A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e caracterizar a estrutura, potência olfativa e resposta comportamental de compostos putativos feromônio de lampreias do mar.

Resumo

Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem iterativa que usa os resultados de bioensaios fisiológicos e comportamentais para guiar o isolamento e a identificação de um composto ativo do pheromone. Esse método resultou na caracterização bem sucedida dos sinais químicos que funcionam como pheromones em uma grande variedade de espécies animais. Lampreias do mar dependem de olfato para detectar feromônios que medeiam respostas comportamentais ou fisiológicas. Nós usamos este conhecimento da biologia de peixes para postular funções de feromônios putativos e guiar o isolamento e a identificação dos componentes do feromônio ativo. Cromatografia é usada para extrair, concentrar e separar compostos da água condicionada. Electro-olfactogram (EOG) gravações são conduzidas para determinar quais frações eliciam respostas olfativas. Ensaios comportamentais labirinto 2-escolha são usados para determinar se qualquer uma das frações odoríferas também são comportamentalmente ativo e induzir uma preferência. Métodos de espectroscopia e espectrometria fornecem a informações estruturais para ajudar com a elucidação da estrutura e peso molecular. A bioatividade dos compostos puros é confirmada com EOG e ensaios comportamentais. As respostas comportamentais observadas no labirinto, em última análise devem ser validadas em um cenário de campo para confirmar sua função em um cenário de fluxo natural. Estes bioensaios desempenham um papel duplo para 1) orientar o processo de fracionamento e 2) confirmar e definir mais a bioatividade dos componentes isolados. Aqui, nós relatamos os resultados representativos de uma identificação de feromônio de lampreia do mar que exemplificam a utilidade da abordagem orientada por bioensaio de fracionamento. A identificação das feromonas de lampreia do mar é particularmente importante porque uma modulação do seu sistema de comunicação de feromônio está entre as opções consideradas para controlar a lampreia invasiva em grandes lagos Laurentian. Esse método pode ser facilmente adaptado para caracterizar a comunicação química em uma ampla gama de táxons e lançar luz sobre ecologia química transmitidas pela água.

Introdução

Os Pheromones são sinais químicos específicos lançados por indivíduos que ajudam-los em localizar fontes de alimentos, detecção de predadores e mediando as interações sociais de coespecíficos¹. Comunicação de feromônio de insetos tem sido bem estudados²; no entanto, a identificação química e função biológica de feromônios de vertebrados aquáticos não foram estudados como extensivamente. Conhecimento da identidade e função dos feromônios liberados podem ser aplicadas para facilitar a recuperação de espécies ameaçadas,^3,4 ou controle de pragas espécie^5,6. A aplicação destas técnicas exige o isolamento e caracterização dos componentes bioativos de feromônio.

Identificação de feromônio é um ramo da química de produtos naturais. Progresso na pesquisa de feromônio tem sido parcialmente limitado devido à natureza das moléculas do pheromone próprios. Feromônios são muitas vezes instáveis e lançado em pequenas quantidades, e apenas algumas técnicas de amostragem para detectar quantidades minuciosas de voláteis^7,8 ou compostos hidrossolúveis⁹existirem. Abordagens para identificar os pheromones incluem 1) uma seleção de alvo de compostos conhecidos, 2) metabolómica e fracionamento 3) guiada por bioensaio. Uma seleção de alvo de compostos conhecidos testes disponíveis comercialmente subprodutos metabólicos de processos fisiológicos, a hipótese de funcionar como feromônios. Esta abordagem é limitante porque os investigadores só podem testar compostos conhecidos e disponíveis. No entanto, resultou na identificação bem sucedida dos hormônios sexuais no goldfish que funcionam como pheromones^10,11,12. Metabolómica é uma segunda abordagem de identificação de feromônio que distingue os produtos metabólicos de potencial pequena molécula dentro de um sistema biológico¹³. Uma comparação dos perfis metabólicos de dois grupos (ou seja, um ativo contra um extrato inativo) permite a identificação de um perfil metabólico potencial de que o metabólito é purificado, a estrutura é elucidada e a Bioatividade é confirmada¹⁴. Efeitos aditivos ou sinérgicos de complexas formulações de misturas específicas são mais prováveis a serem detectadas com metabolomics porque metabólitos são considerados juntos, ao invés de como uma série de frações¹³. Ainda, a implementação da metabolómica baseia-se na disponibilidade de referências sintéticas porque os dados resultantes não facilitam a elucidação de estruturas novas.

Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem integrada, iterativa que se estende por dois campos: Biologia e química. Essa abordagem usa os resultados de bioensaios fisiológicos e comportamentais para guiar o isolamento e a identificação de um composto ativo do pheromone. Um extrato bruto é fracionado por uma propriedade química (i.e., tamanho molecular, polaridade, etc.) e testado com gravações de electro-olfactogram (EOG) e/ou em um bioensaio. Os componentes bioativos são selecionados para fora, repita essas etapas de fracionamento e EOGs e/ou bioensaios. As estruturas de compostos ativos puros são elucidadas por métodos espectroscópicos e espectrometria, que fornecem o peso molecular e informações estruturais para produzir um modelo do composto para ser sintetizado. Fracionamento de bioensaio guiada pode produzir diversos metabólitos e potencialmente romance feromônios com esqueletos químicos únicos que não são susceptíveis de ser prevista a partir as vias biossintéticas.

Aqui, descrevemos o protocolo de fracionamento de bioensaio guiada usado para isolar e caracterizar a bioatividade dos compostos de feromônio sexual masculino lampreia do mar. A lampreia (Petromyzon marinus) é um modelo ideal de vertebrados para estudar comunicação feromônio porque estes peixes dependem fortemente de detecção olfativa de sugestões químicas para mediar sua história de vida anádroma composta por três fases distintas: larvas, juvenis e adultos. Larvas de lampreia escavam os sedimentos dos córregos de água doce, sofrem uma drástica metamorfose e transformam em juvenis que migram para um lago ou oceano, onde eles parasitar peixe grande anfitrião. Após desanexação do peixe hospedeiro, os adultos migram volta em fluxos de desova, guiado pelos feromônios migratórios lançados por larvas de fluxo-residente^{15,16,17,18,19} . Machos maduros ascender para a desova, liberar um feromônio de multi-componentes sexo atrair companheiros, spawn intermitentemente para aproximadamente uma semana, e depois morrer de^15,20. A identificação de feromônios lampreia é importante porque uma modulação do sistema de comunicação de feromônio é entre as opções consideradas para controlar as lampreias do mar invasivas no Laurentian grandes lagos²¹.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 e 02/17-031-00).

1. coleta e extração de lampreia condicionado água

1. Lugar sexualmente maduras masculinas lampreias do mar (15-30 animais) em um tanque fornecido com 250 L de água de Lago Huron aerada 16-18 ° c, mantida
2. Colete a água macho-condicionado ao longo de cada noite de junho a julho.
   Nota: lampreias do mar morrer naturalmente após a desova. Se um peixe está chegando neste momento da sua vida, substituí-lo com um macho maduro fresco.
3. Extrai a água condicionada pela extração de fase sólida.
   1. Mergulhe a resina em metanol por 4h antes de carregá-lo em uma coluna. Carregar a resina na coluna e, em seguida, bomba de 10 L de água através da coluna para eliminar o solvente orgânico.
   2. Passe a condicionado água do tanque segurando o peixe através do sistema de bombeamento para o topo da coluna. A água passa por uma cama de 2 kg de resina de troca iônica poliméricos moderadamente polares (ex.., resina Amberlite XAD-7 HP), contida em uma série de quatro colunas de vidro 2,5 L-capacidade. Manter altas velocidades de carga entre 400 e 600 mL/6 min. eluir os metabolitos com 10 L de metanol seguido imediatamente de 5 L de acetona.
      Atenção: Esta etapa utiliza metanol e acetona. Ambos são inflamáveis e venenosos.
      Nota: O residual em pool pode ser armazenado a-80 ° C até mais processada.
4. Reative a coluna após 1 semana de enriquecimento, lavando-o com água (aproximadamente 10 L).
5. Remover o solvente orgânico (a mistura de metanol e água) e o extrato da colheita por evaporação rotatória por 5h sob pressão reduzida (abaixo dos 300 mbar) a 40 ° C. Concentre-se o resíduo de água por liofilização secador de congelamento por 48 h a-20 ° C até secar.

2. isolamento de piscinas de fração com cromatografia

1. Mergulhe o gel de silicone (230-400 mesh) na fase inicial de móvel de 30 min. transferência do gel com o solvente (suspensão) para uma coluna de vidro. Abra a válvula da coluna para permitir que a fase móvel passar. Permitir que o gel de silicone precipitar e formar uma cama de sílica gel.
2. Homogeneizar os extratos com gel de silicone (70-230 mesh) e carregá-los na coluna de cromatografia líquida sobre a cama de sílica gel. Elui-los com um gradiente de 95% CHCl₃ (clorofórmio) / MeOH (metanol) para 100% MeOH, 2,5 L de volume total. Recolha o eluente em frascos individuais (cada 10 ml).
   Atenção: O clorofórmio utilizado nesta etapa é um reagente venenoso.
3. Guia o agrupamento dos eluentes em 20 frações por análise de cromatografia (TLC) uma camada fina.
   1. Realizar o experimento de TLC em placas de gel de sílica pré-revestida aplicando a amostra na linha de partida e imergindo a linha de partida da placa em solventes em desenvolvimento (escolher a polaridade pelo quociente de CHCl₃ metanol de 0-100%) em um vidro fechado tanque.
   2. Selecione a relação de eluente tornar todas as manchas TLC com um fator de retenção (R_f) variando de 0.3 - 0.8.
   3. Depois que o solvente em desenvolvimento atinge a linha de fundo, tirar a placa do tanque e esperar 10 min para o solvente evapore.
   4. Visualizar os pontos primeiro sob luz em 254 nm e então mancha UV por pulverizá-los com uma solução ácida de metanol de Anisaldeído 5% (20 μL) por um pulverizador de cromatografia e aquecimento a 85 ° C por 3 min.
      Nota: Os pontos coloridos na placa de TLC indicam o principal componente na fração.
   5. Combine o eluente para 20 fracções baseada a cor spot e a similaridade de_f R do componente principal.
4. Concentre-se a fração de um resíduo por evaporação rotatória sob pressão reduzida (300 mbar de acordo com a propriedade de solventes) a 40 ° C por aproximadamente 30 min.

3. Electro-olfactogram (EOG) gravações para identificar frações/compostos odoríferos

1. Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro exterior: 1,5 mm; diâmetro interno: 0,86 mm; comprimento: 100 mm) com uma micropipeta extrator com o nível do aquecedor definido para 65.
2. Marcar e corte a abertura na ponta do capilar com um cortador de vidro com ponta de diamante e preenchê-lo com ágar fundido de 0,4% em soro fisiológico a 0,9%. A abertura na ponta do capilar deve ser em torno de 10 µm de diâmetro.
3. Preencher os eléctrodos capilares puxados de passos 3.1-3.2 e titulares de eletrodos estado sólido pré-fabricados com pelotas de Ag/AgCl (ver Tabela de materiais) com 3 M de KCl utilizando uma micropipeta.
   Nota: Desalojar quaisquer bolhas de ar no capilar ou o porta-eletrodo.
4. Inserir os eletrodos puxados nos porta eletrodo.
5. Preparar 100 mL de 10^-5 M L-arginina em água filtrada por carvão de uma solução de reserva 10^-2 M L-arginina em água desionizada (armazenada a 4 ° C) num balão volumétrico. 20 ml da 10^-5 M para um frasco de vidro de L-arginina.
6. Para a curva concentração-resposta, prepare-se 10 mL de diluições de 10 vezes das piscinas fração da etapa 2.3 em frascos de vidro. Preparar diluições frescas diariamente antes das experiências e usá-los dentro de um dia. Colocar os frascos de vidro das soluções de trabalho de L-arginina e diluições de piscina a fração em um banho de água de recirculação para permitir que a temperatura equilibrar a 8 ° C.
7. Anestesiar a lampreia com éster de ácido etil 3-aminobenzoico (MS222; 100 mg/L) e imobilizá-lo com uma injeção intramuscular de gallamine triethiodide (3 mg/kg de peso corporal, em soro fisiológico a 0,9%) com uma seringa estéril.
   Nota: Uma profundidade suficiente de anestesia é determinada pela observação de nenhum movimento de gill, incapacidade de manter uma postura ereta e sem sucção para os lados do tanque usando seu disco oral. Para minimizar qualquer contaminação microbiana antes e durante a cirurgia, usar luvas estéreis e mergulhe os instrumentos de dissecação em etanol a 70% (v: v) em água desionizada pelo menos 10 minutos antes da utilização.
8. Orientar a lampreia anestesiada em uma barraca em forma de V e envolva-o com uma toalha de papel molhada para evitar a dessecação.
   Nota: Não obstrua as aberturas de gill.
9. Inserir um tubo de recirculação de água gaseificada contendo 50 mg/L de MS222 na cavidade bucal, ajustar a taxa de fluxo e certifique-se de que água está saindo através das aberturas de gill para irrigar continuamente as brânquias.
10. Usar um bisturi estéril e fórceps [sob o microscópio estereoscópico em uma ampliação X 1.25 (ver Tabela de materiais)] para remover uma seção² de 5 mm da pele na superfície da cápsula olfativa para expor o epitélio olfatório.
11. Lave o tubo de entrega odorante com água filtrada e conectá-lo à válvula montada sobre um micromanipulador. Coloque o tubo capilar de entrega odorante na cavidade do epitélio olfatório usando o micromanipulador para entregar a água filtrada para o epitélio olfatório para evitar a dessecação quando se administra não odorantes.
12. Monte os eletrodos de referência e gravação nos Micromanipuladores. Baixe o eléctrodo de referência sobre a pele externa perto do naris. Usando o microscópio estereoscópico (1,25 X), menor o eletrodo gravação mal tocar a superfície do epitélio olfatório.
13. Transferi a absorção do tubo odorant entrega da água filtrada de plano de fundo para a solução de L-arginina 10^-5 M.
14. Ligue o computador, amplificador (definido como modo de DC), filtro e digitador. Usando o software de driver de válvula, programar o procedimento para administrar o pulso único 4 de s de odorante, marcando a caixa de T1, configuração T para 4 s e marcando a caixa de T2.
15. Do software de aquisição de dados (ver Tabela de materiais), defina o modo de aquisição de um osciloscópio de alta velocidade, clique no ícone do jogo e clique em Iniciar no driver de válvula para acionar o pulso de odorante.
    Nota: O software de aquisição de dados registra a amplitude de resposta diferencial EOG por 20 s (3 s antes, 4 s durante o pulso odorant e 13 s depois). Use o micromanipulador para manobrar as posições do eléctrodo de gravação, eletrodo de referência ou um tubo de entrega odorante para aumentar a relação sinal-ruído, com um máximo de resposta para o padrão de L-arginina e uma resposta mínima para o controle em branco ( água filtrada). O amplificador comutando o interruptor do amplificador AC-DC para o GND ao mover os eletrodos de terra.
16. Começa a gravar o controle em branco, L-arginina e então a odorantes preparado na etapa 3.6 de baixas para altas concentrações com um flush de 2 min de água filtrada entre aplicativos.
17. Após a gravação de respostas para todos os odores a ser testado, o amplificador à terra e retraia cuidadosamente os eletrodos e o odorant tubo capilar de entrega. Seguindo os métodos aprovados institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC), com o término do experimento EOG, eutanásia a lampreia anestesiada com uma overdose de MS222 (1 g/L).
    Nota: Verifique se a eutanásia sucesso observando a falta de movimento de gill e batimento cardíaco pelo menos 5 min, seguido por medular do cérebro.
18. Analisar e plotar os dados usando o software de análise. Determine o limiar de detecção de odores²² identificar frações odoríferas que eliciam respostas maiores do que o controle de água em branco. As piscinas de fração que eliciam respostas olfativas de concentração-dependente que são diferentes do que o controle de água em branco em seguida são testadas em um ensaio comportamental (passo 4).

4. dois-escolha comportamental bioensaio para identificar frações/compostos comportamentalmente activos de labirinto

1. Aclimatar a lampreia feminina sexualmente madura na gaiola lançamento no labirinto (ver Figura complementar 1) 5 min. manter a taxa de fluxo de água do rio no labirinto
   Nota: O labirinto é construído a partir de madeira envernizada marinho da classe e medidas 6,5 m de comprimento e 1,2 m de largura com um divisor de 2,7 m de comprimento para separar o labirinto em dois canais no montante final de medição. Água é temporariamente desviada para o labirinto. A profundidade da água deve ser mantida a 0,19 m e a velocidade deve ser mantida a 0,07 m/s ± 0,01.
2. Liberar a lampreia do mar e gravar a quantidade cumulativa de tempo que a lampreia gasta no experimental e canal de controle de cada rio contendo água durante 10 minutos.
   Nota: Se a lampreia do mar não entrar o experimental e controlar o canal para pelo menos 10 s durante este período de 10 min, acabar com o julgamento, como esta é uma indicação de inatividade ou lado forte viés.
3. Aplicar o teste de estímulo (ou seja, um feromônio putativo em 10^-12 M dissolvido em metanol/água deionizada de 50% de água) para o canal experimental aleatoriamente atribuído e o veículo (50% metanol/desionizada) para o canal de controle usando peristáltico bombas em taxas constantes de 200 mL/min para 5 min.
   Nota: A concentração limite de deteção do estímulo teste conforme determinado com as gravações de electro-olfactogram deve ser usada como a concentração inicial, para o teste comportamental.
4. Aplicar o teste de estímulo e o veículo para um adicional 10 min e gravar a quantidade cumulativa de tempo a lampreia gasta o experimental e o canal de controle.
5. Irrigue o labirinto com água durante 10 minutos antes do início do julgamento na próxima. Repita as etapas 4.1-4.4 pelo menos 7 lampreias se suficiente estímulo de teste está disponível.
6. Calcular um índice de preferência²² para cada julgamento e avaliar o significado usando um teste de Wilcoxon rank-assinado.
   Nota: O índice resulta em um número único que pode ser positivo ou negativo. Um valor positivo do índice de preferência indica atração, enquanto um valor negativo do índice de repulsão de indicações de preferência. Se o índice de preferência é significativamente diferente de zero, a fração é considerada ativa.
   
   Aqui,
   B_c = o tempo gasto por lampreia no canal de controle, antes da aplicação de odorante, teste
   B_e = o tempo gasto no canal experimental antes da aplicação de odorante,
   _C = o tempo gasto no canal de controle após a aplicação de odorante, e
   Um_e = o tempo gasto no canal experimental após a aplicação de odorante.

5. cromatografia em fase gasosa isolamento de compostos puros de frações ativas

1. Repita os passos 2.1-2.4 com as piscinas de fração que induzem respostas olfativas (etapa 3) e eliciar respostas comportamentais (passo 4).
2. Purifica ainda mais as frações ativas em compostos com tamanho-exclusão cromatografia usando uma coluna de Sephadex LH-20.
   1. Preparar a amostra em 0,5 mL na fase inicial do móvel [CHCl₃- MeOH (1:1) ou MeOH 100%], carregar na coluna correspondente uma CHCl₃- MeOH (1:1) coluna e, em seguida, uma coluna de MeOH (100%) e Elui-los para produzir os compostos.

6. estrutura elucidação de um composto puro com espectrometria de massa (MS) e ressonância magnética Nuclear (NMR)

1. Dissolver e diluir o composto purificado na primeira fase móvel (normalmente, o metanol para água, 1:1, v: v) de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para formar uma solução μL 10 de aproximadamente 1 μg/mL.
   1. Transferir a solução de amostra para frascos HPLC e configurá-los para o mostruário de HPLC. Injetar a espectrometria de massa de ionização de electrospray (ESIMS) da amostra (10 μL) e gravar os espectros de espectrometria de massa (HRESIMS) de ionização electrospray de alta resolução usando um espectrômetro de massa de cromatografia²³.
2. Prever a fórmula molecular de acordo com o banco de dados no software do espectrômetro de massa (veja Tabela de materiais)²⁴.
   1. Abra o cromatograma da amostra injetada e obter seu espectro de massa selecionando o pico cromatográfico.
   2. Entrada a massa medida valor de íon (m/z) (4 casas decimais) na composição elementar sob o módulo da ferramenta . Defina o parâmetro de tolerância PPM < 5.
   3. Ajuste os parâmetros do símbolo para caber o elemento de composição da molécula medido. O software produz uma previsão de fórmula molecular com base na análise da massa única.
3. Selecione os solventes deuterados (600 μL, CH₃OH -d₄ ou DMSO -d₆) de acordo com o protocolo²⁵ para dissolver as amostras.
   1. Dissolva completamente a amostra em solventes deuterados selecionados para formar uma solução com uma concentração variando entre aproximadamente 0,1 a 10 mg/mL. Transferir a solução de amostra para um tubo NMR para gravar o 1D (¹H, ¹³. C) e 2D-NMR [¹H -¹H espectroscopia de correlação (acolhedor), heteronuclear única coerência quântica (HSQC), heteronuclear correlação múltiplo de ligação (HMBC)] espectros em um espectrômetro de 900MHz NMR²⁶.
4. Coloca o tubo NMR com a amostra dentro da turbina do girador. Use o medidor de profundidade para garantir que a altura da amostra é no meio da janela de medição. Abra o software NMR (ver Tabela de materiais) e clique no botão do elevador para alterar a amostra no imã.
   Nota: Mantenha uma mão por cima do íman para sentir o gás vindo de cima do ímã. Ao mesmo tempo, um som sibilante deve ser audível.
5. Delicadamente, coloque a amostra sobre o coxim de ar em cima do ímã e apertar o botão de levantar novamente a descer a amostra para o ímã de NMR.
   Nota: Ouvi um barulho de "clique" indicar que a amostra está na posição certa.
6. Criar um novo dataset e carregar os parâmetros padrão recomendados pelo instrumento NMR (ver Tabela de materiais).
   1. Tipo de "bloqueio" para invocar o procedimento de bloqueio automático e selecionar o solvente na página de alerta.
   2. Para ajuste fino, no painel de Manipulate, ajustar o botão no modelo de desbloqueio , ajustar o cursor no painel de manipular e bloquear o ímã novamente.
   3. Na prompt de Atma página, ajuste o parâmetro no painel manipular para o procedimento de ajuste, que pode levar alguns minutos. Espere até que a afinação está concluída para prosseguir.
   4. Inicie a rotina automática rasamento digitando "topshim" no prompt de. Aguarde até que os shims é concluído para prosseguir.
   5. Tipo "rga" para definir automático recebendo ajustes de ganho e, em seguida, tipo "d1" para definir o intervalo entre pulsos e, em seguida, tipo "zg" para iniciar a aquisição e esperar até que seja concluída a aquisição.
   6. Tipo "ef" ou "pqe" para processar os dados e digite "apk" para eliminação automática. Processe os dados sobre o software de processamento de NMR.
7. Elucidar a estrutura química por uma interpretação da análise dos dados NMR.
8. Conte os sinais de carbono no espectro RMN C ¹³. Selecione a fórmula molecular correspondente do resultado previsto em espectrometria de massa de alta resolução (HR-MS).
9. Integrar os sinais de próton no espectro ¹H NMR e atribuir a conectividade da e próton-carbono os sinais no espectro HSQC.
10. Atribua a conectividade do esqueleto de carbono baseado no espectro HMBC e correlações no ¹H -¹H COSY.
11. Tentativamente atribua a estrutura química baseada na estrutura lógica²⁷. A estrutura provisória da pesquisa nos bancos de dados de estrutura química. Compare a estrutura provisória com os análogos em referências.
12. Atribua a configuração relativa com o espectro Nuclear Overhauser efeito espectroscopia (NOESY).
    Nota: Uma vez que as propriedades da identidade dos enantiômeros exibidos na espectrometria e métodos espectroscópicos são idênticas, a configuração absoluta de alguns compostos, especialmente aqueles com álcool 2' e 2'-NH₂, tem de ser determinada com um reação de derivatização. Após a reação de derivatização, as diferenças indicadas em espectros de facilitam a atribuição inequívoca das configurações absolutas da maioria dos compostos²⁸.

7. EOG e bioensaio para confirmar compostos puros são odoríferos e comportamentalmente ativo

1. Repita as etapas 3.1-3.5.
2. Para a curva concentração-resposta, prepare-se 10 mL de 10 vezes as diluições dos compostos puros de 10^-6 M - 10^-13 M de uma solução stock de feromônio de 10^-3 M em 50% de metanol/água armazenado a-20 ° C, com base no peso molecular determinado em Passo 6.2. Colocar os frascos de vidro com as soluções de trabalho de L-arginina e os compostos puros em um banho de água de recirculação para permitir que a temperatura equilibrar a 8 ° C.
3. Repita as etapas de 3.7-3.18.
4. Repita as etapas 4.1-4.2.
5. Aplica o composto puro na concentração limite EOG deteção para o canal experimental aleatoriamente atribuído e o veículo (50% metanol/desionizada), para o canal de controle usando uma bomba peristáltica em taxas constantes de 200 mL/min para 5 min.
6. Repita as etapas de 4.4-4.6.

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Resultados

Um diagrama Resumindo as etapas descritas no protocolo do fracionamento de bioensaio guiadas é mostrado na Figura 1. O protocolo envolve etapas para isolar e caracterizar a estrutura, a potência olfativa e a atividade comportamental de 5 putativo lampreia feromônios (Figura 2). Utilizando a espectrometria de massa e dados NMR (Figura 3 e Figura 4), as estruturas do pe...

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Discussão

Peixes vivos num mundo químico cheio de compostos ainda não identificados. Fracionamento de bioensaio guiadas provou essencial para identificar e caracterizar moléculas bioativas que medeiam muitas interações químicas, tais como aqueles observados em masu salmão³¹elefantes asiáticos³²e lampreias do mar^{33, 34,35}. Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem eficaz par...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament	Warner Instruments	G150F-4	recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrument	Narishige	PC-10	pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutter	Generic		cut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150-4	odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm	Warner Instruments	ESP-M15N	recording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mm	Warner Instruments	E45P-F15NH	reference electrode holder
1 mm pin	Warner Instruments	WC1-10	to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pin	Warner Instruments	WC2-5	to bridge reference and recording electrode holders
Agar	Sigma	A1296	molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9333	3M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfil	World Precision Instruments	MF28G-5	to fill electrodes and electrode holders
L-Arginine	Sigma	A5006	positive control odorant for EOG
Methanol	Sigma	34860
Water bath	Custom made	N/A	holds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)	Syndel USA	Tricaine1G	EOG anesthetic
Gallamine triethiodide	Sigma	G8134-5G	EOG paralytic
1 mL syringe	BD Biosciences	301025	to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8	BD Biosciences	305115	to administer paralytic
Roller clamp	World Precision Instruments	14043-20	adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl)	J.T. Baker	3624-05	for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stage	Custom made	N/A	holds lamprey during EOG
Plastic trough	Custom made	N/A	holds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades - #11	Fine Science Tools	10011-00	for EOG dissection
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12	for EOG dissection
Straight ultra fine forceps	Fine Science Tools	11252-00	for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forceps	Fine Science Tools	11370-42	for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	for EOG dissection
Stereomicroscope	Zeiss	Discovery V8	for EOG dissection
Illuminator light	Zeiss	CL 1500 ECO	for EOG dissection
Plastic tubing	Generic		to connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubing	Custom made	N/A
In line filter and gasket set	Lee Company	TCFA1201035A
Micromanipulators	Narishige	MM-3	to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devices	Kanetec	MB-K
Valve driver	Arduino	custom made	to control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valve	Lee Company	LFAA1201618H	valve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifier	Digitimer Ltd.	NL106	to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage	Digitimer Ltd.	NL102G	to increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filter	Digitimer Ltd.	NL125
Digitizer	Molecular Devices LLC	Axon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software	Molecular Devices LLC	AxoScope version 10.4
Faraday cage	Custom made	N/A	Electromagnetic noise shielding
Two-choice maze	Custom made	N/A	waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pump	Honda	WT30XK4A	fills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubing	Cole Parmer	Masterflex 07557-00	to adminster odorants in maze
Inverter Generator	Honda	EU1000i	powers perstaltic pump
Release cage	Custom made	N/A	used to acclimate lamprey in the maze
Mesh	Generic		used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon)	Generic		to mix odorants
Flow meter	Marsh-McBirney	Flo-Mate 2000	to measure discharge
XAD 7 HP resin	Dow chemical	37380-43-1	for extraction of conditioned water
Methanol	Sigma	34860	for extraction of conditioned water
Water bath	Yamato	BM 200	for extraction of conditioned water
Freeze dryer	Labconco	CentriVap Concentrator	for extraction of conditioned water
chloroform	Sigma	CX1050	for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 mesh	Sigma	112926-00-8	for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 mesh	Sigma	112926-00-8	for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC plates	Sigma	99571	for isolation of fraction pools
anisaldehyde	Sigma	A88107	for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20	GE Healthcare	17-0090-01	for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resin	Sigma	XAD7HP	for extraction of conditioned water
4, 2.5L capacity glass columns	Ace Glass Inc.	5820	for extraction of conditioned water
Acetone	Sigma	650501	for extraction of conditioned water
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent)	Waters Co.	N/A	for structure elucidation
Binary HPLC pump	Waters Co.	1525	for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent)	Agilent	N/A	for structure elucidation
Rotovap drying system	Buchi	RII	for extraction of conditioned water
UV lamp (254 nm)	Spectronics Co.	ENF-240C	for thin layer chromatography