Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Resumo

Apresentamos um protocolo para medição de consumo de oxigênio e a acidificação extracelular nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Um analisador metabólico é utilizado com um protocolo adaptado e otimizado. Microtecido restrições são uma componente essencial do presente protocolo e foram concebidas e criadas especificamente para a sua utilização nesta análise.

Resumo

Este protocolo descreve um método para medir o metabolismo nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Quantificar o metabolismo em órgãos inteiros fornece uma compreensão de tecidos-nível de utilização de energia que não pode ser capturada ao analisar as células primárias e linhagens celulares. Enquanto esta análise é ex vivo, permite a medição de uma série de células especializadas que trabalham em conjunto para executar uma função em um tecido e modelos mais pròxima o órgão na vivo . Reprogramação metabólica tem sido observada em muitas doenças neurológicas, incluindo a neoplasia e doenças neurodegenerativas. Este protocolo foi desenvolvido para auxiliar a investigação da Comunidade d. melanogaster do metabolismo em modelos de doença neurológica, usando um analisador metabólico comercialmente disponível. Medir o metabolismo do cérebro inteiro no analisador metabólico é um desafio devido a geometria do cérebro. Este analisador requer amostras para permanecer na parte inferior de uma placa de 96 poços. Amostras de células e tecido socos podem aderir à superfície da placa de celular ou utilizar placas de esferoide, respectivamente. No entanto, a forma esférica, tridimensional do cérebro d. melanogaster impede que o tecido aderindo à placa. Este protocolo requer um apoio de microtecido especialmente projetado e manufacturado que contorna este problema, impedindo qualquer movimento do cérebro enquanto ainda permitindo medições metabólicas de duas sondas de sensor de estado sólido do analisador. Consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular são reprodutíveis e sensível a um tratamento com inibidores metabólicos. Com uma pequena otimização, este protocolo pode ser adaptado para uso com qualquer tecido inteiro e/ou sistema de modelo, desde que o tamanho da amostra não deve exceder a câmara gerada pelo apoio de. Enquanto medições metabólicas basais e uma análise após um tratamento com inibidores mitocondriais são descritos neste protocolo, inúmeras condições experimentais, tais como a preferência de fonte de energia e ambiente de criação, podem ser interrogadas.

Introdução

Reprogramação metabólica foi identificada em muitas doenças neurológicas, incluindo Glioblastoma Multiforme (GBM), doença de Huntington e transtorno depressivo maior (MDD)^1,2,3. Como o metabolismo torna-se o foco das estratégias terapêuticas, ferramentas de pesquisa metabólica básica tem avançado. No entanto, a maioria desses métodos foram projetada para estudar linhas de células e as células primárias ou analisar tecidos maiores pós- fixação ou - congelação. Algumas abordagens têm confiado em kits para medir simplista metabolitos específicos, enquanto outros têm utilizado mais dispendiosas e complexas análises utilizando cromatografia em combinação com a espectrometria de massa⁴ , para o mesmo objetivo. Para entender a maior paisagem metabólica, metabólica, criação de perfis de^5,6 e análise do fluxo metabólico (AMF)⁷ surgiu para complementar a proteómica em grande escala e estudos genômicos. Perfil fornece uma representação quantitativa de metabolitos numa célula ou tecido em um ponto no tempo, enquanto AMF expande-se sobre isto, permitindo o rastreamento de metabolitos rotulados ao longo do tempo. Este último tem sido útil em revelar como fontes de energia são utilizadas de forma diferente em uma célula ou tecido quando em um estado de doença⁸. No entanto, estes métodos não incluem a medição da taxa metabólica total.

Para interrogar o estado metabólico geral dos sistemas modelo de pequeno porte, os métodos tradicionais, tais como o Clark eletrodo⁹ e calorimetria indireta¹⁰, podem ser usados para medir o consumo de oxigênio ou configurados para respirometria fluxo de paragem, a medir o oxigênio e a concentração de dióxido de carbono, respectivamente. Estas técnicas, ao mesmo tempo com precisão, fornecendo uma visão para a leitura de reprogramação metabólica a nível do organismo, têm limitações. O uso do eletrodo Clark pode ser tecnicamente desafiador e não foi projetado para estudos de alta produtividade. O respirometer fluxo de parada não pode funcionar com a sensibilidade necessária para o ensaio das células ou tecidos. Há vários anos, a nova tecnologia foi desenvolvida especificamente para estes menores aplicações¹¹. Estes instrumentos foram inicialmente projetados para medir o consumo de oxigênio e a acidificação extracelular de linhagens celulares e as células primárias em um formato 24 - ou 96-bem. A simplicidade de configuração e dados saída estabelecido este método como uma alternativa para as abordagens tradicionais. Esta metodologia é uma ferramenta poderosa para as células, e avanços recentes permitiram que a medição de tecido socos^12,13,14. No entanto, os métodos utilizados nestes ensaios não permitem a medição de órgãos inteiros de sistemas modelo pequeno.

