal.
  4. Remova a larva do copo de estanho quando atinge o estágio prepupal41. Usar uma escova para limpar os defecar no casulo de seda. Cuidadosamente corte através do casulo de seda usando um microscópio de dissecação e extrair o prepupa com pinça de borracha.
  5. Manipule o prepupa suavemente para garantir que as ferramentas não perfurar o corpo mole. Registro do peso fresco do prepupa (prepupal biomassa) e o tempo do desenvolvimento do ovo à fase prepupal (tempo do desenvolvimento larval).
    Nota: Qualquer larva morta deve ser descartado imediatamente para evitar o crescimento microbiano indesejável sobre o cadáver e disposição de restos de pólen. Isso reduz o risco de infecção para as restantes larvas saudáveis.

Resultados

Aptidão larval foi quantificada utilizando três métricas (i) larval tempo do desenvolvimento, (ii) prepupal biomassa e sobrevivência (iii) por cento. Uma ANOVA de duas vias foi realizada utilizando exposição fungicida (dois níveis: nenhum fungicida, fungicida) e fonte de pólen (dois níveis: Host pólen, pólen de Non-host) como variáveis independentes e tempo de desenvolvimento larval como variável dependente. O principal efeito para exposição de fungicida (F1,2...

Discussão

Criação de abelhas do lado de fora seus juncos de nidificação naturais, sob condições de laboratório, permite o teste de múltiplas hipóteses relativas à aptidão larval. Na medida em que fatores não identificados continuam a causar mortalidade das abelhas, os estudos de avaliação de risco usando em vitro experiências podem ajudar a identificar ameaças potenciais e informar as práticas de gestão para este grupo de ricos em espécies de polinizadores selvagens 12 ,

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Kimball Clark e Tim Krogh para fornecer Osmia aninhamento juncos, Meredith Nesbitt e Molly Bidwell para assistência em laboratório, os Drs Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter e três revisores anônimos para seus comentários úteis que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos de USDA-Agricultural Research Service, que se apropriou (atual Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin, Ministério da agricultura, do comércio e defesa do consumidor (#197199), National Science Foundation (sob N º de Grant Deb-1442148), o centro de pesquisa de bioenergia do DOE grandes lagos (DOE escritório de ciência BER DE-FC02-07ER64494).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.)Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reedsNativebees.comNAFreshly plugged reeds
Dissection setVWR89259-964Sterilize before use
Long Nose PliersHusky1006
6 well culture platesVWR10062-892Sterile sealed
48 well culture platesVWR10062-898Sterile sealed
Petri dishesVWR25373100Sterile sealed
Square Weighing BoatsVWR10770-448
Camel Hair BrushBioquip1153A
Tin capsulesEA ConsumablesD1021Sterilize before use
SucroseVWR470302-808
Propiconazole 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazole 14.3%
Honey bee pollenBee energised897098001244Untreated, natural, raw pollen
MicrobalanceVWR10204-990
PulverisetteLAB SYNERGY INC.30334913
Wooden sticksVWR470146908Sterilize before use
Sealing tapeVWR89097-912
MicroscopeVWR89403-384
Planting trayVWR470150-632
EthanolVWRBDH1158-4LP
Centrifuge tubeVWR21008936
MicrosyringeCole-PalmerUX-07940-07
Rubber tweezerAmazonB0135HWPN4
Syringe needlesVWR89219-334
Freeze drierLabconoLFZ-1L
Statistical softwareSPSSVersion 21.0

Referências

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