Ressonância de superfície melhorada Raman dispersão nano-sonda Ratiometry para detecção de câncer de ovário microscópico através do Receptor de folato como alvo

Resumo

Câncer de ovário forma metástases em toda a cavidade peritoneal. Aqui, apresentamos um protocolo para fazer e uso folato receptores alvo superfície melhorada ressonância nanosondas de espalhamento Raman que revelam estas lesões com alta especificidade através de ratiometric de imagem. As nanosondas são administradas intraperitonealmente com ratos vivos, e as imagens derivadas se correlacionam bem com a histologia.

Resumo

Câncer de ovário representa a malignidade ginecológica mais mortal. A maioria dos pacientes apresentam-se em estágio avançado (fase de FIGO III ou IV), quando local metastático espalhar já ocorreu. No entanto, o câncer de ovário tem um padrão único de propagação metastática, em que os implantes de tumor inicialmente estão contidos dentro da cavidade peritoneal. Esse recurso pode permitir, em princípio, a ressecção completa do tumor implantes com intenção curativa. Muitas dessas lesões metastáticas são microscópicas, tornando-os difíceis de identificar e tratar. Neutralizar tais micrometastases é acreditado para ser dos principais objetivos no sentido de eliminar a recorrência do tumor e alcançar a sobrevivência a longo prazo. Raman de imagem com ressonância maior superfície nanosondas de espalhamento Raman pode ser usado para delinear tumores microscópicos com alta sensibilidade, devido a sua brilhante e opaco assinaturas espectrais. Aqui, descrevemos a síntese dos dois 'sabores' de tais nanosondas: um anticorpo-acrescida que tem como alvo os receptores de ácido fólico — overexpressed em muitos cancros ovarianos — e um nano-sonda não específico de controle, com espectros distintos. As nanosondas são co administradas intraperitonealmente para modelos de rato de adenocarcinoma de ovário humano metastático. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê do Memorial Sloan Kettering Cancer Center. A cavidade peritoneal dos animais é cirurgicamente exposta, lavada e digitalizada com um microphotospectrometer Raman. Posteriormente, as assinaturas de Raman das dois nanosondas são dissociadas usando um algoritmo de ajuste clássico mínimos quadrados, e seus respectivos escores dividido para fornecer um sinal de ratiometric de ácido fólico-orientados sobre sondas não segmentadas. Desta forma, metástases microscópicas são visualizados com alta especificidade. A principal vantagem dessa abordagem é que a aplicação local na cavidade peritoneal — que pode ser feito convenientemente durante o procedimento cirúrgico — pode marcar tumores sem submeter o paciente a exposição sistémica de nanopartículas. Falso positivo sinais decorrentes da ligação não-específica das nanosondas sobre superfícies viscerais podem ser eliminados, seguindo uma abordagem de ratiometric onde nanosondas visadas e não específico com assinaturas de Raman distintas são aplicadas como uma mistura. O procedimento atualmente ainda é limitado pela falta de um comercial Raman de campo amplo sistema de câmera, permitindo que uma vez disponível para a aplicação desta técnica no teatro operacional de imagem.

Introdução

Raman, imagem latente com 'Espalhamento Raman reforçada superfície' nanopartículas (SERS) tem mostrado grande promessa em delineating lesões em uma variedade de configurações e para muitos tumor diferentes tipos^1,2,3,4 . A principal vantagem de nanopartículas SERS é sua assinatura espectral, como impressão digital, que lhes permite a deteção inquestionável que não é confundida por sinais de fundo biológico⁵. Além disso, a intensidade do sinal emitido é ainda mais amplificada com a utilização de moléculas de repórter (corantes) com maxima de absorvância em consonância com o laser de excitação, dando origem a 'superfície reforçada ressonância Raman dispersando' (SERRS) nanopartículas com ainda maior sensibilidade^{6,7,8,9,10,11,12}.

