Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

Resumo

Aqui, descrevemos os protocolos de validação genética e química de c-Fos e Dusp1 como um destino de droga em leucemia utilizando modelos in vitro e in vivo do mouse genética e humanizado. Esse método pode ser aplicado para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Resumo

A demonstração de inibidores de tirosina quinase (TKIs) no tratamento da leucemia mieloide crônica (LMC) tem anunciava uma nova era na terapêutica do câncer. No entanto, uma pequena população de células não responde ao tratamento de TKI, resultando em doença residual mínima (MRD); mesmo o mais potente TKIs falha para erradicar estas células. Estas células MRD servem como um reservatório de desenvolver resistência à terapia. Não é conhecido por tratamento de TKI é ineficaz contra células MRD. Fator de crescimento de sinalização está implicado no apoio a sobrevivência das células MRD durante o tratamento de TKI, mas está faltando uma compreensão mecanicista. Estudos recentes demonstraram que uma elevada c-Fos e Dusp1 expressão como resultado convergente oncogênicos e fator de crescimento de sinalização em células MRD mediam resistência TKI. A inibição genética e química de c-Fos e Dusp1 processa CML requintadamente sensível para TKIs e cura LMC em ambos os modelos genéticos e humanizado do mouse. Nós identificamos estes genes alvo usando microarrays múltiplas de células resistentes e - TKI-sensíveis. Aqui, nós fornecemos métodos de validação de destino utilizando modelos in vitro e in vivo de rato. Esses métodos podem ser facilmente aplicados para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Introdução

Atividade da quinase de tirosina constitutiva do oncogene de fusão BCR-ABL1 faz com que a CML, que fornece uma base racional para direcionar a atividade da quinase por inibidores de pequenas moléculas. O sucesso de TKIs no tratamento de pacientes com LMC revolucionou o conceito de terapia-alvo^1,2. Posteriormente, a terapia antiquinase como medicina de precisão foi desenvolvida para várias outras malignidades, incluindo tumores sólidos. Até agora, mais de trinta inibidores da quinase foram aprovados pelo FDA Estado Unidos para o tratamento de várias neoplasias malignas. TKI tratamento é muito eficaz em suprimir a doença, não é curativa. Além disso, uma pequena população de células cancerosas persiste durante o tratamento: o MRD^3,4,5. Mesmo os pacientes que mostrou remissão completa são deixados com MRD, que eventualmente resultados em recaída, se não continuamente reprimidos. Portanto, a erradicação de células MRD é necessário conseguir uma resposta curativa ou durável. LMC representa um paradigma valioso para definir o conceito de medicina de precisão, mecanismos de mixomas, terapêutica racional alvo-dirigido, progressão da doença e resistência às drogas. No entanto, até hoje, o mecanismo de morte celular induzida por TKI de condução em células de câncer não é totalmente compreendido, nem por células MRD (compostas por células leucêmicas [LSCs]) são intrinsecamente resistentes a TKIs^4,6. Não obstante, o fenômeno de "dependência do oncogene" a oncoproteína quinase mutante está implicado na eficácia TKI onde a inibição aguda do oncogene orientada por TKIs provoca um choque oncogênicos que leva a uma resposta maciça proapoptotic ou quiescência na célula contexto-dependente^6,7,8,9. No entanto, a base mecanicista da dependência do oncogene é carente. Estudos recentes têm implicados que fator de crescimento de sinalização revoga a dependência do oncogene e, consequentemente, confere resistência à terapia TKI^10,11,12. Portanto, para obter conhecimento sobre o mecanismo da dependência do oncogene, realizamos a expressão do inteiro-genoma perfilação de BCR-ABL1 viciado e células nonaddicted (crescidas com fatores de crescimento), que revelaram que o c-Fos e Dusp1 são importantes mediadores da oncogene vício¹³. A exclusão genética de c-Fos e Dusp1 é letal para BCR-ABL1-expressando células e os ratos usados no experimento não desenvolveu leucemia. Além disso, a inibição de c-Fos e DUSP1 por inibidores de molécula pequena curado CML BCR ABL1-induzida em camundongos. Os resultados mostram que os níveis de expressão de c-Fos e Dusp1 definem o limiar de apoptose em células cancerosas, tal que os níveis mais baixos conferem sensibilidade de drogas enquanto que níveis mais elevados de causar resistência à terapia¹³.

Para identificar os genes dirigindo a dependência do oncogene, realizamos vários do inteiro-genoma expressão experimentos na presença de fator de crescimento e um TKI (imatinib) usando o mouse - e células de paciente-derivado de CML (K562) de criação de perfil. Estes dados foram analisados em paralelo com a CML pacientes conjuntos de dados obtidos de CD34⁺ células-tronco hematopoiéticas antes e após o tratamento com imatinib. Esta análise revelou três genes (um fator de transcrição [c-Fos], fosfatase dupla especificidade 1 [Dusp1] e uma RNA-proteína obrigatória [Zfp36]) que são comumente upregulated em células TKI-resistente. Para validar a importância destes genes em conferir resistência às drogas, realizamos análise in vitro e in vivo passo a passo. Os níveis de expressão destes genes foram confirmados por qPCR em tempo real (RT-qPCR) e mancha ocidental em células resistentes. Além disso, a superexpressão do cDNA e nocaute por grampos de shRNA de c-Fos, Dusp1, e Zfp36 revelou que elevado de c-Fos e Dusp1 expressões são suficientes e necessárias para conferir resistência TKI. Portanto, realizamos uma validação in vivo usando modelos do rato com o c-Fos e Dusp1 só. Para a validação genética de c-Fos e Dusp1, criamos ROSACreERT-inducible do c-Fos^fl/fl ratos (nocaute condicional)¹⁴ e cruzou-os com Dusp1^{- / -} (nocaute)¹⁵ tornar ROSACreERT2-c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} ratos transgénicos-duplo. Células de medula óssea-derivado de c-Kit⁺ (de c-Fos^fl/fl-, Dusp1^{- / -}- e c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) expressam BCR-ABL1 foram analisados em vitro em um ensaio de unidade (CFU) formadoras e em vivo por transplante de medula óssea em camundongos letalmente irradiados, para testar a exigência de c-Fos e Dusp1 sozinho ou em conjunto no desenvolvimento de leucemia. Do mesmo modo, as inibições químicas de c-Fos pela DFC (difluorinated curcumina)¹⁶ e Dusp1 pela BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ foram testados in vitro e in vivo usando BCR-ABL1-expressando, osso células da medula-derivado de c-Kit⁺ do mouse tipo selvagem (WT). Para confirmar a exigência de c-Fos e Dusp1 em células leucêmicas, utilizamos um modelo de mouse CML onde BCR-ABL1 foi especificamente induzida em suas células-tronco por doxiciclina (expressa Tet-liberada em células-tronco murino leucemia (SCL) gene 3' potenciador Regulamento)^18,19. Usamos a medula óssea Lin^–c-Kit de Sca⁺⁺ (LSK) células destes ratos em um ensaio in vivo de transplante. Além disso, estabelecemos níveis phopsho-p38 e a expressão de IL-6 como biomarcadores farmacodinâmicos para Dusp1 e inibição de c-Fos, respectivamente, na vivo. Finalmente, para estender o estudo para a relevância humana, derivado de paciente CD34⁺ as células (equivalente às células c-Kit⁺ de ratos) foram submetidas a longo prazo ensaios in vitro cultura-iniciando célula (LTCIC) e um modelo do rato humanizado em vivo CML^20,21. Os camundongos imunodeficientes foram transplantados com células CML CD34 +, seguidas de tratamento medicamentoso e análise de sobrevivência de células leucêmicas humanas.

Neste projecto, desenvolvemos métodos para a identificação do alvo e validações usando ferramentas de genéticas e químicas, usando diferentes modelos pré-clínicos. Estes métodos podem ser aplicados com sucesso para validar outros alvos, desenvolvendo modalidades químicas para o desenvolvimento de terapêutica.

Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes do cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) em Cincinnati infantil Hospital Medical Center (CCHMC). Espécimes humanos (BM Normal e que a partir de CML (p210-BCR-ABL +) Leucemia) foram obtidos através de protocolos aprovados institucional Review Board (Conselho de revisão institucional: Hospital Medical Center Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati infantil) e consentimento informado doador de CCHMC e da Universidade de Cincinnati.

1. em tempo real qPCR análise

1. Isole o RNA total de células BaF3, crescendo em RPMI suplementado com 10% FBS e 10% WEHI passado meio de cultura como fonte de interleucina-3 (IL-3).
2. Colher as células em fase logarítmica (99% vivo) de tratados (IL-3 e imatinib) bem como de amostras não tratadas e centrifugá-los a 435 x g durante 3 min. A saúde e os estágios de crescimento das células são críticos como seus perfis de expressão de gene podem mudar drasticamente.
3. Isole o RNA pela purificação de RNA total²². Quantificar o RNA total; em seguida, submetê-la a DNase tratamento²³. Converter quantidades iguais de RNA DNA-livre (2 µ g) de cDNA com transcriptase reversa²⁴.
4. Execute qPCRs com as primeiras demão gene-específico (tabela 1). Realizar PCRs em 20 reações µ l em 0,2 mL, paredes finas da polimerase com tampas ópticas, usando um polymerase 1x mistura (ver Tabela de materiais), 0,5 µM de cada primer, 1 µ l de DNA e água. Coloque a reação na thermocycler com o seguinte ciclo: etapa 1, 95 ° C por 10 min; Etapa 2, 95 ° C por 15 s; Passo 3 a 60 ° C, durante 1 min; Passo 4: Repita os passos 2-3 40 vezes. Executar todos os PCRs em triplica e normalizar os dados em tempo real para a expressão de β-actina antes de plotar.

2. mancha ocidental

Nota: Extratos de células inteiras foram preparados pela adição de 250 µ l de tampão de Lise 1x conforme descrito em Kesarwani et al.¹³ , complementada com um coquetel de inibidor de protease e inibidor da fosfatase 2 cocktail.

1. Colheita de 5 milhões de BaF3 de células em fase logarítmica (99% vivo) de tratados (IL-3 e imatinib) bem como de BaF3 não tratada, as células por centrifugação a 435 x g durante 3 minutos a 4 ° C. Lisar as células no buffer de lise (250 µ l) pipetando subindo e descendo 1 x, seguido de uma incubação de 5 min a 80 ° C. Proceda à sonicação o lisado para quebrar todo o ADN com 5-6 pulsos de 5 s cada uma em uma sala fria a 4 ° C.
2. Transfira o lisado para um tubo de 1,5 mL e centrifuga-lo a 16.000 x g por 5 min remover qualquer material insolúvel. O extrato pode ser armazenado a-80 ° C até o uso. Amostras de calor a 80 ° C por 5 min em um bloco de calor antes do carregamento. Carrega 10 µ l da amostra com uma ponta de gel de carregamento em gel de SDS-PAGE 10%.
3. Resolva as proteínas a 150 V, até que o corante de referência atinge a parte inferior do gel. Transferi a proteína para membranas de nitrocelulose por uma transferência eletroforética em 1 amp por 1h. Após a transferência, bloquear as membranas em 1x Tris salino + 0.1% Tween 20 (TBST) com leite desnatado de 5% para 1 h e sonda durante a noite a 4 ° C com os anticorpos adequados a uma diluição de 1:1,000.
4. Lave as membranas 3 x 5 x com TBST por 10 min cada; em seguida, sonda com um conjugado HRP apropriado anticorpo secundário (1:5, 000 diluição) à temperatura ambiente durante 1 h. A quantidade de TBST usado depende do tamanho do recipiente. Certifique-se de submergir a membrana em TBST completamente. Lave o anticorpo secundário 3 x por 5 min com TBST.
5. Desenvolva o blot usando reagente substrato quimioluminescente. Misturar volumes iguais do substrato e a reserva dos dois frascos, bem antes do uso. Adicione o substrato na parte superior da membrana para cobrir a membrana inteira com uma pipeta de 1 mL e incubar durante 1 min. As manchas devem ser fotografadas dentro de 1 a 10 min da adição do substrato.
6. Usando fórceps sem corte, coloque cuidadosamente a membrana sobre a plataforma do sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais), evitando muito do líquido. Selecionar uma exibição ao vivo e escolher no menu os borrões e chemiluminiscence. Usando o manual aquisição, adquira várias exposições em pontos diferentes do tempo. Esses arquivos podem ser visualizados e quantificados usando o software de imagem.

3. geração de camundongos Knockout

1. Cruz de c-Fos^fl/fl ratos com ROSACreERT2 ratos para gerar ROSACreERT2c-Fos^fl/fl ratos¹³. Para criar ratos duplo nocaute (KO), raça de ratos de^fl/fl ROSACreERT2c-Fos com Dusp1^{- / -} ratos para gerar ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} ratos¹³. Genótipo os ratos por clipes de cauda seguiram por PCR, conforme descrito abaixo.
2. Genotipagem:
   1. Para preparar o ADN, grampeie uma pequena porção da cauda com uma tesoura e coloque-o em um tubo de 1,5 mL. Cauterize o rabo com uma tesoura aquecida. Adicionar 200 µ l de NaOH de 50 mM para a cauda cortada no tubo e incubar a 95 ° C, em um bloco de calor por 1h.
   2. Bem o tubo de vórtice e, em seguida, neutralizar com a adição de 50 µ l de 1 M Tris HCl pH 6,8 e vórtice novamente. Centrifugar o tubo a velocidade máxima durante 1 min.
   3. Realizar PCRs em 20 µ l as reações em 0,2 mL, paredes finas da polimerase usando 1 x Taq polimerase mestre mistura contendo corante, 0,5 µM de cada primer, 1 µ l de DNA e água. Coloque os tubos no thermocycler e manter o ciclo apropriado, conforme mostrado na tabela 2.
   4. Execute o produto PCR em gel de agarose 2% e a imagem usando um sistema de documentação do gel.

4. isolamento de c-Kit⁺ células de medula óssea

1. Sacrifica os ratos de acordo com as normas institucionais.
   Nota: Aqui, os ratos foram expostos ao gás carbônico (CO₂) em um segundo para a AVMA recomendado caudal até morte foi determinada pela cessação da respiração e batimentos cardíacos, seguido por deslocamento cervical.
2. Colher a pernaossos do mouse — dois fêmures, duas tíbias, dois iliacs. Limpe todos os tecidos dos ossos por raspar com um bisturi. Coloque os ossos da perna no frio 1X PBS no gelo — 5 mL em um tubo de 15 mL. Despeje o conteúdo do tubo em um almofariz e esmagá-la com um pilão.
3. Filtre a suspensão através de um filtro de célula de 70 µm em um tubo de tampa de rosca de 50 mL com uma pipeta de 10 mL anexada, usando uma pipeta. Lave o pilão várias vezes com PBS 1x frio, coletando e adicionando suspensão de células para o tubo de 50 mL. Spin para baixo da medula óssea a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Retire o sobrenadante através de um vácuo com uma pipeta de vidro anexado. Suspenda o centrifugado em 5 mL de 1X PBS com uma pipeta.
4. Com uma pipeta, adicione lentamente suspenso da medula óssea para o top de 5 mL de temperatura (a temperatura é crítica) polysucrose, tomando muito cuidado para não perturbar a interface. Girar a 400 x g em temperatura ambiente por 20 min com o freio desligado.
5. Recolher a interface de células mono-nucleares total nublado (TMNC) com uma pipeta e colocá-lo em um novo tubo de 15 mL. Trazer o volume até 10 ml 1X PBS para lavar, tomar 20 µ l para a contagem e girar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante e salvar a pelota no gelo para etapa 4.6.1.
6. Executar c-Kit⁺ isolamento de célula.
   1. Siga um protocolo do kit de Microconta para o c-Kit⁺ isolamento de célula. Ressuspender as células em 80 µ l de PBS 1x + EDTA + BSA a 10⁷ células. À suspensão de células, adicione 20 µ l de CD117 MicroBeads/10⁷ células total. Misture bem por num Vortex e incubar durante 10 minutos a 4 ° C. Trazer o volume de 10 mL, adicionando 1X PBS + EDTA + BSA e girar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min.
   2. Remover o sobrenadante através de um vácuo e suspender o centrifugado em 500 µ l/10⁸ células total em EDTA + 1X PBS + BSA. Usando a base de ímã com a coluna magnética anexada, adicionar 3 mL de 1X PBS + EDTA + BSA e deixe-a fluir através de gravidade em um tubo de coleta de 15 mL.
   3. Uma vez a primeira adição de tampão terminou passando através da coluna, adicione a suspensão de células para a coluna, permitindo que flua através de gravidade para o tubo de coleta de 15 mL. Este flowthrough é a fração de células indesejáveis.
   4. Lave a coluna 3 vezes com EDTA + 3 mL 1X PBS + BSA cada vez, permitindo que flua através de gravidade para o tubo de coleta. Remova a coluna o ímã e coloque em cima de um tubo de 15 mL.
   5. Adicionar 5 mL de 1X PBS + EDTA + BSA e imediatamente nivelá-lo com o êmbolo fornecido com a coluna. Remover o êmbolo e repita o flush com um adicional 5 mL de 1X PBS + EDTA + BSA. Conte as células no volume total usando métodos padrão.
   6. Gire para baixo as células a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Retire o sobrenadante e resuspenda o pellet em IMDM completa (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + ligante FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) para a cultura. Cultura que dessas células durante a noite em 2 x 10⁶ células/1 mL de mídia completa de célula IMDM, colocando-os em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂.

5. transdução

1. Transfeccao Plasmideo retroviral
   1. Na hora descongelar células HEK293 à tarde antes de um banho de água situada a 37 ° C. Girar o criotubo contendo as células HEK a 435 x g em temperatura ambiente por 3 min. Retire o sobrenadante através de um vácuo e suspender o centrifugado em 1 mL de DMEM suplementado com 10% FBS, penicilina, estreptomicina e glutamina.
   2. Contar as células e adicionar o volume apropriado para um prato de 10 cm Tratado (~ 4 x 10⁶ HEK293T células). Adicionar 14 mL de DMEM 10 mídia ao prato e misture bem por deslizando para cima e para baixo para uma distribuição igual. Coloque o prato em um 37 ° C, 5% CO₂ incubadora durante a noite.
   3. Na manhã seguinte, verifique a confluência das células sob um microscópio invertido (50% ou mais funcionam bem).
   4. Combinar o DNA (plasmídeo retroviral desejado), PclEco (plasmídeo de embalagem), 2 M CaCl₂e H₂0 em um tubo de 1,5 mL (= 500 µ l) utilizando uma micropipeta nas seguintes quantidades: 7,5 µ g de DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 µ g de pCLeco, µ l 62 de 2 M CaCl₂ e água até um volume final de 500 µ l. adicionar 500 µ l de 2 x HBS para outro tubo de 1,5 mL.
   5. Adicione o DNA misturar gota a gota ao tubo de 1,5 mL contendo 500 µ l de 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES e 1,5 mM Na₂HPO₄) enquanto mistura. Alcançar este objectivo, definindo um vórtice para a velocidade mais baixa e segure o tubo HBS pela constante ao mesmo tempo adicionando a mistura de transfeccao.
   6. Permita a mistura de transfeccao incubar durante 20 a 30 min à temperatura ambiente. Durante a incubação, adicionar 25 cloroquina nM às células HEK e colocá-los de volta na incubadora. Após a incubação, adicione a mistura de transfeccao gota a gota para as células HEK e, em seguida, agitar levemente a mídia para misturar a mistura de transfeccao em toda a placa.
   7. Incube as células com o mix para ~ 8 h em uma 37 ° C, 5% CO₂ incubadora. Altere a mídia nessas células muito lentamente adicionando 14 mL de fresco DMEM 10 mídia. Pipetagem lentamente contra a parede do prato ajuda a impedir qualquer remoção das células HEK. Incube a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora as células durante a noite.
   8. Recolher o sobrenadante viral com uma seringa de 10 mL, desenhar o sobrenadante para a seringa e anexar o filtro de seringa de 0,45 µm. Mergulhe o sobrenadante viral em um novo tubo de coleta. Pegue a primeira coleção de sobrenadante viral ~ 16 h mais tarde.
2. Transdução e fibronectina concentração viral
   1. Adicione 2 mL de um fragmento de fibronectina humana recombinante de 0,1 mg de 1X PBS para placas não tratada 6-poço de cultura. Prepare-se tanto fibronectina conforme necessário, que depende do número de células e de genótipos. Um bem pode suficientemente transduce 10 milhões de células de c-Kit⁺ . Incubar a placa durante a noite a 4 ° C.
   2. No dia seguinte, retire a fibronectina dos poços, com uma pipeta pipeta 2 mL de estéril 2% BSA em 1X PBS para bloquear a placa e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Retire a BSA através de um vácuo e lavar cuidadosamente por pipetagem 2 mL de 1X PBS, em seguida, removê-lo através de um vácuo.
   3. Imediatamente adicione recém coletados e filtrada (em 0,45 µm) viral sobrenadante até 5 mL. Centrifugar a 435 x g a 32 ° C por 2 h. Retire o sobrenadante através de um vácuo e repita este passo com adicional recém coletado sobrenadante viral e girar novamente. Remover o sobrenadante através de um vácuo e lavar os poços, adicionando 2 mL de 1X PBS; em seguida, removê-lo através de um vácuo.
   4. Adicione que o mouse c-Kit⁺ células que foram cultivada durante a noite (passo 4.6.6) aos Poços revestidos virais por misturar as suspensões celulares bem e pipetagem-los na placa de fibronectina concentrado viral agora. Girar a 1.200 x g a 25 ° C, durante 90 min. colocar as células em um 37 ° C, 5% CO₂ incubadora.
   5. posttransduction de 48 h, as células de pelotas por centrifugação a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min e ressuspendê-los no buffer de FACS #1 (1X PBS + 0,5% BSA) para 6 x 10⁶/mL. Determine a porcentagem de células positivas BCR-ABL1 medindo a porcentagem de YFP positivo usando citometria de fluxo.
   6. Adquira os eventos com o procedimento padrão. Primeiro, portão as células vivas, com base na dispersão de frente e lateral. Em seguida, portão as células ao vivo positivas YFP, excluindo a YFP-negativecells determinado pelo controlo negativo (Figura 4).

6. formadoras UnitAssays

1. Descongele o metilcelulose com citocinas para mouse em temperatura ambiente por 1 – 2 h. alíquota 3 mL de metilcelulose em um tubo de FACS, usando uma seringa de 5 mL, sem agulha. Classificar as células YFP-positivo em um classificador de pilha.
2. Girar as células abaixo e suspender o sedimento na mídia completa IMDM. Conte as células para ser banhado e diluí-los para obter 5.000 células YFP-positivo em 100 µ l de mídia completa IMDM.
3. Adicione 100 µ l de suspensão de células contendo 5.000 células YFP-positivo e os inibidores apropriados para 3 mL de metilcelulose (ver Tabela de materiais). Vórtice na alta misturá-la por 10 a 30 s.
4. Depois que a maioria do ar bolhas escaparam, use uma seringa de 1 mL para a placa de 1 mL de mídia em três placas de 3cm replicar por ejetar a mídia de um lado e lentamente inclinando a placa em movimentos circulares para espalhar uniformemente.
5. A concentração final dos inibidores usar são imatinib em 3 µM, DFC em 0,2 µM e BCI em 0,5 µM, sozinhos ou em combinações. Sempre que possível, exclua c-Fos chapeamento as células com 4-hydroxytamoxifen (1 µ g/mL) adicionado para a metilcelulose.
6. Depois de chapeamento, coloque as placas em uma grande placa de Petri com um prato aberto contendo 2 mL de água estéril no meio. Cubra o prato de Petri grande e cuidadosamente incubar a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora. Recorde os números de colônia após uma semana de chapeamento pela contagem do número total de colônias sob um microscópio.
7. Analise algumas colónias de placas adequadas para exclusão de c-Fos pelo PCR. Recolha as colônias sugando-os com uma ponta de P1000. Desalojar as células em 500 µ l de PBS 1x lavando a ponta na PBS várias vezes. Girar as suspensões celulares a 6.000 x g por 1 min e extrair o DNA do centrifugado usando um kit de isolamento de DNA genômico.
8. Usar o DNA genômico por PCR utilizando os iniciadores mFos-FP3 e mFos-RP5, conforme descrito na tabela 2. Analise os produtos PCR em um gel de agarose 2% e a imagem usando um sistema de documentação do gel.
9. Para uma apresentação gráfica das colônias, mancha das colônias, usando cloreto de Iodonitrotetrazolium. Dissolva 10 mg de cloreto de Iodonitrotetrazolium, em 10 mL de água para obter uma solução de 1 mg/mL. Filtro de esterilizar a solução usando um conector Luer-lock com um filtro de µm 0.2 anexado a uma seringa de 10 mL em condições estéreis de um capuz de cultura de tecidos.
10. O capuz de cultura de tecidos, adicionar 100 µ l de solução de coloração gota a gota ao redor da placa CFU; tenha cuidado para não escorregar ou perturbar colônias. Incube as placas durante a noite em um 37 ° C, 5% CO₂ incubadora de cultura celular. As colônias girará marrom avermelhado escuro. Usando um fundo branco do bairro de cultura de tecidos estéreis, tire fotos da placa CFU manchada.

7. transplante e ensaio de mortalidade

1. Letalmente irradiar os ratos com radiação divisão usando um baseado em Cs 137 Gamma-ray a uma dosagem de 7.0 Gy seguido por 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h separado antes do transplante.
2. Transplante de 4 x 10⁴ seleccionadas YFP-positivo (calculado com base na porcentagem de YFP) células com 3 x 10⁵ células normais da medula óssea como um portador para cada rato pela cauda veia injeção.
3. Após uma semana de transplante, determine a enxertia através da análise de células do sangue periférico utilizando FACS YFP-positivo.
4. Realize uma análise de FACS e sangramento de veia de cauda.
   1. Aquecer a gaiola de ratos sob uma lâmpada de calor com cuidado para não superaquecer ou queimá-los.
   2. Nick a veia da cauda com uma lâmina estéril e conter um rato em uma retenção de rato. Leite delicadamente a cauda do anterior posterior, permitindo que uma gota de sangue se acumule. Coletar o sangue com um tubo capilar heparinizado até está cheio (coletar em torno de 75-100 µ l). Mergulhe o sangue do tubo capilar cheio de um tubo de colheita de sangue contendo EDTA e misture bem.
   3. Lise as hemácias adicionando 30 – 40 µ l de sangue a 3 mL de tampão de lise de RBC 1x (150 mM cloreto de amônio, bicarbonato de potássio de 10 mM e 0,13 mM EDTA). Misture bem, invertendo o tubo várias vezes. Incube a temperatura ambiente por 10 a 15 min. Spin a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Retire o sobrenadante através de um vácuo e suspender o sedimento em 2 mL de 1X PBS para lavar.
   4. Girar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Retire o sobrenadante e suspendê-lo no buffer de FACS #1. Realizar análise de FACS conforme descrito acima, no passo 5.2.5–5.2.66. Loja a curto prazo o sangue restante no tubo de coleta, que pode ser usado para várias outras finalidades, a 4 ° C.
5. Utilizaram-se ratos transplantados que mostraram 10 – 40% YFP-positivo células no sangue periférico para o experimento. Ratos que tinham menos de 2% de células positivas YFP foram excluídos do estudo.
6. Preparar o tamoxifeno 20 mg/ml de óleo de milho a 60 ° C, com utilização do Vortex intermitente até dissolver completamente e armazená-lo em 4 ° C, no escuro, para a duração do tratamento. Após uma semana de transplante, excluir o alelo de c-Fos^fl/fl injetando tamoxifeno (100 mg/kg no óleo de milho) intraperitonealmente (i.p.) nos ratos, todos os dias durante três dias consecutivos. É importante que os ratos são pesados para determinar quanto o tamoxifeno para injetar. Após o tratamento do tamoxifeno (se necessário), os ratos para tratamentos com drogas do grupo (n = 5/grupo).
7. Monitorar os ratos para leucemia progressão e sobrevivência e determinar o fardo leucêmicas (células YFP-positivo pela FACS) semanal de até oito semanas em ratos de sobreviver.
8. Analise o sangue para exclusão de c-Fos sempre que apropriado, conforme descrito acima na seção 6. Registrar o número de ratos sobreviventes, todos os dias e traçar a curva de sobrevivência ao final do experimento usando um software gráfico.

8. transgénica dos ratos modelo de leucemia BCR-ABL1

1. Isolamento de LSK
   1. Manter os ratos transgénicos Scl-tTA na comida de doxiciclina para evitar uma expressão de BCR-ABL1. Quatro semanas antes do transplante, leve os ratos fora a doxiciclina chow para BCR-ABL1 expressão.
   2. Isole o TMNCs de ratos transgénicos Scl-tTA conforme descrito acima na seção 4. Suspenda os TMNCs no buffer de FACS #2 (1X PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) para obter 10⁶ células/mL.
   3. Empobrecem as TMNCs para as células de linhagem positiva adicionando 10 µ l de linhagem celular deteção cocktail biotina (conjugado biotina de anticorpos monoclonais contra CD5 [rato IgG2a], CD11b [rato IgG2a], CD45R [B220] [rato IgG2a], Anti-7-4 [rato IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rato IgG2a] e Anti-Ter-119 [rat IgG2b]) por 1 x 10⁶ células. Incube as células a 4 ° C por 10 min no escuro, seguido por uma lavagem com 5 mL de tampão de FACS #2 e girar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Aspire o sobrenadante completamente e suspender as células em 400 µ l de tampão de FACS #2.
   4. Adicione 5 µ l de conjugado antianticorpo biotina-FITC, 1,2 µ l de PECy7 Ly-6A/E (Sca1) e 2,4 µ l de anticorpos APC CD117 (c-Kit) para até 10⁸ milhões de células. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min. Lave, trazendo o volume até 5 mL com tampão de FACS #2; em seguida, centrifugar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Retire o sobrenadante e suspender o centrifugado em 500 µ l de tampão de FACS #2.
   5. Filtre a suspensão de células para um tubo de FACS filtro azul-cap.
   6. Células vivas de portão usando a dispersão para a frente e lateral. Em seguida, selecione as células lin^– que mostrou IFM (significa intensidade de fluorescência de menos de 10²) obter LSK células c-Kit⁺ e Sca1⁺ em um biexponential plot do pai Lin^– e classificá-los (Figura 7 C).
   7. Coletar as células classificadas e centrifugá-los a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min.
2. Transplante de
   1. Letalmente irradiar os ratos de BoyJ com uma dose de radiação de divisão de 7.0 Gy seguido por 4,75 Gy após 3 h, antes do transplante.
   2. Injecte 3 x 10³ a 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK células com 0.3 x 10⁶ células de medula óssea de auxiliar de camundongos WT BoyJ através da veia da cauda (i.v.) os ratos BoyJ irradiados.
   3. Posttransplantation de quatro semanas, analisar os destinatários ratos para CD45.1 e CD45.2. Obter o TMNC do sangue periférico por cauda veia sangrando conforme descrito na etapa 7,4. Ressuspender as células em 100 µ l de tampão de FACS. Incube as celulas com 1 ml de anticorpo CD45.1-FITC e CD45.2-PE à temperatura ambiente durante 1 h.
   4. Lavar as células trazendo o volume de 3 mL com tampão de FACS e girar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspendê-lo em 200 µ l de 1X PBS.
   5. Analise a porcentagem na CD45.1 e CD45.2 pelo primeiro canal as células vivas, com base na dispersão para a frente e lateral, seguido por retenção de células FITC e PE-positivo com base na amostra imaculada.
   6. Os ratos do grupo em quatro grupos (n = 6 por grupo). Iniciar o tratamento com imatinib (75 mg/kg 2 x diariamente) em paz e em combinação com a DFC + BCI (ambas as drogas foram dadas na dose de 10 mg/kg 2 x diariamente).
   7. Tratar da mesma forma, outros grupos com combinações de imatinib (75 mg/kg) curcumina (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) e imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) por três meses, 2x por dia, por injetado i.p.
   8. Analisar os ratos 1 x por mês durante seis meses para leucêmicas quimerismo por determinação da percentagem de CD45.2 positiva de células no sangue periférico por cauda da veia sangrando conforme descrito na etapa 7,4.

9. na avaliação de Vivo do BCI e DFC atividade

1. Análise de fosfo-p38
   1. Tome três ratos leucêmicas (8-12 semanas de idade) que foram transplantados com células de c-Kit⁺ BCR-ABL1-expressando, conforme descrito na seção 7. Injete os ratos com BCI (10 mg/kg) pela injeção i.p. quatro semanas pós-transplante.
   2. Medir os níveis de sangue periférico phospho-p38 TMNC usando o kit de citometria de fluxo de fosforilação de acordo com as instruções do fornecedor. Colete o sangue de cada rato antes e 6 h após a injeção de drogas. Isolar os TMNCs pela depleção de RBC e corrigi-los da seguinte maneira.
   3. Adicione 4 mL de solução de Lise RBC por 100 µ l de sangue periférico. Misturar e incubar no gelo por 5 min lisar as hemácias. Spin-down as células a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Repita a Lise 1 x mais.
   4. Após a segunda etapa de Lise, lave as pelotas de célula com 1 mL de BSA de 2% em PBS. Corrigir as células, adicionando-se 100 µ l de soluções de fixação e permeabilização e incube por 20 min a 4 ° C, no escuro. A célula de pelotas por centrifugação a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C.
   5. Lave as bolinhas com 1 mL de 1 x lavagem de permeabilização. Bloquear as células adicionando 300 µ l de BSA de 2% em tampão de lavagem permeabilização à temperatura ambiente por 20 min. dividir as células em três iguais alíquotas de 100 µ l (~ 1 x10⁶).
   6. Para cada alíquota de células fixas adicionar 1 µ l de anticorpo p-38 total, 1 µ l de Anticorpos fosfo-p38 ou 1 µ l de isotipo IgG controle, respectivamente e incubar durante a noite a 4 ° C.
   7. Lavar as células 1 x 5 ml de BSA de 2% em PBS e incubar com anticorpo secundário (1 µ l de conjugado Alexa Fluor-488) por 1h à temperatura ambiente. Lavar as células 1 x novamente e suspendê-los em 200 µ l de PBS 1x.
   8. Adquirir os dados por FACS e analisá-los pelo software de análise de citometria de fluxo.
   9. Deduza o IFM de controlo IgG do IFM das amostras experimentais. Os valores de IFM de fosfo-p38 então são normalizados para o de total p-38 para determinar os níveis de fosfo-p38 após a injeção do BCI.
2. Análise de expressão genética quantitativa de genes alvo de c-Fos
   1. Tome três ratos leucêmicas (8-12 semanas de idade), que foram transplantados com células de c-Kit⁺ BCR-ABL1-expressando conforme descrito na seção 7. Coletar sangue periférico de cada mouse e em seguida, injetar os ratos com 10 mg/kg cada de DFC + BCI.
   2. Colete sangue periférico 6 h após a injeção de drogas. Isole o TMNCs pela depleção de RBC, conforme descrito acima. Os TMNCs de pelotas e suspendê-las em um tampão de lise de fenol-base (veja Tabela de materiais).
   3. Realizar análise de RT-qPCR (conforme descrito na seção 1) para Bcl2l11, Lif e IL-6, usando as primeiras demão gene-específico (mostradas na tabela 1).

10. a longo prazo ensaio iniciando a cultura de células

Nota: Um ensaio LTCIC foi realizado conforme descrito anteriormente,²⁵.