A análise metabólica dos modelos de doença, muitas vezes, envolve a interação entre as células de função especializada que residem dentro do mesmo tecido. Por exemplo, células gliais produzem metabolitos utilizados pelos neurônios. Essas interações metabólicas são necessárias para a sobrevivência neuronal¹⁵. Sistemas modelo de pequeno porte são vantajosos para investigar questões como estas. Estudos para medir o metabolismo de um órgão inteiro, contendo uma variedade de tipos de células, irão adicionar para a compreensão da utilização de energia em vivo. Recentemente, Becker et al relataram um método de medição do consumo de oxigênio em cabeças todo voar¹⁶. Por reunir um número de cabeças juntos em um poço de uma placa de 24 células, as leituras de consumo de oxigênio foram obtidas utilizando um analisador metabólico. Enquanto isso funciona bem para a cabeça, que é facilmente separada do corpo, é muito mais difícil de usar para órgãos como cérebro larval, porque precisa de uma grande quantidade para serem dissecados para este método. Portanto, um método utilizando uma placa de células 96 poços, o que aumenta a sensibilidade do consumo de oxigênio e leituras de acidificação do extracelular, foi desenvolvido para um único cérebro inteiro larval de ensaios.

O analisador metabólico utilizado neste estudo requer a amostra que está sendo medida para permanecer no fundo do poço de uma placa de células 96 poços. Para as células e tecidos relativamente planos, este não é um desafio; no entanto, para cérebros de larvas e adultos de d. melanogaster , não é possível usando protocolos de revestimento tradicional prato. A forma tridimensional esférica dos cérebros não aderirão confiável para a superfície da placa, e aqueles que o fazem muitas vezes são danificadas durante a tentativa de colocá-los corretamente no poço. Uma parte crítica do presente protocolo novo é a concepção e desenvolvimento de microtecido restrições¹⁷ que fornecem uma pequena câmara para o cérebro residir em sem interferir com as medições metabólicas. A câmara gerada é aproximadamente 0.016 em de altura e oferece espaço suficiente para armazenar facilmente muitos cérebros de d. melanogaster . Os apoios consistem em malha de nylon, ligada a um anel de polímero inerte e serão discutidos mais nos Resultados do representante. Usar essas amarras minimiza o tempo necessário para preparar o cérebro dissecado para a medição metabólica. Otimizar o processo de medição gera consumo de oxigênio estável, reprodutível e taxas de acidificação do extracelular após seis ciclos de medição (de 25 min). O cérebro permanecem metabolicamente ativo nestas condições durante um período mínimo de 2 h, que permite injeções de terapêutica, inibidores ou outros tratamentos através dos portos de entrega de droga de cartucho analisador metabólico. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para outros tecidos e de sistemas de pequeno modelo¹⁸.

O protocolo detalhado abaixo descreve como a ensaiar o consumo de oxigênio em um drosófila larval cérebro inteiro quando desafiados com stress mitocondrial. Para ressaltar o cérebro, oligomicina é adicionada ao inibir a ATP sintase¹⁹. A diminuição do consumo de oxigênio de leituras basais mostra uma medida da quantidade de ATP, dependendo da respiração no cérebro. Mais diminui o consumo de oxigênio após tratamentos com rotenona²⁰ e antimycin um²¹, inibidores dos complexos da cadeia de transporte de elétrons I e III, respectivamente, indicam a quantidade de consumo de oxigênio não-mitocondrial na cérebro. Este ensaio é um exemplo de respiração como mitocondrial em uma mosca cérebro pode ser comparado e como este protocolo pode ser usado para comparar o metabolismo em diferentes genótipos. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para medir o consumo de oxigênio simplesmente basal e taxas acidificação do extracelular, bem como quanto projetar mais elaborados estudos investigando a utilização de energia específica ou hipóteses de utilização de substrato.

Protocolo

1. ensaio de preparação (dia 1)

1. Coloque o analisador metabólico (Tabela de materiais) em uma incubadora ou uma sala climatizada para 11 ° C.
   Nota: Esta temperatura é ideal para medições em 25 ° C, pois permite a flutuação de temperatura ~ 14 ° C que ocorre durante a execução do ensaio. Isto é causado pelo calor gerado pelo instrumento durante a execução.
2. Abra o software apropriado no computador ligado ao analisador metabólico. Clique sobre a temperatura numérica no lado inferior esquerdo da tela. Na nova janela que se abre, clique na caixa ao lado do comando "Aquecedor em" e certifique-se de que uma marca de seleção aparece. Ajustar a temperatura a 25 ° C e ajustar o intervalo de tolerância de 0,2 ° C, usando as setas.
   Nota: Várias horas são necessárias para alcançar temperaturas estáveis.
3. Abra o recipiente de cartucho (Tabela de materiais) e remova o cartucho da placa de utilitário sem tocar as sondas.
   Nota: A placa do utilitário é usada durante a calibração do cartucho e não é usada enquanto o ensaio metabólico é executado.
4. Adicione 200 μL de uma solução de calibrant (Tabela de materiais) para o prato de utilitário e coloque o cartucho de volta em cima da placa de utilitário para Re-hidratar o sensor sondas no cartucho. Não toque as sondas e proteja-os da luz.
5. Sele o cartucho com a película de parafina.
6. Incubar o cartucho durante a noite a 25 ° C.

