Design e síntese de um Rack de acordeão de DNA reconfigurável

Resumo

Descrevemos o protocolo detalhado para projeto, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para um rack de acordeão de DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6.

Resumo

Sistemas mecânicos baseados em nanostructure de DNA ou DNA nanomáquinas, que produzem movimento complexo nanoescala em 2D e 3D no nanômetro a resolução ångström, mostram grande potencial em vários campos da nanotecnologia como os reactores moleculares, administração de medicamentos, e sistemas de nanoplasmonic. O rack acordeão reconfigurável de DNA, que coletivamente pode manipular a uma rede de nanoescala 2D ou 3D de elementos, em múltiplos estágios em resposta às entradas do DNA, é descrito. A plataforma tem potencial para aumentar o número de elementos que DNA nanomáquinas podem controlar a partir de alguns elementos para uma escala de rede com múltiplos estágios de reconfiguração.

Este protocolo, descreveremos todo o processo experimental do rack acordeão DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6. O protocolo inclui um procedimento de regra e simulação de projeto de estruturas e uma experiência de molhado-laboratório de síntese e reconfiguração. Além disso, a análise de estrutura de temperatura (microscopia eletrônica de transmissão) e FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) está incluído no protocolo. Os métodos de projeto e simulação romance cobertos neste protocolo ajudará pesquisadores a utilizar o cesto de acordeão de DNA para novas aplicações.

Introdução

Sistemas mecânicos baseados em nanoestruturas de DNA ou ADN nanomáquinas^1,2,3,4,5 são exclusivos porque eles produzem movimento complexo nanoescala em 2D e 3D no nanômetros para Ångström-resolução, de acordo com vários biomolecular estímulos^2,3,6. Anexar materiais funcionais sobre estas estruturas e controlando as suas posições, estas estruturas podem ser aplicadas a diversas áreas. Por exemplo, as nanomáquinas de DNA têm sido propostas para um reator molecular⁷, droga entrega⁸e nanoplasmonic sistemas^9,10.

Anteriormente, nós introduzimos o rack acordeão reconfigurável de DNA, que pode manipular a uma rede de nanoescala 2D ou 3D de elementos¹¹ (figura 1A). Ao contrário de outras DNA nanomáquinas que apenas alguns elementos de controle, a plataforma pode coletivamente manipular periodicamente matriz elementos 2D ou 3D em várias fases. Nós antecipamos que uma rede programável reação química e biológica ou um sistema de computação molecular pode ser construído de nosso sistema, aumentando o número de elementos controláveis. O rack de acordeão de DNA é uma estrutura, em que a rede de múltiplos feixes de ADN está ligada a articulações compostas de DNA de cadeia simples (figura 1B). O acordeão rack gerado por vigas do DNA é reconfigurado pelos bloqueios de DNA, que hibridizam à parte pegajosa de vigas e alterar o ângulo entre os feixes de acordo com o comprimento da ponte parte dos bloqueios (estado bloqueado). Além disso, várias etapa reconfiguração é demonstrada adicionando novas fechaduras após a formação do estado livre removendo bloqueios de DNA através da vertente baseada no ponto de apoio deslocamento^12,13.

Neste protocolo, descrevemos o todo processo de design e síntese do rack acordeão DNA reconfigurável. O protocolo inclui design, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para a síntese de rack acordeão DNA de 6 por 6 malhas e uma reconfiguração desses. A estrutura coberta no protocolo é o modelo básico da pesquisa anterior¹¹ e 65 nm em 65 nm de tamanho, constituído por 14 vigas. Em termos de projeto e simulação, o projeto estrutural do acordeão rack é diferente do convencional ADN origami^14,15 (ou seja, hermeticamente embalados). Portanto, a regra de projeto e simulação molecular foram modificados dos métodos tradicionais. Para demonstrar, mostramos a técnica de desenho usando a abordagem modificada de circunflexo¹⁴ e a simulação do acordeão rack usando oxDNA^16,17 com scripts adicionais. Finalmente, os dois protocolos de temperatura e FRET para análise de estruturas de cremalheira acordeão configurados são descritos.

Protocolo

1. projeto do 6 por 6 DNA acordeão Rack com circunflexo¹⁴

1. Baixe e instale o circunflexo 2.0 software¹⁴ para projetar um rack de acordeão de DNA (circunflexo 2.5 também está disponível em https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Abra o circunflexo¹⁴ e clique na Ferramenta de Praça para adicionar uma nova parte com uma malha quadrada.
2. O número de cada feixe do acordeão rack e desenhar no painel esquerdo da estrutura do circunflexo¹⁴ (Figura 2).
3. Clique na ferramenta lápis e desenhar cada feixe no painel Editar direito sobre o circunflexo¹⁴. Pausa feixes cada 32 bp, que é para articulações entre vigas adjacentes. Coloque o grampos cruzamentos na mesma posição que as articulações. Use a Ferramenta lápis e a Ferramenta inserir no circunflexo¹⁴ deixar as articulações ter adicionais single-stranded cruzamentos.
4. Clique na Ferramenta lápis e conectar as articulações. Cada feixe tem sete articulações.
5. Gere os cruzamentos de andaime para mesclar os andaimes para o único loop usando o andaime relatado anteriormente roteamento algoritmo¹¹. Não deixe que o domínio de ligação mínima entre vertentes andaime e grampo ser menor que 8 bp (Figura 3).
6. Coloque os andaimes que não são usados na montagem nos vértices localizados em lados opostos do acordeão rack, conforme mostrado na Figura 3.
7. Clique a quebrar a ferramenta. Quebre os fios de fibras descontínuas aonde circular ou mais de 60 bp.
8. Desenha a bloqueio de DNA.
   1. Clique a quebrar a ferramenta. Pausa 8 bp de uma região de DNA descontínuas para fazer uma parte pegajosa e excluir 8 bp de uma região de DNA descontínuas. Existem 18 partes pegajosas (Figura 1) no rack acordeão 6 por 6.
   2. Coloque sequências que são inversa complementar às partes pegajosas em ambas as extremidades de fechamento cordões e conectá-los por uma região de ponte, que consiste de cadeias de poli T do comprimento desejado (figura 1B).
   3. Para a reconfiguração, adicionar 8 bp de sequências de ponto de apoio no final do DNA bloqueia para deslocamento de vertente. A sequência de suporte usada é na tabela 2.
   4. Prepare-se fios de poli A que são reverse complementar à região da ponte.
   5. Vertentes do projeto que são reverse complementares para as fechaduras de DNA para o experimento de reconfiguração.
9. Clique na Ferramenta de sequência e clique em DNA de andaime. Escolha o cadafalso como padrão M13mp18. Clique na Ferramenta de exportação e salvar a sequência no formato csv (tabela 1).

2. simular a estrutura com o oxDNA

1. Baixe e instale o oxDNA^16,17. O código-fonte mais recente está disponível em https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.
2. Fazer arquivos de configuração inicial do arquivo de¹⁴ circunflexo usando python script 'cadnano_interface.py', que é fornecido no pacote oxDNA^16,17 . O uso é a seguinte: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. O arquivo de topologia e o arquivo de configuração agora são gerados.
   Nota: O arquivo de topologia inclui quantos fios e nucleotídeos são na estrutura e informações sobre ligações de backbone-espinha dorsal entre nucleotídeos. O arquivo de configuração inclui informações gerais tais como temporais, energia e tamanho da caixa. Informações de orientação como vector de posição, espinha dorsal da base vetorial, vetor normal, velocidade e velocidade angular de nucleotídeos são também incluída (Figura 4).
3. Altere as informações no arquivo de configuração e topologia de circunflexo¹⁴ para fazê-los refletir as informações estruturais reais do acordeão rack. Todas as vigas são arranjadas em paralelo quando os arquivos de topologia e configuração do circunflexo¹⁴ são visualizados. No entanto, o acordeão rack é uma estrutura de treliça assim a distância entre nucleotídeos ligados são longe para simulação (Figura 5).
   1. Girar e mover cada feixe para a estrutura da estrutura desejada. As nove colunas à esquerda no arquivo de configuração são o vector de posição, espinha dorsal da base vetorial e vetor normal (Figura 4). Para girar um feixe, todos de posição, gire vetores base de espinha dorsal e normais, usando a transformação de rotação. Em seguida, mova um feixe alterando o vector de posição para localizá-lo, como mostrado na Figura 5.
   2. Relaxe a estrutura usando o script fornecido no pacote oxDNA (ver exemplo em $oxDNA/exemplos/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION para mais informações).
4. Execute a simulação de dinâmica molecular para 10 milhões passos usando o arquivo de configuração relaxados. O uso é a seguinte: '. / oxDNA < entrada >' salvar dados todos os passos de 5000 ou 10000.
5. Visualização
   Nota: As estruturas foram visualizadas usando cogli.
   1. Baixe e instale a versão mais recente do cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).
   2. Execute o cogli com os arquivos de configuração e topologia de simulação oxDNA. O uso é a seguinte: '. / cogli1 -t < arquivo de topologia >< arquivo de configuração >'.
   3. Esconda a caixa pressionando b.

