JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Erratum Notice
  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Erratum
  • Reimpressões e Permissões

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Resumo

O9-1 é uma linhagem de células multipotentes rato crista neural. Aqui descrevemos protocolos passo a passo detalhados para cultivo de células O9-1, diferenciar células O9-1 em tipos de células específicas e manipulando geneticamente células O9-1 usando mediada por siRNA nocaute ou CRISPR-Cas9 edição do genoma.

Resumo

Células da crista neural (CNCC) estão migrando de células tronco que podem se diferenciar em diferentes tipos de células e dar origem a vários tecidos e órgãos. A linha de celular O9-1 é derivada o endógeno CNCC embrionárias de rato e mantém a sua multipotency. No entanto, em condições de cultura específica, O9-1 células podem se diferenciar em diferentes tipos de células e ser utilizadas em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. Recentemente, com a combinação de estudos de rato e de células O9-1, mostramos que o hipopótamo efetores da via de sinalização Yap e Taz desempenham importantes funções no desenvolvimento craniofacial crista neural-derivado. Embora o processo de cultivo de células O9-1 é mais complicado do que o utilizado para outras linhas de célula, a linha de celular O9-1 é um poderoso modelo para investigar a CNCC em vitro. Aqui, apresentamos um protocolo para a linha de celular O9-1 para manter a sua stemness, bem como protocolos para diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células, como células de músculo liso e osteoblastos de cultivo. Além disso, os protocolos são descritos para a realização de estudos de perda-de-função do gene em células O9-1 usando CRISPR-Cas9 exclusão e pequena interferência mediada por RNA "knockdown".

Introdução

Crista neural (CNCC) são células estaminais, como com uma notável capacidade migratória e transitória existência durante o desenvolvimento embrionário. CNCC originam entre o ectoderma superficial e o tubo neural e migra para outras partes do embrião durante o desenvolvimento embrionário1. Com base em seus domínios funcionais, CNCC pode ser classificados em vários tipos diferentes, incluindo crânio, tronco, vagal, sacral e cardíaca CNCC. Além disso, a CNCC pode se diferenciar em várias linhagens de células, como células musculares lisas, células ósseas e neurônios e dar origem a vários tecidos2,3. O desenvolvimento da CNCC caracteriza-se por uma série complexa de eventos morfogenéticas que são ajustados por vários sinais moleculares. Tendo em conta o Regulamento complexo do CNCC e suas importantes contribuições para numerosas estruturas, o dysregulation do desenvolvimento do NCC comumente pode originar defeitos congênitos do nascimento, que respondem por cerca de 30% de todos os defeitos congênitos humanos do nascimento. Anomalias durante o desenvolvimento da crista neural podem levar a fissura lábio/palato, defeito defeitos de formação do nariz, síndromes, tais como um tracto de saída cardíaca defeituosa do, ou até mesmo mortalidade1,4,5, 6 , 7. compreender os mecanismos moleculares do desenvolvimento do NCC é importante para o desenvolvimento de tratamentos para doenças causadas por defeitos no desenvolvimento do NCC. Com o uso de vários in vitro e in vivo se aproxima de8,9,10,11,12,13,14 ,15, consideráveis progressos na investigação do NCC. In vivo, modelos animais, incluindo galinhas, anfíbios, peixe-zebra e ratos, têm sido utilizados para investigar a CNCC1. Além disso, os embriões humanos têm sido utilizados para estudar o processo de migração do NCC em início de desenvolvimento de embrião humano16. In vitro, modelos de celular para CNCC, tais como CNCC humana que originou-se paciente da gordura subcutânea, têm sido utilizados para investigar a doença de Parkinson17. Linha O9-1 NCC, que foi originalmente derivada de culturas em massa da CNCC endógenas isoladas de 8.5 de embriões de rato18, é um modelo de célula poderoso para estudar CNCC. importante, em condições não-diferenciação de cultura, são células O9-1 multipotentes haste-como CNCC. No entanto, sob condições variáveis de cultura, células O9-1 podem ser diferenciadas em tipos celulares distintos, tais como células musculares lisas, osteoblastos, condrócitos e células gliais18. Devido a essas propriedades, O9-1 células têm sido amplamente utilizadas para estudos relacionados ao NCC, como investigar o mecanismo molecular de defeitos crânio-facial19,20.

Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para manter células O9-1, diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células e manipulando células O9-1 através da realização de estudos de perda--função do gene com edição de genoma CRISPR-Cas9 e RNA de interferência pequeno (siRNA)- mediada por tecnologias "knockdown". Como um exemplo representativo, é descrito o uso de células-O9-1 para estudar Yap e Taz perda de função. Yap e Taz são os efetores a jusante do hipopótamo sinalizando a via, que desempenha um papel crítico na proliferação celular, diferenciação e apoptose. O caminho de Hippo também foi mostrado para ser importante no desenvolvimento e na homeostase de diversos diferentes tecidos e órgãos, bem como na patogênese de doenças diferentes20,21,22,23 ,24,25,26,,27,28. Os principais componentes de hipopótamo sinalização incluem os tumor supressor estéril 20-como quinases Mst1/2, proteína que contém o domínio WW do andaime Salvador e as quinases de homólogo (Lats1/2) de supressor de tumor grande. Sinalização de hipopótamo inibe a atividade de Yap e Taz e promove sua degradação no citoplasma. Sem repressão do hipopótamo, Yap e Taz podem translocar em núcleos e funcionar como co-ativadores transcricionais. Recentemente mostramos que especificamente inactivar o hipopótamo sinalização efetores Yap e Taz no mouse CNCC usando o Wnt1cre e Wnt1Cre2SOR motoristas resultaram na letalidade embrionária em E10.5 com graves defeitos craniofaciais20. Também Efetuamos estudos utilizando células O9-1 para investigar o papel de Yap e Taz em CNCC. Para estudar a função Yap e Taz no NCC proliferação e diferenciação, Yap e o Taz knockdown células foram geradas nas células O9-1 usando siRNA, e células de nocaute de Yap foram geradas usando CRISPR-Cas9 edição do genoma. As mesmas estratégias de perda de função do gene podem ser aplicadas a genes-alvo diferente em outras vias. Além disso, ganho-de-função estudos e ensaios de transfeccao também podem ser aplicados às células de O9-1 para estudar a regulação e a função dos genes. Os protocolos descritos aqui destinam-se a ser utilizado por investigadores como guias para cultivo de células O9-1 para manter stemness multipotentes, para diferenciar O9-1 células em outros tipos de células sob condições de cultura diferente e para estudar a função dos genes e os mecanismos moleculares da CNCC.

Protocolo

1. preparação antes da cultura de pilha O9-1

Nota: Mídia Basal usada para cultura de células O9-1 deve fomos condicionadas por Sandos pura ratos tioguanina/Ouabaína-resistente (STO) pilhas do rato dos fibroblastos; Portanto, as células STO precisam ser obtidos e preparados conforme descrito abaixo, antes de iniciar a cultura de pilha O9-1.

  1. Cultura de célula activa STO
    1. Preparar a mídia para cultivo de células ativas de STO, fazendo de Dulbecco completa modificado mídia da águia (DMEM) com 7% de soro fetal bovino (FBS) (grau de cultura de células-tronco embrionárias), 100 U/mL penicilina, 100 µ g/mL Estreptomicina e 2 mM L-glutamina (concentrações finais são indicadas).
      Nota: STO meio é usado para o cultivo de células ativas de alimentador STO. Penicilina, estreptomicina e L-glutamina podem formar precipitação em armazém; Dissolva completamente pipetando antes do uso.
    2. Revesti uma placa de cultura de células de padrão 100 mm com gelatina de 0,1% por 30 min à temperatura ambiente. Após o período de incubação, Aspire a gelatina extra. Use a placa imediatamente após o revestimento.
      Nota: Alternativamente, cubra o prato com mídia STO e deixar a placa em uma incubadora umidificada para evitar a secagem da placa (isto é somente para armazenamento a curto prazo e não para armazenar placas pré-revestidos).
    3. Descongelar as células STO rapidamente em banho-maria a 37 ° C; limpar o cryovial com etanol a 70% antes da abertura e transfira imediatamente o frasco inteiro de células para um tubo de centrífuga.
    4. Adicionar mídia STO gota a gota para o tubo de centrifugação; a proporção do volume das células da mídia é 01:10.
    5. Centrifugar as células a 180 x g por 3 min em RT
    6. Misture por células suaves de pipetagem e transferência para a placa de gelatina-revestido.
    7. Permitir que as células STO a crescer durante 24h em uma incubadora padrão (37 ° C, 5% CO2).
    8. Mudar o meio (somente após as células aderem) 24 h após a semeadura e descarte o meio velho.
    9. Verifique as células STO cada dia sob um microscópio e passagem livre na confluência de 80%.
      1. Antes de iniciar a passagem de células STO, revestir as placas com 0.1% de gelatina (volume de gelatina é igual a metade do volume de meios de crescimento para esse navio) por 30 min à temperatura ambiente.
      2. Para passagem de células STO, Aspire meios de crescimento e lavam-se duas células com tampão fosfato salino (PBS) (adicionar PBS em um volume igual de mídia de crescimento).
      3. Aspire PBS e adicionar 0,25% do trypsin-EDTA (ajustar volume de acordo com o tamanho do navio); em seguida, incube a 37 ° C por 5 min.
        Nota: Para uma placa de 100mm, use 10 mL de mídia de crescimento e 3 mL de solução de tripsina. Para uma placa de 150 mm, use 20 mL de mídia de crescimento e 8 mL de solução de tripsina. O volume de tampão de lavagem usado é igual ao volume da mídia de crescimento.
      4. Inactivar tripsina com igual volume de mídia STO. Células STO de semente para novas placas com um rácio de 1:3 a 01:10.
        Nota: Um esquema comum em expansão é para expandir a partir de um cryovial em uma placa de 100 mm, depois de uma placa de 150 mm, depois de quatro placas de 150mm e finalmente para 16 placas de 150mm.
  2. Inativação e congelamento de células STO
    1. Para preparar 2 x mídia a congelar, adicione o seguinte ao mídia STO (concentrações finais são indicadas): 20% FBS, 20% dimetilsulfóxido (DMSO).
    2. Após a mistura, filtro esterilizar o 2x congelando mídia (poros tamanho 0,22 µm) e armazená-lo em 4 ° C até o uso. Fazer 2 x congelamento mídia no mesmo dia de usar e descartar mídia congelamento não utilizadas.
    3. Prepare a solução de mitomicina C em PBS em uma concentração de 0,5 mg/mL. Para dissolver mitomicina C em PBS, tape a garrafa em um reaccional e vórtice em uma baixa definição por aproximadamente 45 min para dissolver as partículas completamente.
      Nota: Mitomicina C é luz sensível e difícil de dissolver.
      Cuidado: Mitomicina C é extremamente tóxica e pode causar câncer. Lidar apenas com equipamento de proteção pessoal apropriado.
    4. Inativar as células STO adicionando uma concentração final de mitomicina 0,01 mg/mL C aos meios de comunicação existentes. Incube durante 2h dentro de uma padrão incubadora (37 ° C, 5% CO2).
    5. Lave as placas (150 mm) com 20 mL de PBS duas vezes após inativação com mitomicina C.
    6. Aspirar a solução de PBS, dissociar as células usando 8 mL de 0,25% do trypsin-EDTA e incubar durante 5 min dentro de uma padrão incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO2).
    7. Inactivar tripsina com 8 mL de mídia STO.
    8. Transferi a solução de célula para um tubo de centrifugação. Combine mais de uma placa em um tubo de centrifugação para economizar tempo. Centrifugue por 5 min a 180 x g.
    9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de PBS.
    10. Use 10 µ l da solução de célula para contar células usando um hemocytometer. Contar as células na praça central quadriculada e multiplique o número obtido por 104 para determinar o número de células por mL 1. Contam-se duas vezes e a média de dois números para obter a estimativa final do número de células por mililitro.
    11. Centrifugar as células por 5 min a 180 x g.
    12. Aspire PBS e adicionar mídia STO 1:1 (em volume) e mídia de congelação 2 x para o centrifugado. Ajuste o volume para uma concentração final de célula de 4 x 106 células/mL (esta quantidade é bom para uma placa de 100 mm).
      Nota: por exemplo, de quatro placas de 150mm rendendo um total de 60 x 106 células, congele 4 x 106 células por cryovial, com cada cryovial contendo 1 mL de solução de célula. Quatro placas rendem aproximadamente 15 cryovials (60/4 = 15). Adicione 7,5 mL de mídia STO e 7,5 mL de 2x congelamento de mídia para o centrifugado e ressuspender alíquota de 1 mL para cada cryovial.
    13. Resuspenda pipetando lentamente mídia congela com centrifugado. Transferir 1 mL da solução de célula para cada cryovial e rotular adequadamente.
    14. Coloque cryovials dentro de uma caixa de poliestireno extraível (isso fornece uma taxa de resfriamento lenta, o que melhora a sobrevivência da pilha). Transferi a caixa para um freezer-80 ° C durante pelo menos 24 h antes de transferir o cryovial para nitrogênio líquido.
      Nota: Para obter melhores resultados, minimizar a célula contando o tempo, bem como o tempo entre adicionando mídia de congelação 2 x para células e transferir os frascos a-80 ° C.

2. cultura de pilha O9-1

  1. Preparar a mídia basal para cultura de células O9-1 adicionando o seguinte em DMEM (concentrações finais são indicadas): 15% FBS, 0,1 mM mínimo essencial mídia (MEM) aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio 1 mM, 55mm beta-Mercaptoetanol, 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 10 fator inibitório unidades/mL3 de leucemia (LIF; adicionado imediatamente antes do uso, não adicionar ao frasco de estoque) e 25 basic-fator de crescimento de fibroblastos ng/mL (bFGF; adicionado imediatamente antes do uso, não adicionar ao frasco de estoque).
  2. Filtro de esterilizar a mídia basal (poros tamanho 0,22 µm) e embrulhe em papel alumínio para proteger da luz.
  3. Colete condicionada mídia basal de células inactivadas de STO.
    Nota: Proceda somente após a obtenção de células inactivadas de STO. O9-1 basal mídia coletada de placas de celular STO é doravante referida como mídia basal condicionadas.
    1. Degelo inativada células STO rapidamente como descrito acima (um cryovial contendo 4 x 106 células é bom para uma placa de 100mm e produz aproximadamente 100 mL condicionado basal meios de comunicação depois de 10 dias após a coleta). Semente inativada células STO à placa de gelatina-revestido usando mídia STO. Permitir que as células anexar a noite numa incubadora umidificado padrão (37 ° C, 5% CO2).
    2. 24 h após o descongelamento de células STO, descartar a mídia STO existente e substitua a mídia basal.
      Nota: Não adicione LIF e bFGF para pratos de cultura de células STO inactivados; Só adicione aos pratos de cultura celular O9-1.
    3. Cada 24 h, alterar a mídia usando mídia basal O9-1 e coletar a mídia basal de STO placas de células dentro de uma garrafa. Embrulhe a garrafa que contém a mídia basal acondicionadas em papel alumínio para proteger da luz. Armazenar todas as mídias coletadas a 4 ° C.
      Nota: Porque as células foram inactivadas, eles podem não aparecer tão saudáveis quanto eles fizeram depois de vários dias de coleta; Isso é de se esperar.
    4. Opcionalmente, para verificar se há contaminação, recolha a mídia basal para cada dia de coleta em tubos diferentes (em vez de uma garrafa), envolvida em papel alumínio. Usando uma placa de 24, coloque 1 mL de mídia de cada dia em cada poço e incubar durante uma noite em uma incubadora padrão para verificar se há contaminação bacteriana sob o microscópio.
      Nota: A mídia continua a ser uma cor vermelha se não houver nenhuma contaminação mas muda para amarela se houver contaminação bacteriana.
    5. Depois de coletar condicionado mídia basal durante 10 dias, descarte as pilhas STO. Combinar (se aplicável) todos recolhidos condicional mídia basal e filtro esterilizar (poros tamanho 0,22 µm) em um frasco estéril. Envolva a garrafa em papel alumínio para proteger da luz. Mantenha a mídia basal condicionada filtrada a 4 ° C por um período máximo de um mês a partir da data de filtro.

3. mantendo as células O9-1

Nota: Trabalhar mídia basal O9-1 é filtro esterilizado condicionado mídia basal, a qual LIF (concentração final 103 unidades/mL) e bFGF (concentração final 25 ng/mL) são adicionados imediatamente para o prato de cultura celular antes do uso. Esta mídia precisa ser protegido da luz e armazenado a 4 ° C.

  1. Recuperação de células O9-1
    1. Descongele lentamente o frasco estoque da matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel) durante a noite a 4 ° C para preparar alíquotas.
    2. Adicionar 5 mL de DMEM com 10% FBS para 5 mL da estoque da membrana basal membrana de matriz. Misture bem por pipetagem com pontas de pipetas frio armazenadas a-20 ° C. Manter os tubos originais de garrafa e alíquota no gelo. Congele a alíquotas de diferentes volumes (alíquotas de 0,5 mL ou 1 mL), dependendo das necessidades do experimento. Evite o congelamento-descongelamento da membrana basal matriz várias vezes.
      Nota: a matriz da membrana basal se polimeriza rapidamente à temperatura ambiente; pontas de pipetas fria e conserve tubos frio quando trabalhando para evitar a polimerização não-intencional.
    3. Descongele uma alíquota da matriz da membrana basal, a 4 ° C ou em gelo 2 h antes de iniciar o experimento. Não armazene a matriz a 4 ° C por um tempo prolongado.
    4. Use o filtro esterilizados DMEM com 10% FBS para diluir a matriz de membrana basal para uma concentração final de 0,5 mg/mL para revestir as placas. Placas de revestimento com a matriz da membrana basal (0,5 mg/mL) à temperatura ambiente por 1 h. Certifique-se que totalmente cobre a placa (como mostrado na Figura 1).
    5. Incline o prato quando aspirar a matriz da membrana basal para evitar tocar a superfície revestida; chapas secas a 37 ° C por 30 min. Não seque em demasiado placas revestidas.
      Nota: Proceda somente quando todas as mídias e os reagentes estão prontos para usar (condicionado mídia basal, estéril filtrada 10% FBS em DMEM, LIF e bFGF).
    6. Recuperar O9-1 células rapidamente, colocando o cryovial em banho-maria a 37 ° C; lentamente, agite o frasco até a solução completamente transforma-se em líquido e dirijam-se para a próxima etapa.
    7. Transferi toda a solução de célula da cryovial (cerca de 1 mL) para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 5 volumes de DMEM com 10% FBS (filtro esterilizado com um tamanho de poro do filtro de 0,22 µm) e ressuspender.
    8. Centrífuga para 3 min a 180 x g. Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Resuspenda o pellet de células (batendo) em condicionado mídia basal suplementada com LIF e bFGF. Conte as células usando um hemocytometer.
      Nota: Condicionada mídia basal suplementada com LIF e bFGF é essencial para manter o multipotency da linha celular O9-1. Muito cuidado para adicionar a mídia correta para evitar a diferenciação celular não intencional.
    9. Células da semente de 10.000 a 15.000 células/cm2 para uma placa de 6. Permitir que as células para anexar e crescer em uma incubadora de cultura de célula padrão (37 ° C, 5% CO2) durante a noite antes de alterar a mídia.
    10. Certifique-se de que as células estão conectadas antes de continuar a mudar a mídia (células saudáveis anexado olhar como as mostradas na Figura 2).
    11. Sempre mude de meios de cultura no dia seguinte após a recuperação de células O9-1 (uso condicionada mídia basal suplementada com LIF e bFGF).
  2. Passagem de células O9-1
    1. Quando células O9-1 alcançar 80% de confluência, descongelar a matriz da membrana basal e preparar um prato de matriz-revestido de membrana basal, como descrito acima. Adicione condicionada mídia basal suplementada com LIF e bFGF ao navio. Como alternativa, adicione DMEM sem FBS para manter a matriz da membrana basal da secagem e armazenar dentro de uma incubadora umidificada padrão por não mais de 3 dias.
    2. Lavar os poços O9-1-contendo (placa de 6) com 2 mL de fosfato salino de Dulbecco (DPBS) duas vezes e pipetar suavemente para evitar a perda de células.
    3. Dissociar as células com 1 mL de 0,05% do trypsin-EDTA a 37 ° C por 3 min. neutralizar tripsina com uma quantidade igual de DMEM com 10% FBS. Pipete repetidamente o líquido sobre toda a superfície do poço para dissociar tantas células da placa possível.
      Nota: Concentração de tripsina é 0.05% em vez de 0,25%. Use DPBS para diluir do frasco estoque.
    4. Evite a geração de bolhas quando dissociando as células da placa.
    5. Transferi todas as célula de solução para um tubo de centrífuga e centrifugar por 3 min a 180 x g. Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Ressuspender o celular num tubo de centrífuga pipetando suave em condicionado mídia basal suplementada com LIF e bFGF.
    6. Use um hemocytometer para contar o número de células totais conforme descrito acima. Células de semente (10.000 a 15.000 células/cm2) para a placa revestida preparados como descrito nos passos 3.1.4 a 3.1.8. Um poço de uma placa de 6 exigiria 100.000 células para semente.
    7. Permitir que as células para anexar e crescer em uma incubadora de cultura de célula padrão (37 ° C, 5% CO2). Sempre mude de meios de cultura no dia seguinte após a passagem de células O9-1.
  3. Congelamento de células O9-1
    1. Para preparar 2 x mídia para O9-1 células de congelação, diluir o seguinte em DMEM (concentrações finais são indicadas): 40% FBS e 20% DMSO.
    2. Filtro de esterilizar 2 x congelamento mídia e mantê-lo em 4 ° C. O 2x congelando a mídia deve ser feita no dia que é usado. Descarte todos os meios de congelamento não utilizados.
      Nota: Congelar células O9-1 na confluência de 80%.
    3. Lavar os poços com DPBS duas vezes; pipeta suavemente para evitar a perda de células.
    4. Dissociar as células com 0,05% do trypsin-EDTA a 37 ° C por 3 min, em seguida, neutralizar a tripsina com uma quantidade igual de 10% FBS em DMEM. Pipete repetidamente o líquido sobre toda a superfície do poço para dissociar tantas células da placa possível.
    5. Transferi todos os conteúdos de placa para um tubo de centrífuga e centrifugar por 3 min a 180 x g. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de PBS e ressuspender tocando.
    6. Use 10 µ l de solução de célula para contar células usando um hemocytometer como descrito acima.
    7. Centrifugue a solução de célula para 3 min a 180 x g. Aspirar o sobrenadante e ajustar a quantidade de mídia basal necessárias; em seguida, adicione uma quantidade igual de mídia de congelação 2 x.
      Nota: As células são congeladas em uma concentração de 1 x 106 células/mL (1 mL por cryovial).
    8. Transferência de células para cryovials e rotular adequadamente. Coloque cryovials dentro de uma caixa de poliestireno extraível para uma taxa de arrefecimento lenta a-80 ° C durante pelo menos 24 h antes da transferência de nitrogênio líquido.
      Nota: Para obter melhores resultados, minimizar a célula contando o tempo e o tempo entre a adição de 2 x congelamento mídia e transferir os frascos a-80 ° C.

4. manipulação de células O9-1

  1. Realizando nocaute de siRNA em células O9-1
    1. Descongelar e revestir uma placa de 24 com matriz de membrana basal, como descrito acima (passos 3.1.4–3.1.8) antes de iniciar o experimento. Recuperar e O9-1 células, permitindo que eles cresçam para 60% a 80% de confluencia de sementes.
    2. Dilua os lipossomas em media serum-free de acordo com o volume bem apropriado. SiRNA diluído em media serum-free para a final. Adicione siRNA diluído para lipossomas diluídos na proporção recomendada pelo fabricante. Misture bem por pipetagem e incubá-los.
      Nota: Siga o guia do fabricante no volume utilizado, tempo e temperatura de incubação.
    3. Adicione um volume adequado do complexo lipídico de siRNA para células de acordo com as recomendações do fabricante.
    4. Incube as células para 24 h em uma incubadora de cultura de célula padrão (37 ° C, 5% CO2). Executar as etapas a jusante como apropriado (extracto de RNA, proteínas de extrato, coloração, etc.)
      Nota: concentrações e siRNA knockdown vezes podem variar dependendo da experiência individual.
  2. Realizando o nocaute do gene em células O9-1 usando edição de genoma CRISPR-Cas9
    Nota: Consulte o protocolo anteriormente publicado por usar CRISPR-Cas9 em células de mamíferos linhas29. Desde que aqui é uma descrição simplificada de CRISPR-Cas9 genoma edição e etapas relacionadas.
    1. Obter sgRNA sequências usando uma ferramenta de design de sgRNA.
    2. Ligar o sgRNA a pSpCas9 de vetor GFP (bb) - 2a -30.
    3. Transfect O9-1 células com o vetor, usando um protocolo padrão de lipofection de acordo com as recomendações do fabricante.
    4. Incube as células em uma incubadora de cultura de célula padrão a 37 ° C com 5% CO2 por 24 h.
    5. Execute a fluorescência-ativado da pilha classificação (FACS) baseado no GFP/7-AAD. Semente de GFP + single células em placas de 96 poços.
    6. Crescem as células na incubadora por mais 4 dias. Descarte todos os poços que têm mais de uma colônia.
    7. Realize PCR com primers projetados para detectar a exclusão. Após a PCR, execute produtos do PCR em um gel de agarose para avaliar o tamanho da banda. Valide a eficiência de nocaute alcançada usando CRISPR-Cas9 editingby realizando mancha ocidental (um exemplo dos resultados de nocaute de Yap é mostrado na Figura 3).

5. diferenciação celular O9-1

  1. Diferenciação de células O9-1 em osteoblastos
    1. Para preparar a mídia de diferenciação osteogênica, diluir o seguinte em alfa-MEM (concentrações finais são indicadas): dexametasona 0,1 mM 100 Proteína morfogenética do osso ng/mL 2 (BMP2), 50 µ g/mL de ácido ascórbico, b-glicerofosfato de 10 mM, 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL.
    2. Detecta o marcador de osteoblastos, osteocalcina, em osteoblastos diferenciados por imunocoloração conforme mostrado na Figura 4.
      Nota: Diferenciação osteogênica também pode ser avaliada usando outros marcadores dos osteoblastos ou com coloração vermelho de alizarina ou coloração da fosfatase alcalina.
  2. Diferenciação de células O9-1 em condrócitos
    1. Para preparar a mídia de diferenciação de condrócitos, diluir o seguinte em alfa-MEM (concentrações finais são indicadas): soro fetal bezerro de 5% (FCS), 1% insulina-transferrina-selênio (ITS), penicilina 100 U/mL Estreptomicina 100 mg/mL, 10 ng/mL transformando fator de crescimento beta (TGF-b3), o ácido ascórbico 50 mg/mL, 10 ng/mL BMP2, dexametasona 0,1 mM e piruvato de sódio de 1 mM.
    2. Primeira cultura uma monocamada de O9-1 células com mídia osteogênica por 3 dias e então trypsinize e cultura como um formato de micromass em mídia de diferenciação condrócito por mais 7 dias.
    3. Diferenciação de chondrogenic bundas com coloração de Alcian blue ou marcadores de condrócitos.
  3. Diferenciação de células O9-1 em células musculares lisas
    1. Para preparar a mídia de diferenciação de células de músculo liso, diluir o seguinte em DMEM (concentrações finais são indicadas): 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 µ g/mL e 10% FBS.
    2. Diferenciação de pilha do músculo liso bundas com mancha usando anticorpos contra marcadores de células musculares lisas, tais como a actina de músculo liso (SMA), mostrado como um exemplo na Figura 5.
  4. Diferenciação de células O9-1 em células gliais
    1. Para preparar a mídia de diferenciação de células gliais, diluir o seguinte em DMEM/F12 (concentrações finais são indicadas): 1 x suplemento B-27, 2 mM L-glutamina, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 50 ng/mL LIF e 1% inactivadas pelo calor FBS.
    2. Avalie a diferenciação de células gliais realizando mancha com anticorpos contra marcadores de células gliais, tais como ácido graxo proteína 7 (FABP7).

Resultados

O objetivo das nossas experiências knockdown e nocaute foi estudar os efeitos de Yap e Taz perda-de-função nas células O9-1. Antes os experimentos knockdown e nocaute, temos que certificar-se que preparam para mídia basal e células de cultura O9-1 como descrito acima (por exemplo, necessidades de matriz membrana basal para cobrir a placa inteira como mostrado na Figura 1e O9-1 células recuperadas de nitrogênio líquido como mostrado ...

Discussão

O NCC é um contribuinte versátil e chave para diferentes tecidos e órgãos durante a morfogênese embrionária. A linha de celular O9-1 mantém seu potencial para se diferenciar em muitos tipos de células diferentes e imita as características na vivo do CNCC, tornando-o uma ferramenta útil em vitro para estudar a função dos genes e Regulamento molecular em CNCC. O status diferente de células O9-1 pode corresponder a diferentes crista neural progênie na vivo, dependendo das condições...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicações científicas do Instituto do coração do Texas, prestou apoio editorial. Agradecemos também as seguintes fontes de financiamento: nacional Center cientista desenvolvimento Grant a associação americana do coração (14SDG19840000 de J. Wang), o prêmio de pesquisa Lawrence 2014 do Rolanette e osso Lawrence Berdon doença programa do Texas (para J. Wang ) e os institutos nacionais de saúde (DE026561 e DE025873 para J. Wang, DE016320 e DE019650 de R. Maxson).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

Referências

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Gen ticaquest o 140CRISPRCas9O9 1 c lulasnocaute do genegene knockdowncrista neural

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados