Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Resumo

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Resumo

Cultivo Caenorhabditis elegans (c. elegans) de uma forma em grande escala em placas de ágar-ágar pode ser demorado e difícil. Este protocolo descreve um método simples e de baixo custo para obter um grande número de animais para o isolamento de proteínas para prosseguir com um western blot, espectrometria de massa ou novas análises proteômica. Além disso, um aumento de números de nematoides para immunostainings e a integração de múltiplas análises sob as mesmas condições de cultivo podem facilmente ser alcançados. Além disso, uma transferência entre placas com diferentes condições experimentais é facilitada. Técnicas comuns na cultura de placa envolvem a transferência de um único c. elegans , usando um fio de platina e a transferência de ágar povoada pedaços usando um bisturi. No entanto, com o aumento do número de nematoides, essas técnicas se tornar excessivamente demoradas. Este protocolo descreve a cultura em grande escala de c. elegans incluindo numerosas medidas para minimizar o impacto da preparação amostra sobre a fisiologia do worm. Fluido e tensão de cisalhamento podem alterar o tempo de vida de e processos metabólicos em c. elegans, exigindo assim uma descrição detalhada das etapas críticas para recuperar resultados confiáveis e reprodutíveis. C. elegans é um organismo modelo, constituído por células neuronais para até um terço, mas falta os vasos sanguíneos, proporcionando assim a possibilidade de investigar unicamente neuronais alterações independentes de controle vascular. Recentemente, descobriu-se cedo neurodegeneração retinopatia diabética antes alterações vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. Por exemplo, uma maior formação de avançados de glicação produtos finais (idades) e espécies reativas de oxigênio (ROS) é observada, que se encontram reproducibly em c. elegans. Protocolos para lidar com amostras de tamanho adequado para um amplo espectro de investigações são aqui apresentados, exemplificado pelo estudo da diabetes induzido por alterações bioquímicas. Em geral, este protocolo pode ser útil para estudos que exigem grande c. elegans números e em qual cultura líquida não é adequada.

Introdução

Análise de proteína, como um borrão ocidental ou espectrometria de massa, exige mg de proteína. Este rendimento requer um cultivo em grande escala de centenas de c. elegans, que pode ser feito por cultura líquida ou em meios sólidos, transferir os nematódeos por lavagem. Fluido e tensão de cisalhamento induz a expressão dos canais de sódio epitelial (ENaC), que poderia aumentar o estresse osmótico através de um aumento da absorção de sódio, potencialmente alterando o tempo de vida de c. elegans e afetando análises metabólicas¹ . Portanto, algumas etapas críticas neste protocolo para a abordagem baseada em placa leva a redução de estresse que afetam a variabilidade experimental em conta. Cultura líquida, por outro lado, influencia o fenótipo dos nematódeos e complica a cultura e a coleção de um número exato de nematoides². Além disso, substâncias reativas podem ser alteradas pelos componentes de mídia e podem distribuir irregularmente antes de atingir os nematoides. Sobre as limitações da cultura líquida, este protocolo fornece uma abordagem alternativa para cultivo em grande escala amostras de c. elegans.

C. elegans é um organismo modelo com uma rede distinta de 302 células neuronais, inventando um terço de todas as suas células³. Desde a sua introdução em ciência, muitos homólogas e genes ortólogos têm sido descritos, ampliando seu valor como um modelo para pesquisa médica. Recentemente, evidências de comprometimento neurológico em retinopatia diabética, precedendo a lesão vascular, foi apresentada⁴. C. elegans é desprovido de vasos sanguíneos, mas contém uma rede neuronal distinta, tornando-se um modelo adequado para investigar alterações neuronais além aqueles vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. As alterações bioquímicas em complicações do diabético envolvem a formação de idades, que mais influenciam a formação de ROS em resposta à hiperglicemia⁵. As idades encontram-se em c. elegans e contribuam para o dano neuronal⁶. Doenças crônicas são frequentemente causadas por processos complexos, poligênicos, exigindo uma abordagem Multiparamétrico para a avaliação de seus mecanismos subjacentes, como exemplificado aqui com a avaliação de complicações do diabético. Este protocolo pode ser útil para a obtenção de vários parâmetros simultaneamente, bem como posteriormente. Maior comparabilidade e reprodutibilidade de uma abordagem Multiparamétrico podem ser alcançados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

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Protocolo

Nota: Este protocolo é dividido em cinco seções. Nas seções 1-3, é apresentado o protocolo principal à cultura de c. elegans em larga escala. Nas secções 4 e 5 fornecem protocolos adicionais para a avaliação dos metabolitos exemplificadas ocorrendo em metabólitos diabéticos. No detalhe, seção 1 descreve uma cultura geral em larga escala em placas. Secção 2 centra-se sobre a transferência de grandes quantidades de c. elegans, Considerando que a seção 3 explica que a colheita de uma amostra de grande escala. Seção 4 explica o isolamento de proteína da amostra e a seção 5 descreve a preparação de amostras para análises subsequentes líquida cromatografia-tandem espectrometria de massas (LC-MS/MS).

1. em grande escala cultura em placas

1. Em geral, trabalhe sob uma capa estéril ou perto de chamas para evitar contaminações.
2. A cultura vermes até atingirem a fase adulta jovem, siga este protocolo previamente publicado⁷ com as seguintes adaptações.
   1. Use vivos OP50 Escherichia coli bactérias para alimentar os nematódeos e preparar ágar de fluorodeoxyuridine 400 µM (não ampicilina/FUdR) para experimentos.
   2. Para a preparação de uma população síncrona, use OP50 não concentrado e para suceder experimentos com os adultos, use 3.3 x OP50 concentrada através da remoção de 70% do líquido sobrenadante.
   3. Recomendam-se intervalos de alimentação diários. Ao avaliar o estresse oxidativo, intervalos diferentes e volumes para a alimentação podem interferir com os resultados.
   4. Para inoculação, levar um prato com diversos nematódeos e corte em pedaços de aproximadamente 0,5 x 1 cm² com um bisturi. Transferência de duas a três peças nas chapas de mídia (NGM) nematoides crescimento de 60 mm de diâmetro, contendo OP50 não concentrado.
   5. Incubar as placas à temperatura adequada para a tensão (N2 do selvagem-tipo devem ser cultivadas em 20 ° C) até que os ovos são visíveis na placa.
   6. Lave a maioria dos ovos e animais adultos com 2 mL de tampão de M9 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. Enquanto isso, comece a preparar a solução de branqueamento.
   7. Retire o tubo centrifugado e remover o tampão M9 com uma pipeta de 10 mL. Adicione 10 mL de solução de branqueamento e misture no vórtice até os nematódeos adultos lysed. Isso leva normalmente cerca de 5 – 7 min, mas não deve demorar mais do que 15 min ou os ovos não desenvolverá totalmente adiante no experimento.
   8. Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. lavar 3 vezes com 10 mL M9 para limpar os ovos da solução de branqueamento.
   9. Agora adicione 150 µ l de suspensão de ovo em placas OP50. Uma densidade de 200 – 300 ovos deve ser alcançada em cada prato. Espere até nemátodes alcançado o estágio adulto.
      Nota: O buffer de M9 (pH 7.0) usado para as experiências retratadas consiste das seguintes substâncias: 22mm KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄e 86 mM de NaCl. Após autoclavagem a mistura, adicione 1 mM MgSO4. A branqueamento solução contém 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl resolvido em água destilada.
   10. Prepare-se estéril M9 reserva, pontas de pipeta estéril com um corte de ponta para lavar o worms e tubos de 15 mL para coletá-los em.
   11. Aplicar aproximadamente 1 mL de tampão de M9 nas placas, delicadamente distribuir o buffer por balançando e, gentilmente, pipetar os nematódeos no prato.
   12. Agora, recolha os nematódeos no tubo. Aplicar 150 µ l de suspensão diretamente nas placas (semeado com OP50) com as pontas de pipeta corte e avaliar microscopicamente a densidade dos nematódeos (recomendado: 50 – 100 nematoides por placa de 60 mm).
   13. Se são muito densos, diluir a suspensão com buffer M9 e avaliá-lo sob o microscópio até a densidade desejada é atingida. Se o rendimento é muito pequeno, deixa os vermes assentar ou centrifugar a suspensão 10 s a x 800 g para remover o fluido.
       Nota: Um exemplo de uma densidade suficiente é dado em (macroscópicas) a figura 1A e 1B (microscópicos) no aumento de 20 X. Prosseguir empiricamente como descrito.
   14. Tenha em mente que os vermes assentar-se rapidamente. Para garantir uma repartição equitativa entre as placas, inverta o tubo após cada pilha de placas (placas de 4 – 5).
       Nota: O corte pipeta de ponta, bem como o balanço suave e lavagem das placas, reduz a tensão de cisalhamento.

2. transferência de grandes quantidades de Caenorhabditis elegans

1. Lave os nematódeos com aproximadamente 500 µ l de tampão de M9, dependendo da idade e ressecamento das placas. Usando a mesma reserva, repita desanexando os nematódeos, até que a maioria dos animais é recolhida em suspensão.
2. Lentamente, ocupam os nematódeos com uma ponta de pipeta corte e transferi-los em um prato preparado com OP50. Deixe a placa secar.
   Nota: Tenha cuidado para não aplicar muito mais do que o volume recomendado. Especialmente em experiências a longo prazo, as placas não podem tolerá-lo e o ágar-ágar pode quebrar, permitindo que os nematoides que rastejar nas rachaduras.