3. síntese da estrutura

Nota: O método de síntese é adaptado do anterior protocolo^15,18.

1. Compre os grampos de DNA projetados de um provedor do oligonucleotide.
2. Ajuste a concentração destes grampos de DNA a 100 μM usando água livre de nuclease.
   1. Cada cadeia de DNA que constitui uma estrutura de 'free estado' em um tubo do pool e ajustar a concentração de 2 μM para cada vertente.
   2. Bloqueio de DNA piscina vertentes pelo comprimento e número de sites de bloqueio nos tubos e ajustar a concentração de 2 μM para cada vertente. sites de bloqueio 4, 9 e 18 são usados. Adicione fios de A poli, que são complementares à região ponte na mesma concentração.
   3. Vertentes de piscina que são inverter complementares ao DNA trancar fios pelo comprimento em tubos e ajustam a concentração de 2 μM para cada vertente.
3. Preparar a solução de MgCl₂ de 300 nM, misturando 70 μL de água livre de nuclease e 30 µ l da solução de₂ 1 μM MgCl. Prepare uma solução de EDTA Tris de 5x misturando 95 μL de água livre de nuclease e 5 μL de solução de EDTA Tris de 100x.
4. Adicione 2 μL de DNA, 1.1 μL de MgCl₂ solução de grampo, 2 μL de solução de EDTA Tris, 7.6 μL de água livre de nuclease e 7.3 μL de DNA de andaime de que a concentração é 110 nM tornar 20 μL de caldo misto. Definir a concentração final de cadafalso DNA de 40 nM, grampear o DNA de 200 nM, MgCl₂ a 16 mM e solução de Tris-EDTA a 0,5 x.
5. Aqueça rapidamente a solução-mãe misturada em um termociclador a 80 ° C e esfriar a 60 ° C, a uma taxa de 4 min por ° C e frio de 60 ° C a 4 ° C, a uma taxa de 40 min por ° C.

4. purificação da estrutura

Nota: As amostras de todas as estruturas foram purificadas antes da análise. Nesta seção, descrevemos o protocolo de purificação de PEG, que é adaptado a partir de literatura anterior¹⁹. A amostra também pode ser purificada por eletroforese em gel, conforme descrito em anterior literatura^15,18.

1. Prepare-se 5m de NaCl e 100 x Tris-EDTA.
2. Prepare o buffer de precipitação misturando 150 μL de PEG 8000, 500 μL de 100 x Tris EDTA e 101 μL de 5 M NaCl e 249 μL de água livre de nuclease.
3. Prepare o buffer de destino misturando 5.5 μL de solução de 300 nM MgCl₂ da secção 3.3, 10 μL de solução de EDTA Tris x 5 da secção 3.3 e 84.5 μL de água livre de nuclease.
4. Mix 20 μL da estrutura sintetizada da seção 3 e 20 μL de tampão-precipitação da seção 4.2. Em seguida, girar o estoque misturado a 16000 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante e dissolver a pelota no buffer de destino da seção 4.3.

5. reconfiguração do acordeão Rack de um estado' livre' para um 'estado bloqueado'

1. Sintetiza a estrutura sem bloqueios de DNA para a experiência de configuração.
2. Prepare o bloqueio de DNA da seção 3.
3. Adicione 2 μL de cadeias de ADN bloqueio do comprimento desejado em 20 μL da estrutura sintetizada. Concentração do bloqueio de DNA é cinco vezes maior do que a estrutura.
4. Incubar a amostra de 0, 10, 25, 50 ou 100 minutos para ver como a rápida reconfiguração ocorre.
   1. Para a incubação de 100 minutos, incubar a amostra a 50 ° C durante 30 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 0,33 ° C/minuto.
   2. Para a incubação de 50 minutos, incubar a amostra a 50 ° C por 15 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 0,66 ° C/minuto.
   3. Para a incubação de 25 minutos, incubar a amostra a 50 ° C para 7,5 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 1,32 ° C/minuto.
   4. Para a incubação de 10 minutos, incubar a amostra a 50 ° C por 3 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 3,3 ° C por minuto.
   5. Para a incubação de 0 minutos, armazene a amostra à direita de 4 ° C após fechamentos de DNA é adicionadas.
5. Logo após a etapa de fixação, esfria rapidamente a amostra a 4 ° C para evitar a desnaturação indesejada.

6. reconfiguração do acordeão Rack de um estado 'bloqueado' para um 'estado livre'

1. Sintetiza a estrutura com bloqueios de DNA do comprimento desejado para a experiência de configuração.
2. Prepare o reversos costas complementares da seção 3.
3. Adicione 2 μL de cordões que são inverter complementares para as vertentes de bloqueio do comprimento desejado em 20 μL da estrutura sintetizada. Concentração do bloqueio de DNA é cinco vezes maior do que a estrutura.
4. Incubar a amostra para 0, 12, 60, 120, 240 minutos para ver como a rápida reconfiguração ocorre.
   1. Para o 12, 60, 120, incubação de 240 minutos, aqueça rapidamente a amostra a 40 ° C e esfriar lentamente até 20 ° C para o tempo correspondente a cada uma. Logo após a etapa de desmontar, esfria rapidamente a amostra a 4 ° C para evitar a desnaturação indesejada.
   2. Para a incubação de 0 minutos, armazene a amostra à direita de 4 ° C depois reversos costas complementares são adicionadas.

7. TEM imagem

Nota: O protocolo de imagem TEM foi adaptado do anterior literatura^18,20.

1. Prepare a solução de NaOH 1,25 M misturando 87,5 μL de água livre de nuclease e 12,5 μL de solução de NaOH 10 M.
2. Adicione 1 μL de solução de NaOH 1,25 M para 50 μL de solução de formiato de uranilo a 2%.
3. Vórtice a solução durante 3 minutos e centrifugar a velocidade máxima durante 3 minutos. Depositar 3 μL da amostra purificada na grelha TEM brilho-alta por 3 minutos e lavar rapidamente com papel de filtro.
4. Deposite 7 μL de solução de formiato de uranilo preparado por 30 segundos e lavar rapidamente com papel de filtro.
5. Medir o comprimento e o ângulo da estrutura acordeão fotografada pela TEM.

8. FRET análise

1. Use Atto 550 e Atto 647N corante, para que a distância de Förster é 6.5 nm. Substitua grampo 58 e 117 de grampo na tabela 1 fluorescente etiquetados cordões. Então, sintetiza a estrutura com vertentes fluorescente rotulados pelo método descrito na seção 3.
2. Medir a concentração da amostra purificada.
3. Normalize a amostra de 10 μL 50 nM e carga para as 384 microplacas bem.
4. Excitar a amostra com doador e aceptor de corantes em 550 nm e medir o espectro de fluorescência de 570 nm para 800 nm com um dados.
5. Medir o espectro de fluorescência da amostra somente doador da mesma forma.
6. Excitar as tinturas da amostra a 650 nm e o espectro de fluorescência e medida de 670 nm para 800 nm. Isto é para medir a concentração do aceitador.
7. Obter os desvios-padrão, repetindo o mesmo experimento com três amostras, que são sintetizados e purificados separadamente.
8. Calcule a eficiência do traste com a relação de um método, conforme descrito pela equação abaixo de²¹.
   
   DA₅₅₀: intensidade de fluorescência de pico aceitador da amostra com doador e aceptor no 550 excitação nm.
   D₅₅₀: intensidade de fluorescência na faixa de emissão aceitador da amostra do doador somente em 550 excitação nm.
   DA₆₅₀: intensidade de fluorescência de pico aceitador da amostra com doador e aceptor na excitação de nm 650.

Resultados

O rack de acordeão de DNA 6 projetado por 6 é simulado a partir do oxDNA^16,17 , e os resultados são mostrados na Figura 6. O resultado da simulação, foi confirmado que a estrutura se destina é formada sem distorção da estrutura.

As imagens TEM na Figura 7 são imagens de estruturas configuradas com um co...

Discussão

Este protocolo apresenta todo o processo de design, simulação, síntese e análise do básico 2D DNA acordeão rack. O projeto modificado e regras de simulação têm sido descritas porque a regra do projeto difere do padrão origami de DNA, em que a cremalheira de acordeão de DNA tem nucleotídeos adicionais em crossovers para flexibilidade^14,15. A partir disso, esperamos que o protocolo pode acelerar várias pesquisas usando acordeão cremalheiras de DNA. Al...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 Single-stranded DNA	NEB	N4040s
1M MgCl2 Solution	Biosesang	M2001
Tris-EDTA buffer	Biosesang	T2142
Nuclease-Free Water	Qiagen	129114
5M Sodium Chloride solution	Biosesang	s2007
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
10N NaOH	Biosesang	S2038
Uranyl formate	Thomas Science	C993L42
Thermal cycler C1000	Biorad
Nanodropic 2000	Thermo Fisher Scientific
TEM (LIBRA 120)	Carl Zeiss
Fluorometer Enspire 2300	Perkin-Elmer
Centrifuge	Labogene	LZ-1580