Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Resumo

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Resumo

Este ensaio destina-se especificamente informar sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente (GFP) detectável pela microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Um vírus de repórter de HIV-1 (HIV-1 Gag-iCre) é gerado inserindo o genoma do HIV-1 entre a matriz e as proteínas do capsídeo da poliproteína mordaça Cre recombinase. Isso resulta em uma embalagem de Cre recombinase em partículas de vírus, que em seguida é lançado em uma célula alvo linha estàvel, expressando uma Cre recombinase ativado vermelha proteína fluorescente (RFP) para gaveta de interruptor GFP. No estado basal, esta fita expressa RFP apenas. Após a entrega da Cre recombinase para a célula de destino, a RFP, ladeado por sites loxP, excises, resultando na expressão de GFP. Este ensaio pode ser usado para testar qualquer inibidores da entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula para célula e tem sido usado para identificar uma classe de antagonistas dos receptores purinérgicos como romance inibidores de fusão de membrana viral do HIV-1.

Introdução

A necessidade de terapias anti-retrovirais romance tem solicitado o desenvolvimento de telas de alta produtividade para inibidores de entrada HIV-1. O ensaio da repórter Gag-iCre é desenvolvido para identificar inibidores de entrada viral na etapa de fusão em um sistema de infecção de célula para célula medindo especificamente a fusão da membrana viral com a membrana celular de anfitrião¹. Um ensaio foi desenvolvido para triagem de novos inibidores que agiu especificamente nas fases iniciais da infecção do HIV-1 até o ponto de fusão da membrana viral. Um desafio para a infecção de célula-célula de medição é que o inóculo inicial contém células de doadores infectados e nas células-alvo ininfected, por medição nova infecção é difícil discriminar a partir das células de entrada. O sistema ideal envolveria um gene heterólogo marcador que pode ser induzido pelo início de uma infecção de célula de destino e não estiver presente na célula doadora. Um conteúdo viral popular mistura ensaio baseado em uma fusão de proteína-enzima viral, BlaM-Vpr, pode ser eficaz, mas tem limitações para a alta taxa de transferência, a célula-célula de triagem². Este teste envolve um gene repórter de beta-lactamase (BlaM) que é fundido ao HIV-1 Vpr, empacotado em virions e entregue nas células de destino após a fusão da membrana viral. O substrato CCF2-AM é carregado no citoplasma das células-alvo e sofre uma mudança de fluorescência após clivagem. O substrato CCF2-AM é caro e pode ser proibitivo para telas de alta produtividade. Para distinguir células do doador e de destino, é necessário a tintura-etiqueta as populações-alvo. Finalmente, o protocolo exige várias etapas de lavagem e incubação, que podem ser pesada e onerosa ao testar um grande número de compostos.

O ensaio de Gag-iCre foi desenvolvido como uma solução para estes problemas, para desenvolver um elevado-throughput screening para inibidores de fusão em transmissão de célula para célula. Este sistema não requer substrato para ser carregado em células. O ensaio também pode ser usado para estudos de célula-free e é adaptável a outros estudos de fusão viral usando partículas de vírus HIV-1 Gag-iCre pseudo digitadas. Ensaios de fusão do HIV Env mediada celular podem medir fusão de celular mediada por proteínas do vírus Env, no entanto, estas não usar partículas de vírus real, como o teste de HIV-1 Gag-iCre faz^3,4,5. Este ensaio pode ser lido com microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Foi utilizado com sucesso para a tela da biblioteca do FDA, bem como uma pequena biblioteca de purinérgicos inibidores^1,6. Outros pesquisadores também identificaram purinérgicos inibidores de fusão do HIV-1 usando um ensaio de fusão de alta produtividade adaptado e otimizado que relata a transferência de beta-lactamase encapsulado vírus para o citoplasma^7,8 .

