Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

Resumo

Nós descrevemos três métodos experimentais para avaliar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos em vitro: quantificação do conteúdo de atividade e 2) melanina tirosinase 1) celular e 3) medição de melanina por celular melanina mancha e análise de imagem.

Resumo

Este estudo apresenta métodos de laboratório para a quantificação de hipopigmentação atividade in vitro. Melanina, o pigmento principal em melanócitos, é sintetizada em resposta a múltiplos fatores celulares e ambientais. A melanina protege as células da pele de dano ultravioleta, mas também tem funções biofísicas e bioquímicas. Produção excessiva ou acúmulo de melanina nos melanócitos pode causar problemas dermatológicos, como sardas, manchas, melasma e moles. Portanto, o controle da melanogênese com hipopigmentação agentes é importante em indivíduos com necessidades clínicas ou cosméticos. Melanina é sintetizada principalmente nas melanossomas dos melanócitos em um complexo processo bioquímico chamado melanogênese, que é influenciado por extrínsecos e fatores intrínsecos, como hormônios, inflamação, idade e exposição à luz ultravioleta. Nós descrevemos três métodos para determinar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos ou substâncias naturais em melanócitos: medição da atividade de tirosinase 1) celular e conteúdo de melanina 2) e 3) coloração e quantificação celular melanina com imagem análise.

Na melanogênese, tirosinase catalisa a etapa limitante que converte a L-tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (l-dopa) e depois em dopaquinone. Portanto, a inibição da tirosinase é um mecanismo primário hipopigmentação. Em melanócitos cultivados, atividade de tirosinase pode ser quantificada pela adição de l-dopa como substrato e produção de dopaquinone de medição por espectrofotometria. Melanogênese também pode ser medido através da quantificação do conteúdo de melanina. A fração celular contendo melanina é extraída com NaOH e melanina é quantificada espectrofotometricamente. Finalmente, o conteúdo de melanina pode ser quantificado por análise de imagem após coloração de Fontana-Masson de melanina. Embora os resultados desses ensaios in vitro não podem sempre ser reproduzidos na pele humana, estes métodos são amplamente utilizados na pesquisa da melanogênese, especialmente como o passo inicial para identificar potenciais hipopigmentação atividade. Esses métodos também podem ser usados para avaliar a atividade dos melanócitos, crescimento e diferenciação. Resultados consistentes com os três diferentes métodos garantir a validade dos efeitos.

Introdução

A melanina desempenha um papel crítico na fisiologia, patologia e toxicologia de vários órgãos, incluindo a pele, olhos e cérebro¹. As principais funções de melanina são efeitos foto-triagem e bioquímicos. A melanina absorve a luz infravermelha e visível, bem como a radiação ultravioleta (UV), com taxas de aumento de absorção em comprimentos de onda mais curtos de luz; assim, a melanina protege tecidos dos danos causados pela luz visível ou UV radiação². A melanina é um antioxidante e tem uma afinidade com metais e outros produtos químicos tóxicos; Portanto, pode proteger os tecidos de estresse oxidativo e químicas³. No entanto, a produção excessiva de melanina provoca problemas dermatológicos.

A quantidade e a qualidade de melanina na pele e íris são os mais importantes determinantes da cor da íris e da pele. Os indivíduos podem ter preferências de cor de pele diferente; alguns favorecem uma pele bronzeada, enquanto outros favorecem a cores de pele mais claras. Dependendo desses perfis de consumidor, hipopigmentação cosméticos foram desenvolvidos para satisfazer cada um dos mercados para pele favorecido cores⁴. Da mesma forma, estudos de atividade hipopigmentação e antifato são importantes, tanto cientificamente como na prática.

Melanogênese é o processo complexo de biossíntese de melanina através de uma série de reações químicas enzimáticas e espontâneas em melanócitos. Um melanócito é cercado por aproximadamente 36 queratinócitos e melanócitos são as fábricas de síntese de melanina que distribuem seus produtos para os queratinócitos vizinhos. Na pele, a melanina produzida e armazenada no compartimento de partir dos melanócitos é transportada para queratinócitos vizinhos nos epiderme através de dendritos.

L-tirosina serve como substrato inicial para a melanogênese e a tirosinase enzima catalisa duas reações consecutivas que convertem a L-tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) e depois em dopaquinone. Estas reações são o passo limitante na melanogênese^5,6. Por conseguinte, hipopigmentação atividade primeiro pode ser medida avaliando a atividade de tirosinase celular diretamente. Para fazer isso, melanócito extratos contendo tirosinase são incubados com DOPA e o dopaquinone produzido nas amostras pode ser medido por espectrofotometria em 475 nm. Os valores são normalizados pelas concentrações de proteína das amostras e substâncias com resultado de atividade hipopigmentação em menos formação de dopaquinone em comparação com controles.