2. ensaio preparação de mídia (dia 2)

1. Adicione 10 mM glicose e piruvato de sódio de 10 mM para o doseamento.
2. Incube a médio a 25 ° C até que o líquido tem equilibrado para esta temperatura.
3. Ajuste o pH para 7,4 usando um medidor de pH.

3. instalação do Software para a análise metabólica dos cérebros Drosophila melanogaster (dia 2)

1. Configure o software metabólico no analisador metabólico usado na etapa 1.2.
2. Selecione "Modelo" na tela inicial do software.
3. Clique duas vezes em "Blank" para iniciar um novo projeto de ensaio.
4. Clique no botão "Mapa de placa" na barra superior para ver o desenho da placa de ensaio de célula.
   Nota: A placa de ensaio de célula conterá as amostras de cérebro e será emparelhada com o cartucho antes de começar o ensaio metabólico executar.
5. Clique em Adicionar grupos botão x 3.
   1. Clique duas vezes sobre o rótulo de "Grupo 1" e renomeá-lo para "Experimental".
      Nota: Este grupo irá conter um cérebro voar e um sistema de retenção de microtecido tratado com drogas.
   2. Clique duas vezes sobre o rótulo de "Grupo 2" e renomeá-lo para "Controle".
      Nota: Este grupo irá conter um cérebro voar e uma retenção de microtecido com tratamento sem drogas.
   3. Clique duas vezes sobre o "grupo 3" rotular e renomeá-lo para "retenção apenas".
      Nota: Este grupo irá conter uma retenção de microtecido sem cérebros ou tratamento medicamentoso.
6. Atribua os poços para cada grupo com base em onde amostras da placa de célula são destinadas a ser colocados.
   1. Clique sobre o rótulo de "Experimental" e realce poços B2 - B8 no mapa da placa.
   2. Clique na etiqueta "Controle" e em seguida, destaque poços C2-C8 no mapa da placa.
   3. Clique sobre a "etiqueta única" de contenção e, em seguida, destaque poços D2-D8 no mapa da placa.
   4. Verifique que todos os quatro cantos (A1, A12, H1 e H12) são designados como plano de fundo.
      Nota: Poços ao longo do perímetro da placa não são usados para reduzir os efeitos de borda. Esta é uma configuração padrão do software.
7. Clique no botão "Protocolo" na barra superior para configurar o protocolo.
   1. Clique em "detalhes de medição Edit" na caixa de medição da linha de base.
   2. Ajuste o tempo que o analisador metabólico vai medir o cérebro, alterando a medida basal tempo de ciclo para "03:00", clicando em cima e para baixo.
   3. Ajustar o tempo que o analisador metabólico aguardará entre medições de cérebro alterando a basal espera tempo de ciclo para "0:00", clicando em cima e para baixo.
   4. Ajustar o tempo que o analisador metabólico misturará a mídia antes da medição do cérebro, alterando o basal mistura tempo de ciclo para "01:00" clicando em cima e para baixo.
   5. Ajustar o número total de ciclos basais, que inclui a medida, espera e ciclos de mistura, a "7" , clicando em cima e para baixo.
      Nota: As medições da taxa de consumo de oxigênio estável são obtidas depois de ~ 25 min, desde o início do ensaio.
   6. Clique no botão "Adicionar a injeção", localizado na barra superior esquerda.
   7. Clique sobre o rótulo de"injeção" e mude para "Oligomicina".
   8. Ajuste a medida de injeção, espera e tempos de mistura para que correspondam para a basal.
   9. Ajuste o número total de ciclos de injeção para "6", clicando em cima e para baixo.
   10. Repita as etapas 3.7.6 - 3.7.8 mas alterar o rótulo de "Rot/AA" e ajuste o número total de ciclos de injeção para 7 clicando em cima e em baixo setas.
   11. Clique no botão "Executar ensaio" na barra superior.
   12. "Salvar" o ensaio e começar a configurar o cartucho do ensaio (Tabela de materiais).

4. preparação do cartucho para a calibração (dia 2)

1. Remova o cartucho da incubadora a 25 ° C e retire a tampa.
   1. Adicionar 20 μL de 100 μM oligomicina para o porto de injeção circular pequena superior esquerdo, A porta, no cartucho para poços experimentais tudo correspondentes na placa celular e adicionar 20 μL de mídia do ensaio a porta A todos os outros poços, incluindo poços de controle e plano de fundo.
      Nota: O cartucho contém 4 portas (A-D) para cada um dos 96 poços correspondente à placa de célula que irá conter as amostras. Esta etapa é executada antes de adicionar as amostras. Adicionar 20 μL de 100 resultados de oligomicina μM em uma concentração de oligomicina final μm 10 na célula placa bem, uma vez que a droga é injetada pelo analisador metabólico. Oligomicina é um inibidor da ATP sintase. O valor de consumo de oxigênio resultante refletirá a quantidade de ATP-ligada a respiração no cérebro. A fim de injetar corretamente as drogas nos poços especificados, todas as portas da mesma carta devem ser preenchidas com o mesmo volume de líquido, até mesmo, se não em uso.
   2. Adicionar 22 μL de 50 μM A rotenona/antimycin à porta superior direita circular pequena, porta B, no cartucho para poços experimentais tudo correspondentes na placa celular e adicionar 22 μL de mídia do ensaio a porta B de todos os outros poços, incluindo poços de controle e plano de fundo.
      Nota: Isto resulta em uma final rotenona/Antimycin uma concentração de 5 μM em placa de celular bem, uma vez que a droga é injetada pelo analisador metabólico. Rotenona e antimycin A são inibidores do transporte de elétrons da cadeia complexos I e III, respectivamente. O valor de consumo de oxigênio resultante refletirá a respiração mitocondrial-não no cérebro.
   3. Clique em "Iniciar Executar" para colocar o cartucho carregado com a placa de utilidade para o analisador metabólico com poço A1 posicionado no canto superior esquerdo, quando enfrenta o instrumento, com o carregador placa estendendo-se do lado direito da máquina.
2. Selecione "Estou pronto" no software para começar a equilibração e a calibração do cartucho antes de começar o ensaio metabólico com a placa de células contendo as amostras.
   Nota: O programa vai pedir para salvar o arquivo e em seguida começar desenroscada e calibrando. Estas medidas podem tomar até 1 h. etapas 5 a 8 são realizadas durante o tempo de equilibração e calibração.

5. preparação dos apoios de Microtecido (dia 2)

1. Selecione 1 retenção de microtecido por um cérebro que está sendo medido, além de pelo menos 3 para uso como controles somente retenção, a partir do recipiente de armazenamento (contém 70% de etanol).
2. Enxagúe as amarras com etanol a 70% fresco e lave-os com água desionizada 3 x por 2 min cada, usando uma cesta de malha e placa de 6 (Tabela de materiais). Adicione água adicional lava-se as restrições ainda emitem um odor de álcool.
3. Lave os apoios de microtecido em meios de ensaio e deixá-los nesta solução até que estejam prontos para uso.

6. dissecação de Drosophila melanogaster cérebros Larval (dia 2)

1. Selecione final (errante) terceiro instar as larvas de um frasco de moscas de Oregon-R cultivadas usando de alta precisão, estilo 5 pinças (0.10 x 0.06 mm²).
2. Coloque a larva no bem de um dissecação local prato limpo (Tabela de materiais) contendo 500 μL de 1X PBS.
   Nota: Um prato local é uma placa de vidro com depressões, usada para dissecar os organismos e tecidos pequenos.
3. Lave a larva agitando suavemente no poço, usando uma pinça.
4. Mova a larva para o poço limpo de um prato local contendo 500 μL de 1X PBS.
5. Coloque a chapa de ponto sob o microscópio de dissecação.
6. Agarre a larva em sua cintura com um par de pinças, enquanto agarrando os ganchos do olho com um segundo par de pinças.
7. Delicadamente e suavemente puxe a larva em direções opostas, usando os dois conjuntos de pinças.
8. Visualize o cérebro, que normalmente fica ligada para os ganchos de olho e comumente vão ter olho-antenais discos anexado a ele.
9. Remova cuidadosamente adicionais tecidos do cérebro, usando os ganchos de olho para manter o cérebro no lugar. Por último, separe os ganchos de olho do cérebro.
10. Use uma pinça para mover o cérebro dissecado para um novo poço num prato local contendo 1X PBS.
11. Repita as etapas de 6.1 – 6.10 até 14 cérebros são dissecados.
    Nota: O tempo total desde o início da dissecação para a execução do ensaio não deve exceder 30 min.

7. adição dos cérebros dissecados à placa de célula de ensaio metabólico de 96 poços (dia 2)

1. Adicione 50 μL de mídia ensaio aos poços da placa de 96 poços metabólica do ensaio (Tabela de materiais), sendo usado no experimento, incluindo o experimental, controle, retenção somente e poços de fundo.
2. Coloque cuidadosamente o cérebro de um em cada poço de A8-A2 e B2-B8 da placa celular, usando uma pinça, uma espátula ou uma pipeta.
   Nota: Isto pode ser feito longe do microscópio de dissecação.
3. Sob o microscópio de dissecação, use uma agulha torta microsonda afundar a cabeça para o fundo do poço.
4. Posicione suavemente o cérebro no meio de três esferas levantadas usando a sonda.

8. adição dos apoios de Microtecido para a placa de célula de ensaio metabólico de 96 poços (dia 2)

1. Usando uma pinça, coloque o apoio de microtecido na borda da placa de ensaio bem e usar o microscópio para inspecionar é orientado com o anel de plástico voltada para baixo e a malha por cima.
2. Retire a placa debaixo do microscópio e usar uma pinça para compreender o sistema de retenção em ambos os lados e delicadamente, solte-o no poço.
3. Use uma agulha torta microsonda para empurrar a contenção para baixo dentro do poço.
4. Sob o microscópio, verifique se que o cérebro pode ser visto através da contenção do tecido e que está centrada no poço.
5. Repita os passos 8.1 – 8.4 para todos os poços que serão no ensaio — A8-A2, B2-B8 e C2-C8.
6. Adicione cuidadosamente 130 μL de mídia de ensaio para cada um do experimental, controle e retenção somente poços.
7. Verifique se que o cérebro e apoios de microtecido não moveram ao adicionar mídia visualizando-las sob o microscópio.
8. Adicione 180 μL de mídia de ensaio nos quatro canto poços para uso como controle de fundo.

9. a adição da placa da célula para o analisador metabólico e o início do ensaio (dia 2)

1. Verifique se o equilibrio e a calibração completas por aguardando o software solicitará a placa de células que contém a amostra.
2. Selecione "Abra a bandeja" e esperar que o instrumento ejetar a placa do utilitário.
3. Retire a placa de utilitário e adicionar a placa de celular, sem a tampa, na mesma orientação.
4. Selecione "carga placa de células" para o instrumento para levar a placa de células e fechar a bandeja e então começar o ensaio.
5. Ver os as medições em tempo real com barras de erro na tela do computador que está executando o software.
6. Retire a placa de células ejetada e cartucho quando o ensaio for concluído.
   Nota: Cartuchos emparelhados e placas de célula pode ser re-utilizadas 5 x.

10. pós-medição análise (dia 2)

1. Usar um dissecação microscópio para verificar se o cérebro e os apoios de microtecido ainda estão posicionados corretamente no poço após o ensaio foi concluída. Exclua qualquer poços com anormalidades da análise.
2. Exportação a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e os dados de taxa de acidificação extracelular (ECAR) para posterior análise.

Resultados

O protocolo apresentado aqui requer o uso de apoios de microtecido que atendam as especificações descritas abaixo. Usando outros métodos para manter a cabeça no lugar na parte inferior da placa de 96 poços de célula não tiveram sucesso (Figura 2A e 2B). Primeiro, testaram-se vários agentes para aumentar a aderência do tecido para a placa. Um adesivo de tecido comercialmente disponíveis (Tabela de materiais) é recomendado para o uso de células e organoids com placas de celulares e placas de esferoide, respectivamente. Inicialmente, o cérebro apareceu a aderir à superfície bem; no entanto, as leituras de consumo (OCR) de oxigênio foram baixas, e observar os poços após o ensaio revelou que o cérebro já não foram anexado à superfície bem (Figura 2A). Os mesmos resultados ocorreram com super cola (Figura 2A). Em seguida, fabricação de telas pequenas para manter o cérebro dentro de uma pequena câmara no fundo do poço foi tentada (Figura 2B).

Telas de metal produziram altas leituras de OCR sozinhas, como de metal telas com um anel de polímero segurando a tela no lugar (Figura 2B). Malha de plástico foi usada com o mesmo anel de polímero. Este dispositivo causou uma leitura negativa de OCR ser obtido. Finalmente, apoios de microtecido foram projetados usando um polímero inerte para o anel de medição um diâmetro exterior de 0.146 em, um diâmetro interno de 0.1335, em uma espessura de 0,0125 em e uma altura de 0,016 pol (Tabela de materiais). Super cola (Tabela de materiais) foi usada para fixar o anel a uma malha de nylon com um tamanho de poro específico de 0,0039 em de diâmetro (Tabela de materiais). O tamanho dos poros é crítico, que permite a troca de mídia e metabólito sem a formação de bolhas de ar, no entanto, ainda age como uma barreira para o cérebro. Estas restrições sozinhos resultam em pouca ou nenhuma OCR leituras e quando usado com inteligência, permitem leituras reprodutíveis (Figura 2A e 2B). A verificação após o ensaio mostrou que o cérebro ainda foram posicionado corretamente nos poços. Estas restrições de tecido atualmente não estão disponíveis comercialmente, mas podem ser fabricadas seguindo especificações acima. Enquanto isso requer fabricação precisa, a maioria das lojas de máquina será capaz de reproduzir esta contenção utilizando os materiais acima referenciados.

O protocolo foi otimizado ainda mais a conta para a mídia de ensaio, o tempo permitido antes de executar o ensaio e a temperatura (Figura 3). Inicialmente, os ensaios foram criados no meio de Schneider para modelar o ambiente larval na vivo . No entanto, os meios de comunicação utilizados não podem conter agentes tamponadores desde que o pH é usado para medir a ECAR. Essa mídia, assim, tem que ser personalizada feita, que é caro. Para otimizar este, uma mídia de ensaio comercialmente disponível projetada para análise metabólica (Tabela de materiais) foi usada no lugar da mídia Schneider. Os níveis de OCR não foram alterados, mesmo quando aumentando os níveis de glicose ligeiramente para condições de meios de ensaio de modelo (Figura 3A). Todos os ensaios a partir deste ponto, realizaram-se no meio de ensaio. Os suplementos aos meios de comunicação foram otimizados, observando se o consumo de oxigênio e as taxas de acidificação do extracelular mostraram uma resposta quando tratados com inibidores mitocondriais conhecidos. Em seguida, o tempo de espera entre as dissecções e o ensaio é executado foi analisado. Uma incubação de 3 h caiu significativamente os níveis de OCR (Figura 3B). Figura 3D demonstra a diferença no sexto ponto de tempo, que é quando os níveis de OCR e ECAR estabilizar para cérebros adultos e larvas. Assim, o protocolo indica para começar o ensaio imediatamente após as dissecações, a menos que o experimento requer um equilíbrio de temperatura, em que é sugerido caso uma incubação por menos de 30 min. O analisador metabólico é armazenado na incubadora, conjunto de 11 ° C para permitir a uma temperatura de 25 ° C durante todo o ensaio. Se as temperaturas são elevadas devido a temperatura ambiente e a operação do instrumento, redução dos níveis de OCR é observado (Figura 3). Esta é a hipótese de ser devido à morte do tecido.

Quando as condições otimizadas são seguidas, os ensaios com as larvas e adultos cérebros leituras de OCR ligeiramente superior a 150 pmol/min no estabilizado sexta vez aponte, ~ 25 min para o ensaio (Figura 4B). Esta taxa é mantida pelo menos 30 min (Figura 4A) e até 2 h (dados não mostrados). A ECAR é ligeiramente inferior nos cérebros adultos do que em cérebros larvas no sexto ponto de tempo (Figura 4) e é mantida pelo menos 30 min (Figura 4). Este achado corresponde a um aumento da glicólise durante os estágios larvas para apoiar o crescimento. Uma injeção com um inibidor mitocondrial, como oligomicina, reduz as leituras de OCR para revelar a respiração de ATP-dependente e ainda mais o tratamento com rotenona e antimycin A abaixa o OCR para revelar o consumo de oxigênio não-mitocondrial (Figura 5A ). Este dados demonstram que estes inibidores são capazes de penetrar no tecido cerebral e podem ser usados para comparar a respiração mitocondrial nos cérebros de diferentes genótipos. Para este ensaio, a mistura, espere, e tempos de medida foram otimizados, observando os níveis de oxigênio, não a taxa de consumo e garantindo que após a mistura, o nível de oxigênio é retornado ao nível inferior da medição.

Figura 1: um diagrama esquemático das medições de OCR e ECAR cérebro larval no analisador metabólico. O cartucho é preparado um dia antes da execução do ensaio. No dia seguinte, drogas são adicionadas aos portos de injeção do cartucho. D. melanogaster larvas cérebros são dissecados e apoios de microtecido são adicionados para proteger o cérebro para o fundo do poço. A placa de células com o cérebro é analisada no analisador metabólico e os dados são analisados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: restrições de Microtecido não são metabolicamente ativas e mantenha o cérebro em uma câmara no fundo de um prato bem. (A) o OCR de cérebros larvas de Oregon-R D. melanogaster é medido em Poços revestidos com adesivo de tecido (Tabela de materiais) ou quando o cérebro é super colado ao fundo do poço. Os resultados são comparados aos de cérebros posicionados no fundo do poço usando restrições de microtecido. (B) o OCR é medido em poços contendo meios de ensaio e metal, metal com um anel de polímero, malha de plástico e um anel de polímero ou apoios de microtecido. p-valor < 0.05, * * p-valor < 0,01, * * * p-valor < 0,001, * * * p-valor < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: otimização dos meios de comunicação, tempo de incubação e temperatura. OCR-o (A), é medido em Oregon-R D. melanogaster larval cérebro usando mídia Schneider (S2) com piruvato de sódio adicionado, S2 com glicose e piruvato de sódio adicionado e ensaio de mídia com piruvato glicose e sódio adicionado. (B) o OCR é medido em cérebros larvas após 3 h de incubação antes do ensaio, ou após 30 min de incubação antes do ensaio. (C) o OCR é medido em cérebros larvas no ensaio executado temperaturas de 33 ° C e 25 ° C. O sexto ponto de tempo é graficamente. O OCR (D) é medido em cérebros larvas após 3 h de incubação antes do ensaio, ou após 30 min de incubação antes do ensaio. Os dados são relatados para o sexto ponto de tempo. p-valor < 0.05, * * p-valor < 0,01, * * * p-valor < 0,001, * * * p-valor < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O OCR e ECAR reproducibly são medidos em adulto e larva d. melanogaster cérebros. (A) o OCR é medido nos cérebros de adultos e larvas de Oregon-R D. melanogaster para dados de 30 min. (B) o OCR do sexto ponto do painel A tempo é graficamente. Este é o ponto de tempo em que as leituras de OCR estabilizar. (C) a ECAR é medido nos cérebros de adultos e larvas de d. melanogaster para dados de ECAR a 30 min. (D) do ponto sexto tempo do painel por é graficamente. Este é o ponto de tempo no qual as leituras ECAR estabilizar. p-valor < 0.05, * * p-valor < 0,01, * * * p-valor < 0,001, * * * p-valor < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Oligomicina reduz os níveis de cérebro larval OCR de d. melanogaster revelar respiração ATP-dependente, e rotenona/antimycin mais reduz o OCR para revelar o consumo de oxigênio não-mitocondrial. (A) o OCR é medido em Oregon-Rd. melanogaster larval cérebro após um tratamento com um 20 oligomicina µM e 5 µM rotenona/antimycin A mistura. O controle e retenção somente poços foram injetados com mídia de ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, um novo método para a análise metabólica de d. melanogaster cérebros larval e adulto ex vivo é descrito. Em condições basais, consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular indicam como metabolicamente ativas no cérebro é e pode determinar se um tecido tornou-se mais dependente mitocondrial contra glicolítico respiração, respectivamente¹¹.

Tratar o cérebro com inibidores ou drogas terapêuticas pode fornecer mais informações sobre o status metabólico do tecido. Substratos metabólicos também podem ser adicionados para determinar as dependências em metabolitos específicos, como a glicose para testar o efeito de Warburg²² ou glutamina para investigar glutaminolysis²³— ambos comum em reprogramação metabólica. Para estudos de longo prazo, as larvas ou moscas também poderiam ser alimentadas drogas em vez de usar os portos de injeção, e cérebro poderia ser analisado em intervalos ou no ponto final, dependendo do projeto experimental. Este método pode ser otimizado para numerosas aplicações.

Este método foi otimizado para o cérebro, mas pode ser usado para analisar outros larval¹⁸ e tecidos adultos. Além disso, outros sistemas modelo pequeno podem usar esse método para medir todo organismos¹⁸ ou tecidos. A única limitação para otimizar esse método para outros sistemas é o tamanho do órgão, tecido ou organismo. A câmara criada por apoio de microtecido é a barreira do tamanho para execução do ensaio. Se a saída metabólica é demasiado baixa para o cérebro ou o tecido a ser testado, e o tamanho da amostra não é uma restrição, pool de amostras pode ser usado para aumentar a sensibilidade e medidas de ensaio. Modificar este protocolo para outras aplicações só deve exigir pequenas otimizações, incluindo 1) escolher a medida adequada e misture números de ciclo e sincronismo e 2) determinar as concentrações de tratamento eficaz para o tecido. A medida e mistura vezes foram determinados pela monitorização concentração oxigênio medida pelo analisador metabólico durante cada ciclo. Isto pode ser visto, selecionando O₂ no botão eixo Y2 na janela de visão geral, após a conclusão da corrida. Durante cada ciclo, deve haver uma concentração de oxigênio drop-in refletindo o consumo de oxigênio do tecido durante o tempo medido, seguido por um retorno à concentração inicial de oxigênio durante o ciclo de mistura. Os tempos de medida e mistura devem ser testados até que este padrão é observado. Usando este método, foram estudados outros cérebros de insetos. Estes cérebros eram maiores do que o cérebro voar usado aqui, mas ainda cabe dentro da câmara gerada pelo apoio de tecido. As leituras de OCR destes cérebros eram tão altas quanto 400 pmol/min (dados não mostrados). Os resultados destes estudos, bem como taxas de OCR que alinharem com outros estudos de medição de oxigênio todo-mosca consumo^18,24, sugerem que o cérebro de d. melanogaster não oxigênio limitado. Para cérebros de d. melanogaster e tecidos de outros organismos, aplicar este método requer uma atenção especial às quatro etapas críticas.

Para conseguir com sucesso medições reproduzíveis e biologicamente relevantes, existem passos críticos do protocolo que deve ser seguido. Primeiro, o uso de uma retenção de microtecido é necessário para este método. Estas restrições usando as especificações e materiais listados de fabricação é essencial. Os materiais foram selecionados devido à sua composição química inerte e sua capacidade de permitir a troca de mídia adequada durante as etapas de mistura sem a criação de bolhas de ar. Em segundo lugar, uma preparação atempada de dissecção e a placa é necessária para maximizar a saída metabólica do tecido. Vezes curto dissecação não devem comprometer significativamente o cérebro. Outros estudos têm mostrado que voar cérebros podem ser mantidos vivos por horas e dias após dissecação se devidamente armazenada em uma perfusão de câmara²⁵. No entanto, como visto na Figura 3B e 3D, se cérebros ficam sentados em meios de ensaio por longos períodos de tempo antes do ensaio, as taxas de consumo de oxigênio são menor. Durante o ensaio, amostras passam por uma etapa de mistura durante cada ciclo. Esta mistura não só ajuda com as injeções de compostos químicos, mas também actua para recircular os meios de comunicação e fornecer oxigênio. O cérebro é capaz de ficar metabolicamente ativas por períodos mais longos durante esses ciclos de medida-mistura do que eles iria ser incubando na mídia sobre a bancada. Portanto, a dissecação de cérebros larvas deve ser dominada antes de começar a configurar este ensaio. Quando configurar este ensaio, analisar um pequeno número de genótipos ao mesmo tempo, para minimizar o número de cérebros necessários e poços utilizaram. Isto evitará atrasos entre a dissecação e as medições de ensaio. Em terceiro lugar, manter uma temperatura estável é necessário analisar as taxas metabólicas em condições fisiologicamente relevantes. Temperaturas de ensaio aumento podem causar a morte do tecido, observada por baixas taxas de consumo de oxigênio (Figura 3). Se moscas são criadas em uma temperatura diferente para fins experimentais, as medições devem também efectuar a esta temperatura. Enquanto as dissecções mais provável serão realizadas à temperatura ambiente, se o ensaio será realizado a uma temperatura diferente, o cérebro chapeado e contido deve ser incubado à temperatura pretendida por 15 min antes de executar o ensaio. Por último, observando-se o pós-ensaio poços é fundamental para determinar se posicionando o tecido afetado as medições. Ocasionalmente, haverá um outlier bem que, depois de observar a placa sob o microscópio de dissecação, pode ser eliminado a partir da análise de dados devido a qualquer perda de tecido ou bloqueios, onde o cérebro caiu fora do centro do poço e é preso sob o anel de polímero da restrição. Tecido pode ser perdido se a contenção não foi protegida corretamente ao poço e foi perturbada durante os ciclos de misturando. Enquanto nenhum destes eventos acontece muitas vezes, se não são excluídas da análise, eles irão diminuir substancialmente os valores de taxa.

A medição de fluxo metabólico de todo tecido pelo monitoramento de consumo de oxigênio e a acidificação do extracelular fornece um método biologicamente relevante para a compreensão de como o metabolismo é alterado pela paisagem genética ou outras condições experimentais. Este método é suficientemente sensível para detectar alterações metabólicas em um único cérebro d. melanogaster , que não é possível usando o fluxo de paragem respirometria ou calorimetria indireta. É também menos tecnicamente desafiador do que usando um eletrodo de Clark para medir o consumo de oxigênio. Uma vantagem adicional do presente protocolo é a capacidade de analisar um cérebro inteiro por bem. O formato de 96 poços permite leituras mais sensíveis, e assim, mais de um genótipo pode ser analisado em um momento devido ao menor número de amostras necessárias por ensaio. Enquanto medindo o metabolismo no tecido é ainda um desafio e requer cuidadosamente criados e animais sincronizados, este protocolo descreve um método rápido e relativamente simplista e tem o potencial de analisar inúmeras sensibilidades metabólicas em D. melanogaster cérebros larvas e adultos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assay medium	Agilent	102365-100
Calibrant solution	Agilent	100840-000
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive	Sigma Aldrich	DLW354240
delrin	Grainger	2XMK6
Drosophila Schneider Media	Thermo Fisher	21720-024
Dumont High Precision Tweezers (style 5)	Ted Pella	5622
Loctite 409	Amazon
Mitostress kit	Agilent	103015-100	oligomycin, rotenone, and antimycin A included
Netwell inserts (6-well)	VWR	29442-136
nylon mesh	Component Supply	U-CMN-64
Parafilm M wrapping film	Fisher Scientific	S37440
PYREX spot plate	Fisher Scientific	13-748B
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Wave v2.4 XFe96 analyzer software	Agilent	https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop	free download to mac or windows
XFe96 catridge and cell plates	Agilent	102416-100