O vírus de Gag-iCre foi projetado com uma abordagem semelhante ao vírus da mordaça-iGFP, inserindo Cre recombinase entre matriz e capsídeo, ladeado por HIV-1 protease sites⁹. A enzima de Cre é feita como um precursor inserido dentro a poliproteína de mordaça que amadurece quando a protease do HIV-1 é ativado dentro da partícula do vírus nascente. A entrega de Cre depende, assim, a entrega do conteúdo de uma partícula de HIV-1 protease-ativado em um alvo celular através de um processo de fusão da membrana viral. Duas versões do protocolo são fornecidas aqui. O primeiro usa uma população de HIV-1 infectado para infectar células-alvo, para estudar a transmissão directa de célula para célula do HIV. A segunda versão utiliza um vírus sem célula para estudar uma infecção sem célula viral. O ensaio de transmissão de celular para celular leva 7 dias para concluir a partir do dia em que as células são descongeladas, ou 5 dias, se as células são já descongeladas e passadas. O ensaio de infecção sem célula pode ser executado em 5 dias, se as células precisam ser descongelados e 3 dias, se as células são descongeladas e passadas. Também são dadas instruções para gerar uma linha de células alvo (vermelho-verde) RG no tipo celular desejado (se uma linhagem de células de destino preexistente do RG não estiver sendo usada) utilizando um plasmídeo criado pelo laboratório Clevers¹⁰. É recomendável que sejam tomadas precauções de biossegurança adequadas com o vírus e as células do vírus-expressando neste ensaio. Realizamos a parte infecciosa deste ensaio em uma instalação de cultura de tecidos BSL2 +. Depois que as células são fixos, eles podem ser analisados nas instalações de microscopia e citometria de fluxo padrão.

Aqui descrevemos a aplicação deste teste a tela para romance compostos que inibem a fusão da membrana viral de HIV-1 (Figura 1). Receptores purinérgicos são mediadores pró-inflamatórios. Nosso laboratório tem demonstrado que os inibidores não-seletivo dos receptores purinérgicos agem como inibidores de fusão de membrana viral HIV-1⁶. Informamos que a utilização deste teste em alta taxa de transferência pode identificar novos inibidores de fusão de membrana viral de HIV-1. Podemos demonstrar que um inibidor da classe dos receptores purinérgicos representa uma nova classe de inibidores de fusão da membrana viral HIV-1.

Protocolo

1. geração de linhas de células alvo

Nota: Este passo é opcional; se usando uma linha de célula de destino existente do RG, comece pela etapa 2.

1. Cotransfect um prato de 10cm confluente de 70% de 293T células¹¹ [em 10 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS)] com pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ e pCL-10A1¹² (plasmídeo de embalagem) em um proporção de 1:1 (20 µ g total) usando a transfeccao à base de cálcio¹³.
2. Recolher 10 mL do pós-transfection viral 48h sobrenadante por pipetagem os meios de comunicação da placa em um tubo cônico de 15 mL e a centrifugação do tubo a 3.000 x g por 5 min a 23 ° C, para quaisquer detritos de célula de Pelotas.
3. Anexe um filtro de 0,45 µm para uma seringa de 10 mL. Após a centrifugação, tirar todo o sobrenadante e carregar a seringa. Execute a amostra através de um tubo limpo 15 mL.
4. Alíquota do sobrenadante viral filtrada em tamanhos adequados (geralmente, 0,5 – 1 alíquotas mL). Estes podem ser usados imediatamente na próxima etapa ou pode ser congelados a-80 ° C e armazenados.
5. Use 50 a 100 µ l do sobrenadante viral para infectar uma linha celular de escolha em uma placa de 96 poços. Cultura das células a 37 ° C com 5% de CO₂. O sinal RFP deve aparecer em tão logo 24 h sob um microscópio de fluorescência (ampliação de 40 X, 532 nm de excitação, 588 emissão nm), mas pode demorar até 72 h.
   Nota: Nestas experiências, células Jurkat foram usadas, mas outros tipos podem ser usados também.
6. Selecione células transduzidas com puromicina instituindo uma série de 10 poços e puromicina adicionando a cada um, deixando pelo menos 1 bem tratada como um controle (uso uma gama de concentrações de 0,5 µ g/mL a 5 µ g/mL; isso pode variar por tipo de célula). Monitor da viabilidade celular (lysis da pilha irão ocorrer nas células sem resistência puromicina) ao longo de vários dias em comparação com o controle não tratado e uso uma concentração de puromicina onde células de RFP-expressando apenas sobrevivem.
   Nota: Selecione a concentração onde células untransfected são mortas enquanto células transfectadas sobrevivem.
7. Usando a classificação de citometria de fluxo de célula única ou uma diluição limitante (ver etapas 1.8 – 1.10), crescem as culturas derivadas de células únicas¹ para desenvolver uma linha de celular clonal (isto pode levar várias semanas para crescer).
8. Se usar o método de diluição, contar as células usando um hemocytometer e diluir a amostra com cerca de 500 células/mL.
9. Em uma placa de 96 poços, pipete 50 µ l da diluição celular em 50 µ l de mídia [meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% FBS e 2% penicilina-estreptomicina, se usando células Jurkat] e realizar diluições em série 1:1 para 11 poços contendo 50 µ l de mídia. Para os melhores resultados, execute pelo menos 10 repetições.
10. Monitore o crescimento de células através de microscopia (40 X) da placa em uma incubadora de cultura de tecidos (37 ° C com 5% CO₂) ou aproximadamente 4 semanas. Escolha a menor concentração de puromicina com crescimento (como visto através do microscópio, 40 X) para as culturas clonais, culturas.
11. Congele as alíquotas por centrifugação 20 mL da cultura (500.000 células/mL, contou com um hemocytometer) a 800 x g por 5 min a 23 ° C e resuspending-lo em 500 µ l de FBS com 10% de DMSO. Coloque-a-80 ° C utilizando um recipiente de célula-congelamento e depois armazená-lo em nitrogênio líquido.

2. transmissão do vírus celular para celular

1. Preparação de células alvo
   1. Descongelar um 500 µ l frasco de células de repórter Jurkat RG, colocando-o em banho maria a 37 ° C. Pipetar as células do frasco 10 mL de meio completo RPMI e centrifugar a mistura a 800 x g por 5 min a 23 ° C. Resuspenda o pellet em 20 mL de meio completo RPMI num balão de T-75. Incube o frasco durante a noite (37 ° C e 5% CO₂).
      Nota: O meio RPMI completo contém RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL.
   2. No dia seguinte, adicione 0,5 µ g/mL de puromicina (1 µ l de um estoque de 2 mg/mL por 8 mL de mídia). Cultura das células, mantendo uma densidade de 200.000-800.000 células/mL (contados através de hemocytometer).
   3. O dia antes de configurar o ensaio de transferência, dividi as células até 200.000-400.000 células/mL em meio RPMI fresco contendo 0,5 µ g/mL de puromicina.
2. Preparação de células de doador
   1. Descongele o untransduced células Jurkat e cultura-los num balão de T-75 com 20 mL de RPMI completar médio (como descrito no passo 2.1), mantendo uma densidade de 200.000-800.000 células/mL.
   2. Centrifugue 7.500.000 células (800 x g por 5 min) e Resuspenda-los em 120 µ l de solução de nucleofection V com suplemento (ver Tabela de materiais). Transferir as células para uma cubeta de eletroporação e adicionar 4,5 µ g de Gag-iCre¹ DNA. Transfect as células (através de uma abordagem baseada em electroporation, consulte a Tabela de materiais) usando um programa apropriado (por exemplo, S-18) e em seguida, transferi-los imediatamente para 3 mL de meio RPMI (com 10% FBS).
   3. Permitir que as células para recuperar incubando-os durante a noite a 37 ° C com 5% de CO₂.
   4. Na manhã seguinte, Centrifugar as células a 800 x g por 5 min a 23 ° C e Resuspenda-los em 3 mL de meio completo RPMI, permitindo-lhes 2 h recuperar a 37 ° C (5% CO₂) antes de prosseguir com a instalação de ensaio.
3. Cultura de co
   1. Conte as células usando um hemocytometer então girar para baixo (800 x g por 5 min a 23 ° C) de 50.000 células por alvéolo para ser analisada (de células do dador e do alvo). Resuspending 1 x 10⁶ células/mL em RPMI completa sem puromicina.
   2. Em um prato, adicione 25 µ l de suspensão de células do doador a cada poço; no outro prato, adicione 25 µ l de células-alvo.
   3. Para cada poço, adicione 25 µ l do teste composto diluído em meio completo RPMI na concentração apropriada. Incube as células do doador e destino com o composto por 30 min.
      Nota: A concentração pode variar por drogas. Se tem um conhecido IC₅₀, use isso como ponto de partida, titulada acima e abaixo. Se o IC₅₀ é desconhecido, prepare um estoque de 200 µM para uma concentração final de 10 µM.
   4. Após o pré-tratamento, combinar as células do doador com as células alvo pipetando igualmente o conteúdo de uma placa para a outra e incube as celulas para 40 h em uma incubadora de cultura de tecidos, a 37 ° C com 5% de CO₂.
4. Citometria de fluxo
   1. Adicione paraformaldeído (PFA) em cada poço a uma concentração final de 2%.
      Nota: Para uma solução de reserva de 16%, isto é 14 µ l por 100 µ l.
   2. Cuidado: PFA é prejudicial à pele e olhos. Vestir um jaleco, luvas e óculos de segurança e lidar com a solução em uma capa de segurança.
   3. Leia as células em um citômetro de fluxo com FITC canais e mCherry.
      Nota: É possível ver 5 – 20% das células expressando GFP acima fundo no células infectadas vs. células não infectadas.
   4. Visualizar o sinal GFP através de microscopia de fluorescência (40 X) em canais específicos GFP (com um filtro de excitação de 400 nm e um filtro de emissão de 508 nm).