Em segundo lugar, atividade hipopigmentação pode ser quantificada através da medição de melanina nos melanócitos cultivados diretamente. Após tratamento de células com o material de teste, a melanina é extraída sob condições alcalinas e o conteúdo de melanina é quantificado por espectrofotometria em 400 nm. Um agente de hipopigmentação resultará em um menor conteúdo de melanina que os controles⁷.

Finalmente, a atividade de hipopigmentação pode ser quantificada pela coloração de Fontana-Masson melanina e análise de imagens subsequentes. Na coloração de Fontana-Masson, grânulos de melanina reduzem nitrato de amônia-prata para um estado visível de preto metálico e as áreas pretas de células em imagens microscópicas representam a quantidade de melanina.

Um agente de hipopigmentação geralmente dá resultados consistentes e comparáveis com estes três métodos, que confirma que a atividade da substância é válida. Alternativamente, pode ser útil medir a expressão de genes-chave e proteínas na melanogênese em resposta a uma substância de teste para examinar a atividade hipopigmentação. Além de tirosinase, proteínas relacionadas a tirosinase (TRP-1) e dopachrome dopachrome (TRP-2) são enzimas essenciais na melanogênese⁸. O fator de transcrição microphthalmia-associado do fator de transcrição (MITF) é um mestre regulador na melanogênese e quantificação dos seus níveis de expressão de gene/proteína ou um ensaio de atividade do promotor também pode ser usado para avaliar a atividade de hipopigmentação.

Protocolo

1. preparação de reagentes, compostos e médio

1. Prepare B16F10 meio completo de crescimento. Suplemento Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (PEST).
   1. Para fazer 500 mL de meio completo, misture 445 mL do meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 50 mL de FBS e 5 mL de pragas em um frasco de vidro esterilizado de 1 L. Após a mistura suavemente, filtrar o meio através de um filtro de garrafa-top 0,2 µm para um novo frasco de vidro esterilizado e então loja a 4 ° C.
      Atenção: Todas as técnicas de cultura de célula devem ser realizadas utilizando a técnica asséptica para garantir a esterilidade de segurança microbiológica.
2. Preparar a Lise: 20 mM Tris (hidroximetil) aminometano contendo 0,1% de buffer X-100 Triton (v/v) em pH 7,5 (pH ajustado com HCl). Esse buffer pode ser usado por 3 meses quando armazenado à temperatura ambiente (RT). Adicione inibidores da protease para o amortecedor do lysis bem antes do uso.
3. Prepare o buffer de ensaio de inibidor de tirosinase. Prepare 1 M NaH₂PO₄ (monobásico) e 1 M Na₂HPO₄ (dibásico) Soluções conservadas em estoque. Misture 46,3 mL de Na₂HPO₄ e 53,7 mL de NaH₂PO₄ para preparar um volume final de tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,8).
   1. Dilua a mistura resultante de 1 L (volume final) com H₂O. ajustar o pH da solução final para 6,8. Esse buffer pode ser usado por 1 mês quando armazenadas a 4 ° C.
4. Preparar a solução de substrato tirosinase: 0,1% 3,4-diidroxi-L-fenilalanina (DOPA, p/v) dissolvido em buffer de ensaio de inibidor de tirosinase (consulte a etapa 1.3).
   PRECAUÇÃO: Mantenha no gelo durante a utilização.
5. Opcionalmente, prepare a tirosinase de cogumelo 100 U/mL. Dissolva o liofilizado tirosinase de cogumelo no buffer de ensaio de inibidor de tirosinase. Esta solução pode ser usada por 2 meses quando armazenado a – 20 ° C. A atividade da tirosinase de cogumelo, bem como atividade de tirosinase celulares é calculada na presença de materiais da célula.
   Atenção: A solução é aliquotada antes de congelar assim repetidos congelamento e descongelamento pode ser evitado. Manter a solução no gelo durante a utilização.
6. Prepare a solução de NaOH N 1. Pesar 4 g de NaOH em um balão volumétrico e dissolvê-lo em água destilada para completar 100 mL.
7. Prepare a solução de fixação (formol a 10%). Dilua 27 mL de formol 37% com 73 mL de água destilada. Prepare-se frescas diariamente.
8. Prepare a solução-mãe de prata amoniacal. Prepare-se 5 mL da solução de nitrato de prata 10% em um balão volumétrico. Adicione solução de hidróxido de amônio gota a gota, até que o precipitado é dissolvido completamente. Adicione 200 μL de solução de nitrato de prata (10%). A solução se tornará ligeiramente turva.
   PRECAUÇÃO: Evite contato e inalação. Use uma coifa.
9. Prepare a solução de trabalho de prata amoniacal. Dilua 2,5 mL da solução-mãe de prata amoniacal com 7,5 mL de água destilada. Usar uma vez e depois descartar.
   PRECAUÇÃO: Evite contato e inalação. Use uma coifa.
10. Prepare-se cloreto de ouro de 0,1%. Prepare-se 1 mL de cloreto de ouro de 10% e o Adicionar 99 mL de água destilada num balão volumétrico. Prepare-se frescas diariamente.
11. Prepare a solução salina tampão de fosfato (PBS). Adicione 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ e 0,24 g de KH₂PO₄ em 800 mL de água destilada. Ajuste o pH para 7,4 com HCl. Dilua a mistura resultante de 1 L (volume final) com água destilada.
12. Prepare a solução de tiossulfato de sódio 5% (p/v) dissolvida em água destilada.

2. cultura e tratamento da pilha

1. Use comercialmente disponíveis células B16F10. Manter as células B16F10 no meio completo. Mantenha o frasco de cultura de células em um umidificado, incubadora de atmosfera de 5% CO₂ a 37 ° C.
2. Prepare compostos de teste, controle positivo de inibidor e amostras de controlo negativo.
   1. Dissolva os compostos de teste em solventes adequados. Dissolva compostos solúveis em água em água bidestilada. Dissolver água compostos insolúveis no solvente orgânico apropriado, por exemplo., DMSO.
   2. Aqui, use arbutin dissolvido em água bidestilada (125 μg/mL) como um controle positivo para avaliar a atividade de hipopigmentação comparada com compostos de teste ou um controlo negativo. Como um controle negativo (tratada com veículo de controle), use as soluções ou buffers usados no teste de amostra, por exemplo, água bidestilada, DMSO, etanol.
3. A propagação de células e tratamento
   1. As células B16F10 de semente em 5 × 10⁴ células/poço em placas de 24 poços cultura usando meio completo e incubá-los numa incubadora de CO₂ por 24 h. Após a incubação, Aspire o meio completo.
   2. Incube as células com DMEM meio (sem FBS e 1% penicilina/estreptomicina) contendo compostos de teste, um controle inibidor ou um controlo negativo numa incubadora de CO₂ para células de seleção de 72 h. cada 24 h sob o microscópio. Após esta etapa, ir aos passos 3-5 para novas experiências.
      Atenção: A mistura da substância e meio DMEM deve ser filtrada através de um filtro de 0,2 μm.

3. medir a atividade de tirosinase celular

1. Usando o método descrito na etapa 2, remova a mídia e enxágue células duas vezes com 300 µ l de PBS frio.
2. Coloque a placa de cultura de células no gelo. Adicionar 300 μL de tampão de Lise e incubar durante 5 min. Em seguida, coletar o lisado com uma espátula de célula a célula e transfira o lisado celular para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga.
3. Homogeneizar o lisado celular com um homogeneizador de célula a 14.500 rpm por 2 s, 3 vezes no gelo para obter tirosinase intracelular. A condição ideal específico de uso para o homogeneizador.
4. Centrifugar durante 10 min a 12.000 x g a 4 ° C e transferir a célula sobrenadante para um tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Manter-se no gelo durante a utilização.
5. Transferi 70 μL do sobrenadante para uma microplaca de 96 poços clara poliestireno.
6. Adicionar 140 μL de uma solução contendo substrato de tirosinase (DOPA) para uma microplaca de 96 poços clara poliestireno, agite e incubar durante 2 h a 37 ° C.
7. Opcional, adicionar 70 μL de solução de tirosinase de cogumelo 100 U/mL a cada poço e incubar durante 2 h a 37 ° C.
8. Medir a atividade de tirosinase no comprimento de onda de 475 nm, utilizando o leitor de microplacas.
9. Normalize a atividade da tirosinase com a concentração de proteína de cada amostra. Medir a concentração de proteína de cada amostra por um ensaio de Bradford.

4. medir o teor de melanina

1. Usando o método descrito na etapa 2, remova a mídia e enxágue células duas vezes com 300 µ l de PBS frio.
2. Coloque a placa de cultura de células no gelo. Adicionar 300 μL de tampão de Lise e incubar durante 5 min. Em seguida, coletar o lisado com uma espátula de célula a célula e transfira o lisado celular para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga.
3. Centrífuga para 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.
4. Transferi o sobrenadante para um novo tubo e medida de concentração da proteína total para normalização. Medir a concentração de proteína de cada amostra por um ensaio de Bradford.
5. Adicionar 300 μL de 1 N de NaOH para cada pellet e incubar a 60 ° C durante 1 h.
6. Centrifugue a solução dissolvida durante 10 minutos a 12.000 x g a 4 ° C.
7. Transferi 200 μL do sobrenadante para uma microplaca de 96 poços.
8. Medir o conteúdo de melanina no comprimento de onda de 400 nm.
9. Normalize o conteúdo de melanina para a concentração de proteína.

5. Fontana-Masson coloração

1. Coloração de Fontana-Masson
   1. Lave as células duas vezes com 300 µ l de PBS frio.
   2. Adicionar 200 μL de formol a 10% a cada poço e incubar durante 1 h a 4 ° C.
   3. Enxágue com água destilada.
   4. Adicionar 200 μL de pré-aquecido prata amoniacal solução trabalho e incubar durante 1 h a 37 ° C, ou até que as células se tornam amarelo/marrom na cor.
      Atenção: Coloque a solução de trabalho prata amoniacal recém misturados em um banho de água de 58-60° C e permitir um tempo adequado para equilibrar as temperaturas.
   5. Remover a prata amoniacal solução trabalho e enxágue com água destilada.
   6. Remova a água destilada. Acrescente 200 μL de cloreto de ouro de 0,1% e incube por 2 min em RT
   7. Remover a solução de cloreto de ouro de 0,1% e enxaguar com água destilada.
   8. Remova a água destilada. Acrescente 200 μL de solução de tiossulfato de sódio (5%, p/v) e incube por 2 min.
   9. Remover a solução de tiossulfato de sódio e enxaguar com água destilada.
   10. Remova a água destilada. Acrescente 200 μL de Nuclear Fast Red e incube por 5 min.
   11. Remova Nuclear Fast Red e enxágue com água da torneira.
   12. Remover a água da torneira e observar as células coradas sob um microscópio.
2. Coloração de Fontana-Masson (limiar análise usando o ImageJ)
   Nota: Um exemplo do processo de análise de imagem usando o software ImageJ é mostrado nos materiais suplementares.
   1. Abra o programa ImageJ.
   2. Selecione o arquivo | Aberto | Imagem de microscópio.
   3. Selecione a imagem de | Ajustar | Limite de cor.
   4. Para medir a área manchada de Fontana-Masson, a fasquia brilho parâmetro para zero e ajuste a barra de brilho para encontrar o ponto em que todas as células coradas (castanho escuro ou preto) são incluídas.
   5. Selecione analisar | Analisar as partículas. Marque a caixa de resumir na janela de partículas analisar e pressione Okey. Obter o resultado Resumo e colar em uma folha de cálculo.
      Nota: A descrição dos parâmetros de caixa resultante são os seguintes:
      Fatia: Nome de cada imagem
      Count: Número de células coradas
      Área total: Área Total de células contadas
      Tamanho médio: Área Total/contagem
      % Área: manchado área/Total área × 100%; área total é calculada automaticamente.
   6. Calcular a relação área manchada com melanina usando o valor da área Total.
      Melanina relativa manchada área (%) = valor da área celular total da área total de teste de amostra/média de controle × 100, ou seja,

Resultados

Resultados representativos para a atividade de hipopigmentação de arbutin, um antifato composto, em B16F10 melanócitos são mostrados abaixo. A figura 1A mostra que o arbutin suprimida significativamente a atividade de tirosinase celular comparada com o controle do veículo-tratados. Da mesma forma, o conteúdo de melanina de células estimuladas com arbutin foi significativamente reduzido em comparação com os controles (figura 1B

Discussão

Apresentamos os protocolos para avaliar a atividade de hipopigmentação de compostos de teste usando melanócitos cultivados. Os resultados representativos mostraram o efeito de hipopigmentação de arbutin, um inibidor da tirosinase que inibiu o conteúdo de melanina de celular e atividade de tirosinase. Estes métodos são amplamente utilizados na investigação de actividade antifato. Usando estes ensaios, nós identificamos também com êxito vários compostos bioativos que possuem efeitos inibitórios melanogênese...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU