Analisando a aprendizagem espacial e comportamento pró-social nos ratos usando o labirinto de Barnes e paradigmas de donzela em apuros

Resumo

Este protocolo mede aprendizagem espacial e memória usando o labirinto de Barnes. Um novo paradigma de donzela em apuros é usado para avaliar a atividade locomotora e comportamento pró-social em camundongos.

Resumo

O labirinto de Barnes é uma medida confiável de aprendizado espacial e memória que não necessita de restrição alimentar ou a exposição a estímulos extremamente estressantes. O labirinto de Barnes também pode avaliar outros comportamentos do mouse, como motivação geral para escapar da plataforma do labirinto e comportamento exploratório. O labirinto de Barnes pode medir se uma mutação genética ou ambiental variável pode impactar a aquisição e retenção de memória espacial, bem como fornecer informações sobre a estratégia de pesquisa utilizada pelos ratos. Aqui usamos o labirinto Barnes para detectar um défice de memória em ratos adultos após um evento de exposição de etanol no desenvolvimento único. O paradigma de donzela em apuros recém descrito expõe um rato masculino para um rato fêmea preso em uma câmara no campo aberto do centro da arena. Ele fornece uma oportunidade para o rato socialmente responder a fêmea presa e exibem comportamento pró-social. O paradigma de donzela em apuros também pode ser usado para examinar o comportamento do mouse em uma atividade de locomoção novela arena e medida. Tanto o labirinto de Barnes e os protocolos de donzela em perigo exigem investimento financeiro mínimo e quase todos os aspectos dos testes podem ser construídos a partir de fontes comuns de laboratório. Essas ferramentas flexíveis e acessíveis também podem ser usadas para detectar mudanças de comportamento ao longo do desenvolvimento.

Introdução

O propósito do presente protocolo é medir a aprendizagem espacial e memória em camundongos usando o labirinto de Barnes, bem como capacidade de resposta social e locomoção utilizando o paradigma de donzela em perigo. Comumente usado testes de aprendizagem e memória espaciais para roedores incluem o labirinto radial do braço, que mede a capacidade de um mouse para encontrar comida escondida em um braço de um aparelho multi-raiadas, e o labirinto de água Morris, que coloca um rato em uma banheira grande ou poça de água e avalia o tempo que demora para encontrar uma plataforma escondida debaixo d'água. Normalmente, a formação para esses paradigmas abrange vários ensaios e permite a medição de ambos aprendizagem taxas de aquisição e retenção através de curto prazo e testes de memória a longo prazo.

Embora o labirinto radial-braço e o labirinto de água de Morris são formas confiáveis para testar a memória em roedores, apresentam complicações para alguns pesquisadores. Ambos os labirintos usam privação ou fortes estímulos aversive como reforço¹. O labirinto de braço radial usa privação de comida para garantir que os roedores são devidamente motivados para encontrar uma recompensa de comida. No labirinto de água de Morris, os efeitos do estresse induzido por um mergulho forçado podem alterar resultados no²ratos.

O labirinto de Barnes é uma tarefa de consciência espacial alternativa que requer roedores aprender a posição de um buraco para escapar a superfície brilhante, aberto labirinto³. Estimulação aversive fraca (luz ou som) é então aplicada para aumentar a probabilidade de que os ratos vão escapar da plataforma. O labirinto de Barnes não requer privação de comida, então a quantidade de animal preparação é menor do que no labirinto de braço radial. Pode ser usada sem conflito por pesquisadores que estão investigando comportamentos ou moléculas associadas com comer, regulação hormonal ou vias hipotalâmicas.

O labirinto de Barnes também tem vantagens sobre o labirinto de água de Morris. É menos estressante do que o labirinto de água Morris, causando menos elevados níveis de corticosterona em ratos⁴. Além disso, é muito mais simples de montar e requer menos dedicado espaço durante o procedimento de teste e armazenamento.