3. alternativo protocolo para uma infecção de vírus de celular-livre

1. Preparação de células alvo
   1. Descongelar um 500 µ l frasco de células de repórter Jurkat RG, colocando em banho maria a 37 ° C. Pipetar as células do frasco 10 mL de meio completo RPMI e centrifugar o meio completo RPMI a 800 x g por 5 min a 23 ° C. Resuspenda o pellet em 20 mL de meio completo RPMI num balão de T-75. Incube o frasco durante a noite (37 ° C e 5% CO₂).
   2. No dia seguinte, adicione 0,5 µ g/mL de puromicina (1 µ l de um estoque de 2 mg/mL por 8 mL de mídia). Cultura das células, mantendo uma densidade de 200.000-800.000 células/mL (contados através de hemocytometer).
   3. O dia antes de configurar o ensaio de transferência, dividi as células até 200.000-400.000 células/mL em meio RPMI fresco contendo 0,5 µ g/mL de puromicina.
2. Produção de uma célula livre de vírus
   1. Transfect um prato de 10cm confluente de 70% de 293T células¹¹ (em 10 mL de DMEM com 10% FBS) com 5 µ g de Gag-iCre¹ plasmídeo usando transfeccao à base de cálcio¹³.
      Nota: Esta escala produzirá 10 mL de vírus, que é suficiente para aproximadamente duas a quatro placas de 96 alvéolos, dependendo da eficiência do transfection.
   2. Recolher o sobrenadante viral todo a 48 h por pipetagem os meios de comunicação da placa em um tubo cônico de 15 mL e a centrifugação do tubo a 3.000 x g por 5 min para todos os detritos de célula de Pelotas.
   3. Anexe um filtro de 0,45 µm para uma seringa de 10 mL. Após a centrifugação, tirar todo o sobrenadante e carregar a seringa. Execute a amostra através de um tubo limpo 15 mL.
   4. Use o vírus para infectar células alvo imediatamente (passo 3.3) ou congelar e armazenar o vírus a-80 ° C (descongelar a amostra conforme necessário antes de usar).
3. Infecção
   1. Contar as células de destino RG Jurkat (da etapa 3.1.3) usando um hemocytometer e rotação para baixo 50.000 células alvo por alvéolo a 800 x g por 5 min, resuspending as células a 1 x 10⁶ células/mL em RPMI completar meio sem puromicina.
   2. Em um prato, adicione 25 µ l de células Jurkat RG-alvo para cada poço; em uma placa separada, adicione 25 µ l (2 ng) vírus a cada poço.
   3. Para cada poço, adicione 25 µ l do teste composto, diluído em mídia na concentração apropriada. Incube as células e os vírus com o composto por 30 min.
      Nota: A concentração de teste pode variar por drogas. Se tem um conhecido IC₅₀, use isso como ponto de partida, titulada acima e abaixo. Se desconhecido, prepare um meio de estoque 200 µM para uma concentração final de 10 µM.
   4. Após o pré-tratamento, adicionar todo o conteúdo (50 μL) do vírus/composto mix de poços para as células alvo e incubar tudo para 40 h em uma incubadora de cultura de tecidos, a 37 ° C com 5% de CO₂.
4. Citometria de fluxo
   1. Adicione o PFA a cada poço a uma concentração final de 2%.
      Nota: Para uma solução de reserva de 16%, isto é 14 µ l por 100 µ l.
   2. Leia as células em um citômetro de fluxo com FITC canais e mCherry. O sinal GFP também pode ser visualizados através de microscopia de fluorescência em canais GFP.
      Nota: Uma vez esperar para ver a 5 – 20% das células expressando GFP acima fundo no células infectadas vs. as células não infectadas.

Resultados

Não infectados RG Jurkat células apresentam um baixo nível de sinal GFP de fundo (0,3%) com um sinal muito forte de RFP (Figura 2A, coluna não infectada). A infecção com mordaça-iCre provoca um aumento no sinal GFP (24,9%), enquanto a presença de inibidor de fusão do HIV-1 AMD3100 (20 µM) inibe o desenvolvimento deste sinal, trazendo-a para baixo aos níveis de fundo não infectados (0,34%). Quando um inibidor de um evento pós-fusão, como o inibid...

Discussão

O ensaio de Gag-iCre tem provado para ser muito útil para a seleção de candidatos a fármacos que podem inibir a etapa de fusão da replicação viral. Ao executar este teste, os mais importantes passos para obter um bom sinal são semelhantes aos ensaios de infecção virais mais. O primeiro passo crítico está produzindo altos títulos de vírus de boa qualidade. Esta etapa exige que as células 293T são passadas com frequência (pelo menos 1 x cada 48h) para que eles não se tornam overconfluent e aglutinar-se. A...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).