Uma barreira que precisa ser abordado para a adopção de nanopartículas de SE(R)RS¹³ e muitas outras nanopartículas construções^14,15 para uso clínico são seu modo de administração, como injeção intravenosa provoca sistêmica exposição do agente e exige testes extensivos para excluir potenciais efeitos adversos. Neste artigo, apresentamos um paradigma diferente, baseado na aplicação de nanopartículas localmente na vivo, diretamente para a cavidade peritoneal durante a cirurgia, seguido por uma etapa de lavagem para remover qualquer nanopartículas desacoplado¹. Esta abordagem está em consonância com novas abordagens terapêuticas que estão atualmente sob investigação que também fazem uso da instilação local de agentes na cavidade peritoneal, chamada quimioterapia intraperitoneal hipertérmica (HIPEC). Assim, o princípio em si deve ser relativamente fácil de integrar em um fluxo de trabalho clínico. Nós estudaram a biodistribuição das nanopartículas após aplicação intraperitoneal e não observaram qualquer absorção detectável para a circulação sistêmica¹. Além disso, a abordagem de aplicação local contorna o sequestro de nanopartículas pelo sistema reticuloendotelial, portanto os números de nanopartículas necessários são marcadamente reduzidos. No entanto, quando aplicada topicamente, anticorpo-acrescida de nanopartículas tendem aderir nas superfícies viscerais mesmo na ausência de seu alvo. A fim de minimizar os sinais positivos falsos devido à adesão de nanopartículas não-específica, buscamos uma abordagem ratiometric, onde um nano-sonda molecularmente orientada fornece o sinal específico e um nano-sonda não específico de controlo, com diferente espectro Raman, contas para plano de fundo específico^16,17. Nós demonstramos esta metodologia aplicada topicamente superfície reforçada de ressonância espectroscopia Raman de ratiometric recentemente em um modelo do rato do câncer de ovário difusa¹.

O objectivo geral deste método é desenvolver dois SERRS nanosondas, um alvo e um específico, a ser aplicado localmente em modelos do rato, para a prevalência/superexpressão de um câncer de imagem relacionados biomarcador ratiometric detecção das duas sondas através Raman de imagem. Neste trabalho, o receptor de folato (FR) foi escolhido como alvo, como este é um marcador upregulated em muitos cancros ovarianos^18,19. Raman microfilmagem com nanopartículas SERS-baseado também tem sido demonstrada por câncer célula identificação²⁰. Dois distintos "sabores" de Raman nanopartículas são sintetizados, cada um derivando sua impressão digital de um corante orgânico diferente. As nanopartículas consistem de um núcleo de ouro em forma de estrela, rodeado por uma concha de silicone e demonstrar a ressonância de plasmon de superfície em aproximadamente 710 nm. O repórter de Raman (corante orgânico) é depositado em simultâneo com a formação do reservatório de sílica. Finalmente, para as nanosondas FR-alvo (αFR-NPs) a concha de silicone é conjugada com anticorpos, Considerando que as nanosondas não específico (nt-NPs) são passivadas com uma monocamada de polietileno glicol (PEG).

Esta técnica foi utilizada com sucesso para mapear tumores microscópicos em um modelo de enxerto heterólogo do rato difuso metastático do câncer de ovário (SKOV-3), demonstrando sua aplicabilidade para o uso in vivo. Ele também pode ser estendido para uso em tecidos extirpados, para fenotipagem do tumor, ou determinação de margem depois Eu diminuo como mostrado em um estudo cognato²¹.

SERRS nanosondas fornecem uma plataforma robusta para a criação de várias marcas direcionadas para biomarcadores, sintetizados com reações químicas simples, como descrito esquematicamente na Figura 1. Aqui, apresentamos o protocolo para a síntese dos dois tipos de SERRS nanosondas (seções 1-3), o desenvolvimento de um modelo de mouse apropriado câncer de ovário (seção 4), a administração de nanosondas e imagem (secção 5) e finalmente a análise de dados e visualização (secção 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (# 07/06/11).

1. ouro Nanostar núcleo síntese

Nota: Nanostars de ouro são utilizados como núcleos para ambos os sabores da SERRS nanosondas usadas neste experimento.

1. Prepare-se 800 mL de solução de (C₆H₈O₆) de ácido ascórbico de 60mm em água desionizada (DI) e 8 mL de solução ácida tetrachloroauric (HAuCl₄) de 20 mM em água DI. Refrigerar a 4 ° C.
2. Execute esta etapa de reação a 4 ° C. Colocar um Erlenmeyer contendo 800 mL da solução de ácido ascórbico em uma placa de agitação magnética e induzir um vórtice constante. Rapidamente, adicione 8 mL de solução ácida de tetrachloroauric dentro do vórtice. Dentro de segundos, nanostars irá formar e a solução irá assumir uma cor azul escura. No caso da cor a qualquer momento se torna rosa ou roxo, que significa a formação de nanoesferas, a suspensão deve ser descartada e a síntese reativada.
3. Despeje a suspensão de nanostar tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar por 20 min (4 ° C, 3.220 x g). Aspire o sobrenadante deixando aproximados 200 µ l da solução em cada tubo. Paga a precaução para não perturbar a pelota de nanopartículas na parte inferior do tubo.
   Nota: O sobrenadante deve ter uma tonalidade de azul por causa do restante nanostars suspenso.
4. Utilizando uma micropipeta, agite a solução para suspender e coletar as nanopartículas de cada tubo. Parte da pelota pode ser compactado na parte inferior do tubo e não será Ressuspender mesmo com vigorosa pipetagem-descarte esta parte.
5. A suspensão de nanopartículas de transferência para uma gaveta de diálise (MWCO 3.5 kDa) e urinar pelo menos três dias contra 2 L de água DI, trocando a água diariamente. Loja nanostars em diálise a 4 ° C por até um mês com mudanças de água a cada 3-4 dias.
   Nota: Os nanostars devem ser mantidos em diálise até necessária para a reação de silication, conforme descrito na seção 2.

2. a formação do reservatório de sílica

Nota: Dois sabores de Raman nanosondas são sintetizados. O procedimento de síntese é o mesmo para ambos, com a única diferença é a molécula de repórter de Raman (tintura) usada. Neste experimento, perclorato de IR780 e IR140 são usados. A reação deve ser sempre efectuada em recipientes de plástico. A síntese é altamente escalável e pode ser ajustada para a quantidade desejada de injectate necessário. Aqui, uma síntese de lote médio é descrita, o que pode ser dimensionado linearmente para volumes de menores ou maiores conforme necessário, com as mesmas concentrações e tempos de reação. As reações dos dois tipos de nano-sonda SERRS podem ser executadas em paralelo. Preste atenção para evitar a contaminação cruzada. Sonication deve ser executada para o redispersion de nanopartículas pelotas após a centrifugação, durante as etapas de lavagem, ou depois que as nanopartículas foram armazenadas por mais de uma hora. Sonication deve ser realizada até que as nanopartículas são claramente suspensas na solução, normalmente para 1 s.

1. No tubo A (um tubo cónico de 50 mL), misturar 10 mL de isopropanol, 500 µ l de TEOS, 200 µ l de água DI e 60 µ l de corante (perclorato de IR780 ou IR140, 20mm em DMF (dimetilformamida)).
2. No tubo B (tubo cônico de 15 mL), misture 3 mL de etanol e 200 µ l de hidróxido de amônio. Proceda à sonicação a nanostars de passo 1.4 para dispersar qualquer clusters em solução e adicionar 1,2 mL de nanostars para o tubo.
   Nota: a solução de hidróxido de amônia é altamente volátil e difícil de pipetar com precisão. Armazená-lo em 4 ° C, até que seja necessário, para facilitar a pipetagem.
3. Coloque o tubo A no vortex e induzir um vórtice constante. Rapidamente, adicione o conteúdo do tubo B dentro do vórtice e manter a mistura por cerca de 5 s. transferir imediatamente para um abanador e deixe reagir por 15 min, agitando a 300 rpm, à temperatura ambiente.
4. Após a incubação de 15 min, saciar a reação pela adição de etanol para encher o tubo de 50 mL. Centrifugar por 20 min no 3.220 x g e 4 ° C.
5. Aspire o sobrenadante, deixando cerca de 0,5 mL de solução, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Adicionar 1 mL de etanol e agite com uma pipeta para Ressuspender as nanopartículas. Transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e lavar 4 vezes com etanol por centrifugação a 11.000 x g durante 4 min, aspirar o sobrenadante e resuspending a pelota por ultrasonication para aproximadamente 1 s.
   Nota: Nesta fase, as nanopartículas silicatadas podem ser acrescidas, conforme descrito na seção 3, ou resuspended em água DI com uma etapa de lavagem extra, para o armazenamento a 4 ° C por até uma semana.

3. superfície Functionalization

Nota: IR780 SERRS nanosondas vão ser conjugadas com anticorpos do receptor-direcionamento de folato através um PEG crosslinker para formulário αFR-NPs; IR140 SERRS controle nanosondas vão ser conjugadas com um monolayer PEG passivating, para nt-NPs. Ambos os sabores são formados através de uma reação de thiol-maleimide em reações distintas mas paralelas.

1. Lave as nanopartículas duas vezes por centrifugação a 11.000 x g durante 4 min, aspirar o sobrenadante e resuspending a pelota em 1 mL de etanol por ultrasonication. Repita a etapa de lavagem mais uma vez, mas redisperse em 1 mL de etanol a 85%, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) e 5% água DI. Incube a temperatura ambiente por 1-2 h introduzir tióis na superfície da partícula.
2. Lave as nanopartículas thiol-acrescida por centrifugação a 11.000 x g durante 4 min, aspirar o sobrenadante e resuspending a pelota por ultrasonication, duas vezes em etanol, duas vezes em DI e finalmente em HEPES (4-(2-hidroxietil) -1- tampão de ácido piperazineethanesulfonic) (10 mM, pH 7.1) e reserve.
   Nota: MES (2-(N- Morpholinos) ácido etanesulfónico) tampão HEPES deve ser usado. Amortecedores com maior salinidade, como a PBS (tampão fosfato salino), podem induzir a agregação de nanopartículas.
3. O anticorpo acrescido αFR-NPs, reajam 200 µ g de anticorpos (clone anticorpo antiácido fólico ligação proteína [LK26]) com dez vezes excesso molar de PEG crosslinker (poly(ethylene glycol) (N-Hidroxisuccinimida 5-Pentanoato de) éter n-(3- aminoethane maleimidopropionyl) (CAS: 851040-94-3), em dimetilsulfóxido (DMSO)) em 500 µ l de tampão MES (10 mM, pH 7.1) por 30 min.
4. Remover o excesso crosslinker e concentrar anticorpo por centrifugação a solução anticorpo-PEG em um filtro centrífugo (MWCO 100 kDa). Para os filtros centrífugos utilizados neste estudo, realizar centrifugação por 10min a 14.000 x g e 23 ° C. Recupere os anticorpos conjugados em um tubo de fresco, invertendo o filtro e centrifugação a 1.000 x g por 2 min.
5. Pipetar as nanopartículas IR780 de passo 3.2 dentro do tubo com os anticorpos e agitar com a pipeta para misturar. Incubar a mistura durante pelo menos 30 min à temperatura de quarto, ou, como alternativa a 4 ° C durante a noite para formar o αFR-NPs.
6. Para formar o nt-NPs, adicione 1% w/v metoxi-finalizada (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) dissolvidos em DMSO para as nanopartículas IR140 SERRS do passo 3.2 e deixe reagir em 500 µ l MES buffer (10 mM, pH 7.1) pelo menos 30 min à temperatura ambiente, ou, como alternativa a 4 ° C durante a noite.
7. Para a administração a ratos (secção 5), rotação para baixo os dois sabores de nano-sonda a 11.000 x g durante 4 min, aspirar o sobrenadante para remover a solução com livre não tenha reagida anticorpos/PEG e redisperse cada sabor no buffer MES (10 mM, pH 7.1) na concentração de pM 600 . Quando resuspending as nanopartículas, minimize a exposição desnecessária a ecografia, para evitar a desnaturação do anticorpo.

4. Mouse modelo de desenvolvimento

1. Estabelece uma cultura constante de linhagem de células de adenocarcinoma de ovário humano (SKOV-3). Opcionalmente, para habilitar o monitoramento via bioluminescência/fluorescência, use células transfectadas de Luc SKOV-3⁺/GFP⁺ . Células de cultura em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) com 10% de soro fetal bezerro e passagem duas vezes por semana. Para injeção, Incube as células com 0,25% trypsin/0.05% EDTA por 3 min para desanexar, posteriormente lavar e Resuspenda em PBS em 2 x 10⁶ células/100 µ l.
2. Para estabelecer o modelo de ovário micrometastasis, injete 200 µ l de suspensão SKOV-3 células intraperitonealmente em camundongos fêmeas modelo (FOXn1nu/FOXn1nu ratos, 6-8 semanas de idade). Disseminação peritoneal disseminada ocorrerá em aproximadamente 4 semanas. Se usando células de Luc SKOV-3⁺ , o crescimento do tumor pode ser monitorado com bioluminescência através da administração de 2 mg de Luciferina de besouro em 50 µ l PBS através da injeção de retroorbital.

5. nanossondas injeção e imagem

1. Preparar as nanosondas (αFR-NPs e nt-NPs), conforme descrito nas seções 1-3 e mistura na proporção de 1:1, para uma concentração final de 300 pM de cada tipo de buffer de MES (10 mM, pH 7.1). Opcionalmente, preparar normas de referência de 30 pM de cada um dos sabores nano-sonda em tubetes cônicos (100 µ l).
2. Injectar intraperitonealmente 1 mL de suspensão de nanopartículas em cada rato e Massageie suavemente a barriga para distribuir as nanopartículas dentro da cavidade peritoneal. Volte o mouse ao seu alojamento. Depois de 25 ou mais minutos, eutanásia o mouse através de CO₂ asfixia.
3. Aperte o mouse sobre uma plataforma cirúrgica, na posição supina (para o abdômen todo imaging, a plataforma precisa ser montável para o palco do microscópio vertical).
   1. Usando fórceps serrilhado e a tesoura de dissecação, retire a pele para expor o peritônio e realizar uma grande incisão sagital (entre 2 e 3 cm de comprimento) para expor o abdome inteiro. Anexe os flaps peritoneais para a plataforma. Lave o interior da cavidade peritoneal pelo menos 60 mL de PBS usando uma garrafa de plástico de esguicho.
      Nota: Para habilitar imagens desobstruídas do abdômen inteiro, o intestino precisa ser mobilizado ou extirpado. Excisão, ressecção com uma ligadura dos vasos mesentéricos para reduzir a hemorragia na cavidade abdominal.
   2. Alternativamente, a imagem de órgãos específicos, os impostos especiais de consumo após a lavagem PBS e colocá-los numa lâmina de microscópio.
4. Transferir a plataforma ou slide para um microspectrophotometer Raman com configuração óptica na vertical e um palco motorizado para a imagem latente; Use um sistema comercial com um 300 mW 785 nm laser de diodo, com uma grelha de 1.200 sulcos por mm, centrado no 1.115 cm^-1.
   1. Focar a área de interesse usando óptica de luz branca, focagem de pares com o laser de Raman. Selecione a área a ser fotografada e a resolução desejada; neste relatório, utilizou-se um modo de aquisição de alta velocidade (espectros adquiridos sob iluminação contínua do laser com o estágio de microscópio em constante movimento, com resolução espacial efetiva 14.2 µm por 200 µm; ampliação de x 5, 100 mW de potência no objetivo, e < 100 ms exposição por ponto).
      Nota: Os tubos com as nanosondas referência do passo 5.1 podem ser colocados dentro da área de imagem, se desejado, para fornecer padrões de referência interna para posterior análise. Certifique-se de que não estranhas fontes de luz diferente do laser atingir o objetivo.
5. Opcionalmente, preparar a amostra para processamento histológico e validação por fixação em paraformaldeído 4% em PBS durante a noite a 4 ° C. Enxágue com PBS a 4 ° C durante 15 minutos pelo menos duas vezes. Manter a amostra em etanol a 70% em água até padrão processamento histológico e incorporação de parafina. Para validação histológica dos tumores, seções (5 µm de espessura) de diferentes profundidades do bloco de parafina podem ser coradas com hematoxilina e eosina (H & E).

6. processamento de dados e visualização

Nota: Todo o processamento de dados foi realizado com uma interface gráfica do usuário desenvolvida internamente, usando o software comercial. Todas as funções utilizadas têm genéricos equivalentes disponíveis em outros ambientes de computação.

1. Obter espectros de referência para os dois sabores, interrogando puras suspensões de cada um. Os espectros de referência podem ser derivados de scans de ponto das nanosondas, imagem latente das nanosondas em placas de alvéolos, ou incluindo referências internas nos scans experimentais em tubos de referência (ver passo 5.1).
2. Pré-processar os espectros de referência, usando a subtração de linha de base (filtro de Whittaker, λ = 200), normalização pela área sob a curva e o filtro derivado Savitzky-Golay (polinômio de segundo grau se encaixam, derivativo, largura de primeira ordem = 15 passos). Estes espectros pré-processado irão servir como referências para o modelo clássico de mínimos quadrados (CLS).
3. Pré-processar os dados de exemplo da imagem da mesma maneira como os espectros de referência. Obter partituras CLS para cada ponto de amostra usando um algoritmo disponível de CLS. O golo de CLS (DCLS) direto é simplesmente as coordenadas da projeção de um espectro de amostra para o espaço linear definido pela matriz inversa generalizada (inversa de Moore-Penrose) dos espectros de referência. Outro encaixe algoritmos podem ser usados (negativo mínimos quadrados, mínimos quadrados parciais ou outros).
   Nota: Alguns algoritmos de encaixe podem dar origem a resultados negativos, que, neste contexto, não são físicos. Se este for o caso, um limite poderia ser definido para excluir resultados negativos ou um algoritmo restrita não negativos mínimos quadrados ser empregadas em vez disso.
4. Calcular a relação pontual das pontuações na referência para as alvo nanopartículas (marca_αFR) sobre as pontuações em referência para as nanopartículas não específico (escores_nt). Se os resultados são não-negativo, a relação pode ser expressa de forma logarítmica:
   R = log₁₀(marca_αFR/ pontuações,_nt).
   A relação R é melhor exibida em uma escala de cores divergentes centralizada em zero, para expressar a abundância relativa das sondas em ordens de magnitude. A imagem resultante pode ser sobreposta na imagem luz branca da amostra, para revelar áreas de superexpressão do receptor de folato.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Para efeitos de controlo de qualidade, as nanopartículas podem ser caracterizadas usando uma variedade de métodos durante o processo de síntese, incluindo temperatura, DLS, análise de rastreamento de nanopartículas e espectroscopia de absorção UV/Vis, como mostrado na Figura 2.

Desta forma, o tamanho do núcleo nanostar de ouro (descrito na seção 1), a formação do reservatório de sílica...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece instruções para a síntese de dois "sabores" do SERRS nanosondas e de emprego em camundongos para Raman de tumor de ovário superexpressão do Receptor de folato, usando um algoritmo de ratiometric de imagem. A principal vantagem de Raman de imagem sobre outras técnicas de imagem ópticas (tais como fluorescência) é a alta especificidade do sinal nanossondas que não pode ser confundido com sinais de origem biológica. Nesta personificação de Raman de imagem, as nanopartículas n?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
3-MPTMS	Sigma-Aldrich	175617
Ammonium hydroxide (28%)	Sigma-Aldrich	338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]	AbCam	ab3361
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous)	Sigma-Aldrich	276855
Ethanol	Sigma-Aldrich	792780
IR140	Sigma-Aldrich	260932
IR780 perchlorate*	Sigma-Aldrich	576409	Discontinued*
Isopropanol	Sigma-Aldrich	650447
N.N.Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
PEG crosslinker	Sigma-Aldrich	757853
PEG-maleimide	Sigma-Aldrich	900339
Tetrachloroauric Acid	Sigma-Aldrich	244597
Tetraethyl Orthosilicate	Sigma-Aldrich	86578
*IR792	Sigma-Aldrich	425982	*Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO)	ThermoFIsher	87724
Centrifugal filters	Millipore	UFC510096
inVia confocal Raman microscope	Renishaw
MATLAB (v2014b)	Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)	Eigenvector research