O ensaio de donzela em apuros é um experimento simples de duas partes que pode avaliar a atividade locomotora, seguida por comportamento pró-social. O ensaio de donzela em apuros é projetado para avaliar comportamentos exploratórios e responsividade social de um roedor masculino em resposta a um roedor feminino aprisionado. Um método comumente usado para avaliar a sociabilidade (bem como preferência por novidade social) é o uso do teste de sociabilidade da três-câmara de Crawley, que avalia a livre escolha de um mouse para passar o tempo perto ou longe de outros ratos⁵.

Semelhante ao teste de sociabilidade da três-câmara de Crawley, o ensaio de donzela em apuros também medidas de livre escolha sobre como gastar tempo na presença de outro rato, mas ele também fornece medições para aspectos mais profundos de funcionamento social: 1) na Ensaio de donzela em perigo, o rato encurralado feminino é realizado no centro de um campo aberto, portanto aversão ao potencial do macho, para um campo aberto é confrontado com sua unidade socialmente explorar ou investigar uma fêmea angustiada coespecífica. 2) o modelo de donzela em apuros também fornece uma forma de avaliar o comportamento pró-social e empático, em resposta ao rato encurralado, que não tem sido explorado com frequência em camundongos.

Empatia animal é definitivamente observáveis e mensuráveis, embora não muitos paradigmas existem para esta finalidade. Por exemplo, em ratos, um companheiro de gaiola preso pode induzir um estado de motivação pró-social, onde ratos funcionará para libertar o animal. Na verdade, ratos irão escolher para ajudar o animal, mesmo antes de abrir um recipiente similar contendo um lanche chocolate, então acessar o chocolate e compartilhá-lo com o rato recém libertos⁶.

Medidas de empatia em camundongos normalmente envolvem a inflição de dor; com efeito, ratos que assistem outros ratos na dor são mais sensíveis à dor se^7,8. Stress de contenção é um fenômeno caracterizado em roedores e tem sido associada a choque para examinar as respostas de estresse, como uma medida de empatia em camundongos^9,10.

Existem considerações éticas associadas com dor induzida ou choque, assim alternativas indutoras de stress são necessários. Nós desenvolvemos o paradigma de donzela em perigo, como uma medida do comportamento empático na ausência de dor ou tratamento de choque. Os ratos presos em nosso protocolo de donzela em apuros mostram sinais aparentes de angústia após apenas alguns momentos, eles são incapazes de virar dentro do pequeno recipiente, mas eles estão ilesos, proporcionando uma oportunidade para os outros ratos responder a sua aflição.

Para começar a avaliação de donzela em apuros, um rato masculino é colocado em uma grande arena de romance que contém um pequeno cilindro central vazio. Comportamentos exploratórios são registrados por vários minutos, incluindo quantas seções da arena são ultrapassadas e quanto tempo é gasto na área central aberta. Este método fornece uma maneira rápida e fácil para descartar déficits locomotoras como uma potencial confundente em uma situação de aprendizagem que requer movimento coordenado para a conclusão bem sucedida. Ele também fornece uma medida básica de quanto aversão ao campo aberto do centro está presente. Ambas as medidas poderiam influenciar o desempenho de labirinto de Barnes.

Após a exploração inicial, o macho é retirado da arena e um mouse feminino é colocado em um cilindro claro central fechado, pequeno (similar ao usado para coletar sangue de ratos). Então, o rato masculino original é reintroduzido na arena, e comportamento exploratório é marcou novamente. O paradigma de donzela em apuros avalia se um mouse está interessado em uma interação social com base nas alterações em padrões de comportamento, quando uma mulher presa está presente (marcados pelo tempo gasto na praça central e o número de episódios de escavação) e se o rato apresenta comportamento pró-social em direção a fêmea presa (marcado pela quantidade de investigações de cilindro e eventos contatos com a fêmea presa). O ensaio de donzela em perigo pode ser usado para medir uma propensão para a novidade social (semelhante ao teste de sociabilidade da três-câmara do Crawley) dependendo se pesquisadores capturar um rato familiar ou romance.

Juntos, o labirinto de Barnes e experimentos de donzela em apuros permitem a avaliação exata do mouse capacidades de aprendizagem e capacidade de resposta social na ausência de estímulos extremamente estressantes. Como com todos os ensaios comportamentais, estas experiências devem ser executadas com grande sensibilidade em relação a experiência animal, minimizando o desconforto experimentado pelo animal.

Como a maioria dos labirintos, diferenças na atividade locomotora podem influenciar o desempenho no labirinto Barnes, então pesquisadores também devem avaliar a atividade locomotora, especialmente quando se utiliza o labirinto Barnes para avaliar aprendizagem em camundongos com mutações que podem afectar o movimento (tais como aqueles encontrados em modelos do rato a doença de Huntington, ou aqueles expostos a substâncias tóxicas que podem provocar hiperatividade ou retardar o movimento, como o etanol). Além disso, labirinto e câmara de superfícies devem ser cuidadosamente limpos e cama mudada entre cada animal para evitar a sugestão de perfume confunde.

Importante, todos os materiais podem ser fabricados no local com o mínimo de investimento financeiro e a pequena pegada física destes ensaios significa que estas experiências podem ser replicadas em praticamente qualquer ambiente, permitindo uma grande flexibilidade. Este tipo de acessibilidade permite boa ciência a ser realizada em instituições menores, com recursos limitados, ou em situações onde piloto dados precisam ser coletados rapidamente na ausência de um apoio substancial.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) de Hampden-Sydney College ou Randolph-Macon College (onde alguns trabalho anteriormente foi realizado).

1. básica habitação dos ratos

1. Os ratos em gaiolas de plástico com fundo sólido e os lados e uma camada de roupa de cama macia e aninhamento de material como papel retalhamento da casa. Use o fundamento que é composto de espigas de milho ralado ou aparas de madeira e certifique-se de que o fundamento é alterado regularmente para saneamento.
2. Fornecer acesso a comida e água ad libitum. O topo da gaiola plástica abriga um funil de alimentação. Dispense as pelotas de alimento corretamente formulado rato do funil comida e fornecer um dispensador de água. Certifique-se de que o topo da gaiola possui um filtro de ar para proteger ratos de contaminantes externos.
3. Manter o ritmo circadiano natural dos ratos, seguindo um ciclo claro-escuro de 12 horas na instalação de habitação. Conduta comportamental testes ao mesmo tempo do dia, idealmente durante o ciclo escuro do animal, tais como durante a noite.
   Nota: Tenha cuidado para distinguir os ratos na carcaça. Vários métodos para ratos distintivos estão disponíveis, como orelha socos, marcas auriculares e marcas de cauda.

2. teste de labirinto Barnes: construção

1. Obter uma placa de madeira circular que é de 120 cm de diâmetro.
2. Corte 20 orifícios circulares (4,5 cm de diâmetro) ao redor do perímetro do círculo. Posição de cada furo para ser 2,5 cm da borda do labirinto e 13 cm além de furos vizinhos.
3. As superfícies lisas e pintá-las de branco brilhante (recomenda-se uma cor brilhante).
4. Designar-se um lado do Conselho labirinto para inserção de um pequeno copo de ganchos aproximadamente 2-3 cm de cada uma das 20 furos e coloque dois ganchos para cada buraco (um de cada lado de cada furo).
5. Use discos de raso preto (plástico) para cobrir buracos no lado do labirinto com ganchos. Utilize ganchos para prender elásticos grossos para segurar os discos para o fundo do labirinto.
6. Monte com segurança o labirinto de Barnes 120 cm acima do chão e longe de outros objetos da mesma forma altos como mesas ou cadeiras. Uma caixa ou fezes podem ser usado para oferecer suporte no meio do labirinto.
7. Coloca grandes cartazes brancos com uma forma em cada parede (triângulo, círculo e Cruz) como pistas extralabirinto em 3 lados do labirinto. Manter os cartazes nas paredes ao redor do labirinto para cada julgamento.
8. Último lado do labirinto, configure uma cortina preta sólida para esconder os observadores para que os dados podem ser gravados com precisão sem os pesquisadores sendo visível aos ratos no labirinto.
9. Suspenda uma câmera de vídeo sobre a arena com uma visão global da superfície inteira do labirinto.
10. Limpe todas as superfícies do labirinto (discos pretos e caixa de destino incluído) com água então uma solução de etanol a 70% antes e após cada julgamento de mouse.
11. Coloque uma fonte luminosa 100 W 25 cm sobre o centro do labirinto (ligar/desligar no início/final de julgamento) e certifique-se de ter os discos e ganchos fique voltada para o chão.
    Nota: Todas as outras luzes aéreas na sala devem ser desligadas durante o teste. Recomenda-se a adição de um fabricante de ruído ultra-sônico pendurado ao lado de 100 W de iluminação. Transformá-lo de ligar/desligar para o início/término de cada julgamento.

3. teste de labirinto Barnes: procedimento

Nota: Certifique-se que todos os componentes do labirinto são limpos com água e 70% de solução de etanol, antes e após cada julgamento, permitindo tempo para secar completamente antes de testar os currículos. Assegure-se de limpeza pronto de suprimentos, bem como temporizadores para os ensaios.

1. Todos os ratos em grupos da casa enquanto estiver usando um método de identificação fiável. Manter os ratos fora da sala de testes, quando eles não estiverem executando ativamente no labirinto. Isso é para garantir que não estão sujeitos ao ultra-som para fazer barulho prematuramente.
2. Lidar com ratos suavemente a apanhar e mantendo-os da base da cauda, com as patas, continuava a mão.
3. Para o treinamento, têm os ratos executar no labirinto uma vez diariamente por dia durante 7 dias em uma fila para avaliar a aprendizagem/aquisição.
   Nota: Um único julgamento a longo prazo pode ser feito em uma data posterior para avaliar/retenção da memória. O protocolo atual treinou ratos adolescentes começando no dia pós-natal 32 e um julgamento longo prazo foi realizado em adultos com 4 meses de idade.
4. Aleatoriamente, atribua cada rato para um buraco de destino para usar durante todo o período de testes. Os furos podem ser rotulados 1-20 no fundo do labirinto ou do lado de fora do perímetro do labirinto, onde eles não são visíveis com o rato no labirinto.
5. Substitua o disco atribuído buraco com uma caixa preta pequena (23 x 11 cm). Firmemente, anexá-lo ao labirinto de Barnes usando elásticos ligados aos ganchos mais próximos.
   Nota: A caixa de destino é superficial suficiente para que o mouse pode descer facilmente nele ou contém uma etapa para garantir que o rato não tem que pular nele.
6. Coloque o mouse sobre o centro do labirinto debaixo de um copo se aclimate por 30 segundos até o início do teste. Começa a gravação de vídeo.
7. Ligue o luz e ultra-sônica para fazer barulho. Levante a taça de através de um mecanismo de sequência de caracteres para evitar a polarização da posição inicial do animal. Iniciar um timer e sente-se atrás da cortina para observar.
8. Depois que o mouse entra no buraco de alvo, tapar o orifício com o mesmo copo opaco usado no início do julgamento ou um fichário e desligar o ultra-som para fazer barulho. Se o mouse não tiver inserido o alvo decorridos 5 minutos, encurralar o mouse no orifício do alvo.
   1. Certifique-se que o mouse entra no buraco. Quando o mouse está dentro da caixa de destino, tapar o buraco e desligue o fazer barulho. Permitir que o mouse permanecer na caixa destino durante 1 minuto sem ser perturbado.
9. Embora o buraco de destino permanecerá constante para cada rato durante todo o período de treinamento, execute os ratos em uma ordem aleatória cada dia para garantir que eles não estão seguindo qualquer sugestões/perfumes deixado pelo mouse anterior.

4. Barnes labirinto de testes: Análise de dados

1. Durante os julgamentos de labirinto de Barnes, gravar o seguinte dados cronometrado: total de tempo gasto no labirinto, na hora de encontrar o alvo e na hora de entrar buraco alvo se o alvo for inserido.
2. Acompanhar o movimento global do mouse para determinar o número de erros (número de furos incorretos exploradas) antes e depois que o alvo é encontrado. Também gravar a distância entre o furo do alvo para o primeiro buraco explorado (a distância é medida em número de buracos embora), juntamente com qualquer notável comportamento de aliciamento.
3. Acompanhar os movimentos de cada animal em um pedaço de papel com um diagrama do labirinto durante cada julgamento e usá-lo para analisar estratégias de pesquisa, bem como determinar o número de buracos que foram exploradas no quadrante oposto o alvo. Use a análise de vídeo para confirmar os caminhos.

5. donzela em apuros teste: construir a câmara de contenção

1. Corte um cilindro claro para um comprimento igual a ¾ do comprimento do mouse feminino da base da cauda à ponta do nariz. Certifique-se de que as dimensões do cilindro são tais que o rato colocado dentro não pode virar.
   Nota: Nós cortamos o fim do cone de um tubo cónico de 50 mL até fazer um tubo longo de 4cm para ratos de 1 mês de idade e um de 8 cm de comprimento do tubo para ratos de 4 meses de idade.
2. Cap ambas as extremidades do cilindro, tal que o Caps pode ser removido e recolocado. 3-4 buracos, cerca de 0,5 cm cada, em cada cap. Certifique-se de que os buracos são grandes o suficiente para permitir que nariz-tocando entre ratos e respiração¹².
   Nota: Como alternativa, um dispositivo de contenção do mouse durante a coleta de sangue pode ser usado.

6. donzela em apuros teste: preparando a Arena

1. Certifique-se de que a arena é uma caixa quadrada plástica em topless opaca de 38 x 38 cm, com paredes de 19 cm. Preenchê-lo uniformemente com fundamento de milho a uma altura de aproximadamente 2,5 cm.
   Nota: O fundamento de espiga de milho faz eventos de escavação mais fácil de detectar.
2. Suspenda uma câmera de vídeo sobre a arena, para que a totalidade da arena está em exibição.

7. donzela em apuros teste: medida de comportamento exploratório

1. Coloque a câmara de estresse fechado e vazio para o centro da arena.
2. Comece a gravar com a câmera suspensa.
3. Selecione um rato masculino. Se os ratos são marcados para identificação, observe a identidade deste macho; Se não, marque este mouse para que ele pode ser distinguido depois de voltar para a gaiola.
4. Coloque delicadamente o rato macho debaixo de um copo no canto inferior esquerdo na arena. Após 30 segundos, retire o copo através de um mecanismo de cadeia de caracteres.
5. Permitir que o mouse para explorar durante 10 minutos, tendo o cuidado de ficar fora do seu campo de visão durante a gravação. No final da 10 min, retire o mouse da arena e devolvê-lo para uma gaiola de exploração para os próximos 5 min¹².
6. Parar a gravação e salvar o arquivo de vídeo com um identificador apropriado.

8. donzela em apuros teste: medida de capacidade de resposta Social

1. Use a mesma configuração de arena e gravação, como a medida do comportamento exploratório.
2. Selecione um rato fêmea. Se os ratos são marcados para identificação, observe a identidade desta fêmea; Se não, marque este mouse para que ele pode ser distinguido depois é retornado para a gaiola.
   Nota: Um littermate, companheiro de gaiola ou rato romance pode ser usado, dependendo da pergunta de pesquisa. Se vários ensaios estão sendo realizados, manter o tipo de relacionamento em todos os ensaios.
3. Segure o mouse feminino suavemente a base da cauda, ou por retenção de pescoço, se necessário e abaixá-lo para a câmara de contenção. Feche a extremidade aberta por trás dele e certifique-se de que é incapaz de girar ao redor.
   Nota: Considere usar luvas resistentes a mordida, como o mouse feminino serão resistente ao entrar na câmara de contenção.
4. Comece a gravar com a câmera suspensa.
5. Coloque a câmara de contenção com o mouse feminino aprisionado dentro no centro da arena de empatia e permitir que a fêmea se aclimate por 10 min. Tome cuidado para manter-se fora campo de visão a fêmea.
6. Após o rato fêmea foi na câmara de contenção por 5 min, posicione o mouse masculino marcado volta para a arena de empatia, usando o mesmo processo como antes. Permitir que o rato masculino um adicional 5 min explorar a arena, mais uma vez tendo o cuidado de manter-se fora do campo de visão dos ratos.
7. Parar a gravação e salvar o arquivo de vídeo com um identificador apropriado.
8. No final da 5 min, remover ambos os ratos da arena e colocá-los em suas gaiolas. Substituir o fundamento de milho e higienizar tanto a arena e a câmara de estresse com 70% de etanol¹².

9. donzela em apuros teste: análise de dados

1. Software de rastreamento pode ser usado, mas o vídeo também pode ser analisado manualmente. Uma vez que o arquivo de vídeo é visível no computador, sobrepor uma folha transparente sobre a tela e contorne a Praça da arena usando um marcador. Divida o quadrado arena em nove compartimentos iguais.
2. Revise os dados de vídeo para o primeiro 5 min da medida inicial exploratória. Registrar o número de compartimentos cruzados (comportamento exploratório/atividade locomotora), o tempo gasto no centro do quadrado da arena (aversão ao campo aberto), número de cavar e episódios de aliciamento e número de vezes que o mouse tocou a contenção de centro vazio Câmara.
   Nota: Pontuação não é feito para o segundo 5 min de exploração inicial de 10 minutos do macho, nem para a 10 min a fêmea é preso na câmara central, na ausência do macho.
3. Revise os dados de vídeo para a 5 min da medida responsividade social imediatamente depois que o macho é reintroduzido na arena com a fêmea presa. Gravar os mesmos dados quanto a medida inicial e exploratória, mas Adicionalmente, registrar o número de vezes que o rato masculino tocou narizes com o rato fêmea preso.

Resultados

O labirinto de Barnes

Para ilustrar como o labirinto de Barnes pode ser usado, investigamos se uma única exposição precoce de etanol causou uma diferença na aprendizagem ao longo do desenvolvimento do mouse. Camundongos C57Bl6/J também foram injetados com uma solução de etanol de 2,5 g/kg (n = 8) ou com solução salina (n = 6) duas vezes, duas horas de diferença, no 6º dia pós-natal. Estamos ...

Discussão

O labirinto de Barnes e os experimentos de donzela em perigo são formas relativamente fácil, rápidas e baratas para avaliar aprendizagem espacial, atividade locomotora e comportamento pró-social em camundongos. Outras vantagens incluem a ausência de estressores ostensivos, dor ou restrição alimentar para o animal. Como a maioria dos paradigmas de aprendizagem/memória, uma desvantagem do labirinto Barnes é o número de ensaios requeridos pelos animais saber onde se encontra o buraco de alvo e entrar.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Damsel-in-Distress
50 mL conical tube	Fisher Scientific	14-432-22	Any brand of 50 mL conical tube will work
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
hammer	Grainger	6R252	Any standard hammer will work
nail (size 8D)	Grainger	4NFE3	Similarly-sized nails should work just as well
opaque, topless plastic box	AcmePlastics	CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025	Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse.
video camera (smartphone)	N/A	N/A	Any camera-equipped smartphone will work
bite-resistant gloves	Kent Scientific	GLVDYN02	Any brand offering appropriate protection
transparency sheet	Staples	954145	Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring
Barnes Maze
Petri Dishes	Corning	353025	Spray painted and used as covers for Barnes maze holes
Plywood (3/4 in.)	LP Building Products	22487	To construct Barnes maze
Spray Paint	Krylon	1274937	Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood
Cup Hooks (5/8 in.)	Ace Hardware	5360615	2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat
Poster Board	Creatology	n/a	Used at edges of maze as extra cues
Light Bulbs	Phillips	n/a	100W light bulb, used to during the trials
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
Ultrasonic noisemaker	Victor mini PestChaser	M753SN	Used as aversive stimuli