Caenorhabditis Peneira: Um instrumento de baixa tecnologia e metodologia para classificação de pequenos organismos multicelulares

Resumo

O protocolo atual inclui uma metodologia para a classificação e a limpeza das populações de idade-combinadas de elegans de Caenorhabditis. Ele usa um simples, barato e eficiente ferramenta sob medida para obter uma grande população experimental de nematoides para pesquisa.

Resumo

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo de bem-estabelecida modelo usado em toda uma gama de pesquisas básicas e biomédica. Dentro da comunidade de pesquisa nematoide, há uma necessidade de uma maneira acessível e eficaz para manter as populações grandes, idade-combinadas de c. elegans. Aqui, apresentamos uma metodologia para mecanicamente classificação e limpeza c. elegans. O nosso objectivo é fornecer um processo econômico, eficiente, rápido e simples para obter animais de tamanhos uniformes e estágios de vida para a sua utilização em experiências. Esta ferramenta, o crivo de Caenorhabditis , usa um sistema de tampa custom-built que tópicos para tubos comuns de laboratório cónico e classifica c. elegans com base no tamanho do corpo. Também demonstramos que a peneira Caenorhabditis efetivamente transfere animais de placa de uma cultura para outra que permite uma classificação rápida, sincronizando e limpeza sem afetar marcadores de saúde, incluindo a motilidade e stress-inducible repórteres do gene. Esta ferramenta acessível e inovadora é uma opção rápida, eficiente e não estressante para manter as populações de c. elegans .

Introdução

O verme nematoide, Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo premier. Além da natureza simples e controlada do seu cultivo em laboratório, todo o seu genoma é sequenciado¹ e o destino do desenvolvimento de cada célula é conhecido². Devido a estas características, c. elegans é um organismo modelo amplamente usado para estudos genéticos. No entanto, juntamente com estas características benéficas vem alguns desafios para os pesquisadores. Devido ao seu tempo de geração rápida, as populações de c. elegans rapidamente podem ficar sem comida e/ou se misturam as populações com várias gerações e estádios de desenvolvimento presentes ao mesmo tempo. Assim, experimentos realizados na mídia de crescimento sólido de nematoides (NGM) exigem pesquisadores mover fisicamente os animais para placas frescas antes da fonte de alimento bacteriana esgota e desenvolvem novas larvas. Isto pode ser tedioso como uma transferência frequente dos animais é necessária para evitar as populações experimentais de tornar-se misturado com gerações de prole. Ainda, alguns experimentos requerem ambos grande número de animais e de pontos de tempo prolongado (por exemplo, extração de DNA ou RNA na idade adulta). Este compostos os desafios com precisão, mantendo uma população sincronizada e transferir um grande número de animais.

Métodos atuais de transferência de c. elegans cultivadas em NGM estão escolhendo ou lavar os animais de placa para placa; quimicamente, tratando os animais (por exemplo, com o DNA replicação inibidor fluorodeoxyuridine ou FUDR); ou usando citometria de fluxo para classificar os animais em placas multi bem. Colheita envolve o uso de uma ferramenta de mão, feito com um arame fino de platina ou um cílio, para transferir manualmente o indivíduo ou vários animais^3,4. Esse método é preciso, mas requer habilidade e tempo e é uma limitação de estudos envolvendo um grande número de animais. Escolher o maio também ser fisicamente prejudiciais e estressante para os animais potencialmente sujeitando indivíduos quantias antinatural e inconsistente de perturbação e força. Lavar roupa envolve um prato de cultura com uma solução tampão de lavagem e transferir a solução com os animais através de uma pipeta Pasteur de vidro para uma nova placa de cultura. Este método é rápido e eficiente, mas não é exato, como várias gerações e estádios de desenvolvimento dos animais são transferidos em massa. Tratamentos químicos, tais como FUDR, podem ser dissolvidos na mídia cultivo para impedir a produção de descendência através de bloquear qualquer replicação do DNA e, portanto, o desenvolvimento de ovos e produção de gametas. Pouco eficaz, este método deve ser aplicado após a maturação do desenvolvimento como para não perturbar os processos do desenvolvimento normais, e isso significa que ainda há um requisito para transferir os animais antes da sua administração³. Esse método também influencia vários celulares vias de sinalização, resultando em efeitos visíveis dos animais com a idade (por exemplo, uma extensão de vida útil ou um proteostasis alterada) dependendo da cepa de c. elegans usado^{5, 6,7,8,9,10}. Métodos de citometria de fluxo automaticamente classificar e transferir individual c. elegans de uma placa multi bem para outro¹¹. Enquanto este método é muito eficaz e eficiente, equipamento de citometria de fluxo é proibitivamente caro e inacessível para muitos pesquisadores. Uma alternativa para transferência de animais é usar modelos mutantes que são sensível, tais como fer-15 e fem-1, que se tornam estéreis com ajuste de temperatura¹²de temperatura. Enquanto usar animais mutantes é útil em algumas situações, estas cepas específicas crescem mais lentamente do que os animais selvagem-tipo e eles contam com um genoma alterado, servindo como pobres representantes para vermes envelhecimento ou saudáveis. Além disso, a dependência de uma mudança de temperatura para induzir esterilidade também resulta na ausência de um ambiente estático, e mudanças de temperatura foram prontamente mostradas para influenciar o gene expressões^{13,14, 15}. grupos de pesquisa têm publicado anteriormente técnicas descrevendo o uso de uma malha para filtrar c. elegans por tamanho¹⁶. No entanto, fomos capazes de encontrar trabalhos anteriores testes para qualquer alteração nos resultados saúde geral podem ser associados com o uso de tais filtros.

Há, assim, uma necessidade um método acessível, eficiente, rápido e preciso para transferir um grande número de animais entre placas de cultura dentro da comunidade de pesquisa de c. elegans . Nós desenvolvemos uma peça melhorada, acessível do equipamento (chamado Caenorhabditis peneira) e um protocolo associado para sua manufatura e operação que atenda às necessidades da comunidade de pesquisa de c. elegans . Aqui, partilhamos o projeto do Caenorhabditis peneira e métodos para sua utilização, e demonstramos que seu uso não afeta a saúde comum ou qualquer marcadores de estresse quando comparado a colheita manual padrão e um tratamento com o comumente usados, restrição da fertilidade química FUDR.

Protocolo

1. Caenorhabditis peneira construção e uso

1. Protocolo de construção
   1. Adquira 2 tampas de tubos de Erlenmeyer de 50 mL (figura 1A).
   2. Remover a área do centro dentro do lábio interior das tampas (quando visto de baixo, figura 1B) usando um bico de Bunsen e uma sonda de metal quente ou um ferro de solda ou pisar a broca.
      Nota: Usando o calor para cortar a tampa de plástico é preferível uma lâmina, porque há menos risco de lesão.
   3. Limpar e lixar as bordas cortadas e cubra a superfície com um arquivo curvado ou um rotativo moer ferramenta (por exemplo, Dremel). Ver Figura 1.
   4. Corte o círculo da malha monofilamento para o diâmetro apropriado (Figura 1). Para isso, trace uma tampa sobre uma folha de malha de nylon monofilamento e corte apenas dentro da linha desenhada.
   5. Corte barras/sulcos na superfície superior das tampas para melhorar a aderência das duas tampas, quando a cola é aplicada para o plástico (Figura 1E).
   6. Limpe as tampas com etanol e deixe-os secar.
   7. Aplique a cola de cianoacrilato para a superfície superior de ambas as tampas, mantendo a borda externa.
      Nota: um pouco de cola vai um longo caminho.
   8. Coloque o engranzamento do monofilamento, de acordo com a tabela 1, em uma tampa colada (Figura 1F). Coloque a segunda tampa invertida em cima da malha; ambas as tampas devem ter seus topos juntos. Pressione firmemente juntos (Figura 1). Certifique-se de que a malha é esticada.
      Nota: como medida de segurança, usar uma pinça para colocar a malha nas tampas.
   9. Uma vez que a camada inicial de cola secou, aplica um anel de cola de cianoacrilato em torno o fosso exterior entre as tampas. Ser generoso como isso agrega integridade e impede qualquer peeling separado ou com vazamento.
   10. Rotule o filtro com o tamanho de poro de malha da malha monofilamento.
       Nota: Aqui, usamos dois tamanhos de poros de malha — 20 µm e 50 µm.
2. Protocolo de uso
   1. Pre-molhado da peneira.
      1. Pipetar uma solução salina, como M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄, 3 g de KH₂PO₄, 1 L de ultrapura H₂O e 1 mL de MgSO₄ (1m)]¹⁷, através do centro da peneira até formar uma gota , condensa e escorre para fora do centro da parte inferior do filtro (Figura 2A). Opcionalmente, aplicar um apagamento de fiapos (por exemplo, Kimwipe) para o fundo de forma ou espalhar uma gota de umidade na malha.
      2. Coloque a peneira sobre um tubo cónico de 50 mL. Rotular o tubo como 'Tubo de resíduos' (Figura 2B).
   2. Lave uma população de c. elegans sobre uma placa de ágar.
      1. Lavar a placa com o buffer M9 e coloque o meio contendo worm da parte de cima da malha monofilamento 1 mL de cada vez (Figura 2). Certifique-se de operar-se no centro da malha. Lave todos os vermes da placa.
         Nota: Normalmente, 3 mL de M9 para uma placa de 60 mm é suficiente.
      2. Para minimizar o número de vermes perdido na pipetagem, use um pipeta Pasteur de vidro para mover os vermes fora da placa e no centro da malha (repetição conforme necessário).
      3. Lave o filtro com o buffer M9 do topo. Novamente, certifique-se de operar-se no centro da malha e lave todos os vermes nessa área. Lave quantas vezes for necessário para garantir que todas as bactérias e vermes menores passaram a malha.
   3. Os animais de tamanho correspondente da peneira da colheita.
      1. Anexe um novo tubo cónico de 50 mL para a parte superior da peneira, com os vermes adultos da etapa 1.2.2.3 voltados para dentro do tubo da nova coleção (Figura 2D).
      2. Remover o primeiro tubo (resíduos) e rapidamente vire a peneira e tubo novo para impedir a migração da gota (Figura 2E).
         Nota: Se esterilidade não é necessária, use uma limpeza de fiapos (por exemplo, Kimwipe) ao pavio fluido de baixo da malha antes de virar.
      3. Enxágue a malha com M9 no novo tubo 50 mL do bordo novo (Figura 2F). Novamente, operar no centro da malha e a manter uma gota na parte de baixo da malha.
      4. Permitir que os vermes resolver ou spin-os suavemente para baixo (por exemplo, < x 16 g) por aproximadamente 1 min (Figura 2).
      5. Aspirar a solução-tampão da pelota de vermes, idealmente para > 0,5 mL, ou remover todo o líquido possível sem perturbar o sedimento.
      6. Pipetar os vermes usando um pipeta Pasteur em um prato NGM do vidro e deixe-os secar. Espaço múltiplas gotículas fora em um prato novo para secar mais rápido (Figura 2 H).
   4. Limpe o crivo.
      1. Enxágue a peneira delicadamente e completamente com água etanol e osmose reversa. Deixe-o secar.
      2. Armazená-lo em um recipiente limpo para uso futuro indefinido.
      3. Descartá-lo quando a malha desenvolve uma aparência de "sag".

2. validação de peneira Caenorhabditis , método de classificação

1. Manutenção geral
   1. Para todos os experimentos, cultura vermes num padrão de nematódeo crescimento Media¹⁷ (1L de NGM consiste de 2,5 g de peptona, 17 g de ágar-ágar, 3 g de NaCl, 975 mL de água bidestilada, 1 mL de colesterol de 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl₂ 0,5 mL de estreptomicina 100 mg/mL, 25 mL de 1m KHPO₄e 1 mL de 1 M de MgSO₄) a 25 ° C.
2. Administração de tratamento experimental
   1. Compare os três grupos: picareta, fluorodeoxyuridine (FUDR) e Caenorhabditis peneira.
      1. Para o grupo de tratamento FUDR, adicionar 100 mg/mL FUDR para a mídia NGM para uma concentração final de 100 μM para impedir qualquer produção de descendência e transferir os vermes todos os dias para um prato NGM fresco para evitar o esgotamento de comida.
      2. Para o grupo escolher, selecionar e transferir os vermes manualmente usando um loop de platina.
      3. Para o grupo de tratamento de peneira Caenorhabditis , siga a etapa 1.2 e pipetar os vermes em um prato NGM.
3. Caenorhabditis Percentagem do rendimento da peneira
   1. Para quantificar como a peneira é eficaz na classificação de c. elegans, crescer idade-síncrono N2 animais para 1 dia de idade adulta, a 25 ° C (ou seja, 48 h após a postura de ovos) e depois transferi-los por pegá-los para novas placas NGM (totalizando N = 50 ou N = 100 animais por tre grupo de atment).
   2. Após 24h de recuperação, transferir a população para novas placas NGM com o crivo de Caenorhabditis seguindo acima do protocolo (consulte a etapa 1.2) e contar o número de animais transferidos com êxito.
   3. Calcule a percentagem do rendimento como a relação entre o número de animais transferidos em comparação com o número inicial no início da transferência multiplicado por 100 (%).
4. Ensaios Healthspan
   Nota: Pontuação healthspan parâmetros de classe de motilidade, a taxa de bomba da faringe e tanto o anterior e a posterior toque suave resposta nos dias 2, 4, 6 e 8 da maioridade para idade-sincronizado N2 animais mantidas a 25 ° C.
   1. Motilidade de rastreamento
      1. Atribuir pontuações de motilidade, baseadas em um sistema baseado em classe (classes A, B e C) seguindo os métodos de Herndon et al . ¹⁸. comparar os efeitos dos três grupos experimentais usando um modelo de estatísticas logístico ordinal em software de análise estatística.
         Nota: Os indivíduos de classe A mover-se espontaneamente em um padrão normal, sinusoidal. Indivíduos de classe B mover-se em movimentos marcadamente não-sinusoidal e podem exigir cutucando para encorajar a circulação. Indivíduos de classe C mover sua cabeça e/ou cauda em resposta ao estímulo, mas são incapazes de se mover através de agar.
   2. Taxa de bomba da faringe
      1. Conte o movimento moedor do bulbo de faríngea terminal do animal visualmente sob um estereomicroscópio com uma 600 X ampliação final por 1 min.
      2. Realizar uma análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.
   3. Resposta de toque
      1. Gravar uma resposta de toque suave e comparar entre os três grupos. Realizar os ensaios com base em métodos descritos por Calixto et al . ¹⁹.
      2. Registro anterior e posterior toque resposta por suavemente acariciando um picador de cílios perpendicularmente através da cauda ou na cabeça (5x cada, alterna cabeça e cauda) dos animais.
      3. Marca qualquer movimento no sentido oposto do traço como 1 ponto em uma escala de 0 a 5 para o anterior e a posterior resposta.
      4. Realizar análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.
5. Ensaio de fecundidade
   1. Para determinar o uso do impacto da peneira Caenorhabditis na reprodução, crescer idade-síncrono N2 animais ao dia 2 de idade adulta, a 25 ° C.
   2. 60h depois põem ovos, transferir os animais para novas placas NGM com um picador de platina ou a peneira Caenorhabditis e dar-lhes a 4 h para recuperar (seque as placas peneiradas para 20-30 min).
   3. Após a recuperação, individualmente placa os animais através de um cílio escolher placas de NGM, dar-lhes 24 h para colocar ovos e remover os animais. Permitir que a descendência em cada placa para desenvolver em condições normais, a 25 ° C para outro 24h.
      Nota: Um picador de cílios é um cílio humano garantiu à extremidade de uma pipeta Pasteur com esmaltes e esterilizados com etanol.
   4. Conte o número de indivíduos de geração F1 viáveis. Realizar uma análise estatística utilizando um T-teste com α = 0,05.
      Nota: Prole viável é considerados os ovos que eclodem e iniciam o seu desenvolvimento através dos ciclos regulares larvas com êxito.
6. Ensaios de resposta de estresse repórter fluorescentes
   1. Realizar três ensaios de repórter fluorescentes comumente usado para detectar potenciais marcadores de estresse: uma translocação DAF-16::GFP para os núcleos das células em uma cepa [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]²⁰; uma expressão de hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹; e uma expressão de sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. Para cada ensaio, cultura idade-síncrono animais dos grupos de tratamento de três a 20 ° C e examiná-los no dia 3 de idade adulta: usar um controle negativo (em uma base diária, de transferência de um grupo de animais manualmente com um picador de platina), um controle positivo (em uma base diária transferência de um grupo de animais manualmente com uma picareta platinum plus um estressor estabelecido) e o crivo de Caenorhabditis (passar os animais através da peneira e permitir-lhes a recuperar por 30 min em NGM antes de imagem).
   3. No ensaio de DAF-16::GFP, calor choque os animais controle positivo a 37 ° C por 30 min antes de²⁰de imagem. Para o ensaio de hsp-16.2, calor choque os animais controle positivo para 90 min, 20 h antes de imagem²¹. Para o ensaio de sod-3, trate os animais de controle positivo com paraquat 100 mM por 4h antes de²²de imagem.
   4. Colher os vermes imediatamente com um picador de cílios e montá-los para uma lamela com 1 μL de solução 36% Poloxâmero 407 surfactante para imobilizar os vermes.
   5. Sanduíche dos vermes montados com outra lamela. Monte as duas lamelas de uma lâmina de vidro padrão de microscopia e imagem os vermes usando uma ampliação X 8 em um microscópio fluorescente invertido (para uma ampliação total de 80 X) e uma exposição constante com um filtro FITC.
   6. Para detectar quaisquer diferenças entre os três grupos no ensaio de DAF-16::GFP, categorizar os animais com base na localização do repórter DAF-16::GFP (nuclear, se o repórter translocados para núcleos, citosólico se o repórter localizado no citosol e o intermediário se o repórter localizado em ambos os núcleos e citoplasma).
   7. Compare os resultados usando um modelo estatístico de logística ordinal em software de análise estatística. Para o hsp-16.2 e os ensaios de expressão sod-3, use uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e testes post hoc de Tukey com α = 0,05 para comparar a fluorescência total da região da cabeça.

Resultados

A peneira de Caenorhabditis consiste de 2 tampas de rosca, protegendo uma área de malha de monofilamento de nylon tecido menor que o diâmetro do corpo da época do desenvolvimento desejado, usado para extrair ao vivo populações de organismos usando uma técnica simples lavagem. Ele atribui aos tubos cónicos padrão e usa a tela de engranzamento mecanicamente classificar animais pelo diâmetro do corpo, deixando os animais desejados no tubo pronto para mais manutenção e exp...

Discussão

Aqui, apresentamos o projeto e uso da peneira Caenorhabditis acessível, eficaz como uma ferramenta para classificação e mantendo o c. elegans. Esta ferramenta tem várias vantagens para escolher manualmente a animais individuais, lavando as populações, tratamentos químicos (por exemplo, FUDR) e métodos mais caros dos animais segregam. Primeiro, o Caenorhabditis peneira eficientemente e rapidamente (menos de 20 min) classifica a descendência de grandes populações mistas de ani...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100