3. a colheita de uma grande amostra de Caenorhabditis elegans

1. Dependendo do método selecionado, inicie experiências com uma quantidade suficiente de c. elegans. Para análises de LC-MS/MS, prepare 20 placas (60 x 15 mm) por grupo com aproximadamente 100 nematoides por placa para assegurar um rendimento de pelo menos 200 µ g de proteína por exemplo.
   Nota: Esta parte do protocolo não exige mais, trabalhando em condições estéreis como os nematoides serão coletados e congelados.
2. No dia da coleta da amostra, prepare nitrogênio líquido para snap-congelar as amostras coletadas. Mantenha não estéreis M9 buffer no gelo para diminuir o metabolismo do nemátodo.
3. Lave o c. elegans , as chapas, aplicando 1 mL de tampão de M9 e agitando suavemente as placas. Isso evita coletando falecidos nematoides e a maioria dos ovos, se houver qualquer presente, porque eles aparecem para as bactérias e o ágar-ágar.
4. Ocupam o volume e transferi-lo para um tubo de 15 mL.
5. Após a coleta da amostra completa, espere que os nematoides resolver ou centrifugar o tubo momentaneamente a 800 x g e remover a maioria do buffer M9. Lavar a amostra 3 x com cerca de 10 mL de M9 (10x o volume da amostra) para remover todas as bactérias.
   Nota: Para garantir que todos os nematoides falecidos são removidos, flutuação de sacarose é outra opção. No entanto, isso não era adequado para os experimentos exibido¹⁵. Sacarose é hidrolisado em glicose e frutose. Nas experiências de retratados, o papel da glicose foi avaliado para promover mudanças bioquímicas encontradas em diabetes crônica. Assim, a flutuação de sacarose potencialmente poderia confundir os resultados.
6. Prepare um tubo de 1,5 mL com 1 mL de tampão de M9 e um tubo vazio de 1,5 mL para cada amostra. Transferi a pelota com uma pipeta de vidro do tubo de 15ml para o tubo vazio 1,5 mL. Esta etapa é essencial para garantir uma transferência quantitativa.
   Nota: Ao contrário durante as etapas anteriores, aqui os nematódeos são mais concentrados. Por causa de uma possível adesão ao pontas de pipeta plástica, perda de grande parte da amostra é esperada. Portanto, use pipetas de vidro em vez disso.
7. Após a transferência, use a pipeta de vidro para pegar 1 mL de tampão de M9 do segundo tubo de 1,5 mL para enxaguar os nematódeos da parede da pipeta. Além disso, lave os nematódeos restantes do tubo de 15 mL e transferi-los para o tubo de amostra.
8. Centrifugar o tubo de amostra no 19.000 x g por 1 min e em seguida, remover o sobrenadante possível.
9. Feche o tubo com Parafilm e imediatamente snap freeze-lo em nitrogênio líquido. Armazene o tubo a-80 ° C até a preparação de lisado.

4. proteína isolamento por espectrometria de massa

Nota: O isolamento da proteína aqui descrito também pode ser usado para outros ensaios (por exemplo, borrão ocidental).

1. Para a amostra congelada, adicione os mesmos volumes de grânulos de óxido de zircônio de 0.5 mm e pelo menos 2x o volume de lisado tampão contendo um coquetel de inibidor de protease.
   Nota: As análises de correlação de nematoides-para-proteína retratados foram realizadas usando 100 µ l de tampão. Amostras de LC-MS/MS foram lysed com 200 µ l de tampão.
2. Inicie o homogeneizador por 1 min na velocidade 9. Certifique-se de que as amostras completamente lysed. Repita essa etapa se eles não lysed totalmente.
3. Centrifugar as amostras por 30 min a 4 ° C no 19.000 x g. Transferir o sobrenadante para um tubo novo no gelo e armazená-lo a-80 ° C até mais medidas vão ser tomadas.
   Nota: O buffer não-desnaturação usado para experimentos retratados consiste das seguintes substâncias: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl 1% Triton-X e 2 mM de EDTA.
   Nota: Tendo seguido os passos do presente protocolo e tendo aplicado a escala sugerida, o rendimento de uma pelota de proteína de aproximadamente 1.000 nematoides deve ser de aproximadamente 500 µ g. Para mais comparações, consulte a Figura 2 e os Resultados de representante.

5. amostra preparação para medições de espectrometria de massa em tandem-cromatografia líquida

Nota: Dependendo do parâmetro de interesse, a preparação da amostra será diferente. Este protocolo incide sobre metilglioxal e determinação de idade.

1. Medir o metilglioxal intracelular por derivatização com 1,2-diaminobenzene (DB) como descrito anteriormente,⁹.
   1. Homogeneizar as amostras com 20 µ l de gelado ácido tricloroacético de 20% (wt/vol) em cloreto de sódio 0,9% (wt/vol) e 80 µ l de água em um tubo de 1,5 mL.
   2. Spike as amostras de 5 µ l com padrão interno (¹³C₃-MG; 400 nM), misturá-los pela utilização do Vortex e centrifugá-los a 21.000 x g por 5 min a 4 ° C.
   3. Transferi 35 µ l do sobrenadante para o frasco de amostra HPLC contendo uma pastilha de vidro de 200 µ l.
   4. Adicione 5 µ l de 3% de azida sódica (wt/vol) para cada amostra, seguida de 10 µ l de 0,5 mM DB em 200mm HCl contendo 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic ácido (DETAPAC) em água.
   5. Incube as amostras para 4 h à temperatura ambiente, protegida da luz.
   6. Analise as amostras por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,⁹.
      Nota: Para a medição de idades, isole as proteínas conforme descrito na seção 4 do protocolo.
2. Medir a concentração de proteína dos lysates (descongeladas) usando um ensaio de Bradford¹⁰.
   1. Preparar alíquotas de 30 µ l para uma curva padrão cravada com albumina de soro bovino (BSA) resolvida em tampão fosfato salino (PBS) da seguinte concentração: 0; 0.1; 0,2; 0.3; 0,4; 0,6; 0,8; e 1,0 mg/dL.
      Nota: Se a amostra foi preparada para o tamanho sugerido (consulte a etapa 4.1 para a preparação de lisado com 200 µ l de tampão), a concentração estimada deve ser no intervalo de aproximadamente 2-7 mg/mL. Neste caso, dilua as amostras 01:10 com PBS antes da medição.
      Nota: Para os primeiros experimentos usando este método, recomenda-se medir as amostras em diferentes diluições (1, 01:10 e 1: 100). Como não há nenhuma determinação exata do número de nematoides, o rendimento pode diferir entre investigadores individuais.
   2. Usar uma placa de 96 poços transparente (poliestireno) e pipetar 10 µ l de cada concentração de padrão e das amostras nas diluições escolhidas em duplicatas em poços.
   3. Diluir a proteína ensaio corante reagente concentrado 1:5 com água destilada (aq. dest.) e adicionar 200 µ l da diluição para cada amostra na placa. Incube a placa por 10 min à temperatura ambiente.
   4. Medir a absorvância dentro de 30 min em 595 nm com um leitor de placa. As amostras podem ser interpoladas a partir da curva padrão calculada. Mais detalhes do método foram descritas extensivamente na literatura¹⁰.
3. Medir as idades intracelulares, como descrito anteriormente,^11,12.
   1. Lave os extratos de proteínas totais (aproximadamente 200 µ g) 3x com água por ultracentrifugação em 10 unidades de filtro centrífugo kDa.
   2. Adicionar 10 µ l de HCl a 100 mM, 10 µ l de pepsina (2 mg/mL em 20 mM HCl) e 10 µ l de timol (2 mg/mL em 20 mM HCl) à proteína recuperada (cerca de 100 µ l) e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.
   3. Neutralizar e as amostras do buffer em pH 7,4, adicionando 12,5 µ l de tampão de fosfato de potássio 0,5 M (pH 7,4) e 5 µ l de KOH de 260 mM.
   4. Adicionar 10 µ l de Pronase E [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de uma solução de penicilina-estreptomicina e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.
   5. Adicionar 10 µ l de aminopeptidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de prolidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e incubar as amostras a 37 ° C por 48 h.
   6. Analise o hidrolisado resultante por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,¹².

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Resultados

Aqui exemplos de criação de uma grande escala de c. elegans cultura para aplicações em pesquisa do diabetes são apresentadas. Pode ser de interesse para relacionar os parâmetros de um único animal, ao invés de normalizar isso à concentração de proteínas totais. Em um ensaio que exige um pequeno número de nematoides, isso pode ser facilmente realizado pela contagem dos nemátodes. Para uma grande escala de c. elegans cultura envolvendo centenas de nematoides ...

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Discussão

Este protocolo apresenta uma abordagem confiável para o cultivo em grande escala de c. elegans , obter resultados quantitativos. Achados da literatura poderiam ser replicados como mostrado nos Resultados de representante. Mesmo que este protocolo para a recolha de amostras em grande escala de c. elegans parece ser um método direto, há certas armadilhas para ter em conta. Sobre a sincronização da população de nematoides, este protocolo descreve uma abordagem por branqueamento da p...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.