1. Cresce uma linhagem de células de fibroblasto do rato MS-5 em MEMα a confluência em um frasco de cultura de tecidos T175. Trypsinize as células conforme descrito acima para HEK293T. Suspenda as células em MEMα a 2 x 10⁶ células/mL. Pegue 10 x 10⁶ células em um tubo cónico de 50 mL e irradiar em 80 Gy. Dilua as células de 0,5 x 10⁶ células/mL em MEMα suplementado com 10% FBS (M10) meios de comunicação. Placa de 2 mL por bem em uma placa de 12 e faça a incubação a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora durante a noite.
2. No dia seguinte, prepare o hemisuccinate de sódio de hidrocortisona pela dissolução de 2,5 mg em 5 mL de MEMα (solução 1 M). Filtro-esterilize a solução de hidrocortisona usando um filtro de seringa 0,2 µm no capô de biossegurança. Dilua a hidrocortisona de diluição serial em MEM para obter uma solução de 100 µM. Adicionar 250 µ l de isto para 25 mL de meio de cultura a longo prazo humano (HLTM) (ver Tabela de materiais) apenas antes de usar, para obter uma concentração final de 1 µM.
3. Spin para baixo a CML-CD34⁺ e UCP3 TMNCs e suspendê-las em HLTM o breve vortexing e determinar as contagens por um hemocytometer.
4. De vácuo fora da mídia M10 da chapa 12-bem semeada com células do estroma e substituí-lo com a 1 mL de células doentes (CML-CD34⁺ [10.000] e UCP3 TMNCs [1 x 10⁶]) suspensão em HLTM. Use três poços por combinação de drogas por tipo de célula.
5. Dilua os estoques de drogas para 2x da concentração exigida em HLTM. Adicione 1 mL da mídia com drogas para as células acima mencionadas para obter uma concentração de fármaco de 1x. Substitua metade da mídia recentemente preparada HLTM toda semana durante cinco semanas.
6. No final do período de ensaio LTC-IC de seis semanas, colete de células em um tubo de culturas. Trypsinize células aderentes e combiná-los com as células de correspondentes.
7. Lavar as células e ensaio para CFUs em metilcelulose médio com 30% de vitela fetal soro, eritropoietina (3 unidades/mL), SF (50 ng/mL) e IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) e fator estimulante de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) (20 ng / mL). determinar as contagens por um hemocytometer.
8. Placa de 5 x 10⁴ células em três repetições. Congele as células restantes em 20% FBS e 10% de DMSO em baixo. Organize as placas em uma grande placa de Petri com um prato aberto contendo água no meio. Cubra o prato de Petri a grande cuidadosamente e incube-lo em um 37 ° C, 5% CO₂ incubadora durante duas semanas.
9. Marca as colônias duas semanas mais tarde. Em alguns casos, apenas uma parte da colheita é analisada para CFUs). Calcule que o número total de LTCIC presente na suspensão de célula inicial extrapolando baseia os CFUs obtidos de parte da safra de célula. A produção média de UFC por LTC-IC é 8.
   Nota: Por exemplo, se inicialmente 1 x 10⁶ células foram banhadas em um poço, após cinco semanas, 0,5 x 10⁶ células foram colhidas e para o UFC, 5 x 10⁴ células foram chapeadas e 50 CFUs foram obtidos. Isto equivale a CFUs/1 500 milhões de células de chapeado. Divida este número por 8 para obter o LTCIC, que é de 62,5.

11. humanizado Mouse modelo usando CML CD34 células⁺

1. Sublethally irradiar os 8 ratos week-old NOD scid gama, expressando humano IL3, GM-CSF e SCF (NSGS), com uma dose única de 7.0 Gy (700 rads) com 50 rads/min.
2. Injectar 3 x 10⁶ CD34⁺ selecionado células de pacientes com fase crônica LMC BCR-ABL1-positivo para os ratos irradiados por injeção intravenosa.
3. Duas semanas depois do transplante, determine enxertia leucêmicas na medula óssea por FACS usando anticorpos específicos de rato e humanos contra CD45.
4. Realizar uma análise de FACS.
   1. Leve o aspirado de medula óssea de fêmures de ratos transplantados. Lisar hemácias usando tampão de Lise RBC conforme descrito acima e recolher os TMNCs por centrifugação. Lave o pellet 1 x com frio 1X PBS.
   2. Bloquear as células com humano FcR bloco e bloco de FcR rato seguido pela coloração com anti-humanos CD45 FITC e anti-rato CD45 APC^Cy7 durante a noite a 4 ° C. Realizar a análise de FACS na LSRII e analisar os dados usando o software de análise de citometria de fluxo.
5. Agrupar os ratos em quatro diferentes coortes (n = 6/grupo) para o tratamento com o veículo, imatinib (75 mg/kg), DFC BCI (ambos em 10 mg/kg), ou imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (ambos em 10 mg/kg). Diluir as drogas ações em 1X PBS (veículo) e administrá-los por injetá-las i.p. 2 x diariamente.
6. Tratar os ratos por seis semanas e determinar a carga leucêmicas cada duas semanas, até a semana oito anos após o transplante, como descrito acima em 11,4.

Resultados

Vício do oncogene tem sido implicado na eficácia terapêutica dos TKIs. No entanto, os mecanismos de condução a dependência do oncogene não são compreendidos. Foram realizadas várias análises de expressão de gene imparcial para identificar o componente genético envolvido em orquestrar o vício. Essas análises revelaram o upregulation de três genes, c-Fos, Dusp1 e Zfp36, em células de câncer que não são dependentes oncogênica sinalizando para a sobrevivência e, assim, s?...

Discussão

Para a maior parte das células cancerosas, a resposta terapêutica para TKI é mediada por um bloqueio de tirosina-quinase-oncoproteína sinais de que o tumor é viciado. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre como uma minoria das células cancerosas, contribuindo para MRD escape o oncogene dependência e terapia⁴. Estudos recentes revelaram que a sinalização de fator de crescimento Medeia resistência a drogas em leucemia e tumores de órgãos sólidos. Isto sugere que vários meca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati