Particulas de Lentivirus terapia gênica mediada por vetor de hepatócitos Ex Vivo para transplante autólogo em suínos

Resumo

Este protocolo destina-se a descrever o hepatócito porcina isolamento e ex vivo gene entrega para curar modelos de doenças metabólicas através do transplante de células autólogas. Embora este modelo em particular beneficia de vantagens únicas que favorecem a terapia bem sucedida, o aplicativo é uma Fundação relevante para tratar doenças adicionais e indicações.

Resumo

Terapia gênica é a escolha ideal para curar muitos erros inatos do metabolismo do fígado. Ex-vivo, vetores de Lentivirus terem sido utilizadas com sucesso no tratamento de muitas doenças hematopoiéticas em seres humanos, sua utilização oferece a expressão do transgene estável devido à capacidade do vetor para integrar o genoma do hospedeiro. Este método demonstra a aplicação ex vivo da terapia do gene dos hepatócitos para uma grande modelo animal de tirosinemia hereditária tipo eu. Este processo consiste em 1) isolamento dos hepatócitos primários do animal doador/beneficiário autólogo, 2) ex vivo entrega de gene via transdução de hepatócitos com um vetor de Lentivirus e 3) autólogo transplante de hepatócitos corrigidos através do portal injeção da veia. Sucesso do método baseia-se geralmente em cima da remoção eficiente e estéril da ressecção hepática, cuidadosa de manipulação do espécime extirpado para isolamento dos hepatócitos viáveis suficientes para transdução re-engrafting, alta porcentagem de células isoladas, e procedimentos cirúrgicos assépticos por toda parte para prevenir a infecção. Falha técnica em qualquer dessas etapas irá resultar em baixo rendimento dos hepatócitos transduzidos viáveis para transplante autólogo ou infecção do animal doador/beneficiário. O modelo de porco de tirosinemia hereditária humana tipo 1 (HT-1) escolhido para esta abordagem é excepcionalmente favorável para tal método, como até mesmo uma pequena porcentagem de enxertia das células corrigidas levará para repovoamento do fígado com células saudáveis com base em um poderoso vantagem seletiva sobre hepatócitos nativo-doentes. Embora esta selecção de crescimento não será verdadeira para todas as indicações, esta abordagem é uma Fundação para expansão em outras indicações e permite a manipulação deste ambiente para tratar doenças adicionais, ambos dentro do fígado e para além dele, enquanto controle para a exposição ao vetor viral e oportunidade para toxicidade fora do alvo e tumorigenicidade.

Introdução

Erros inatos do metabolismo do fígado são uma família de doenças genéticas que afetam coletivamente como muitos como 1 em 800 nascidos vivos¹. Muitas destas doenças são único gene defeitos² e podem ser curadas funcionalmente através da introdução de uma única cópia corrigida do gene afetado em um número suficiente de hepatócitos³. Percentagem efectiva de hepatócitos que precisa ser corrigido varia de acordo com a doença de⁴ e é largamente dependente da natureza da proteína que ele codifica, por exemplo, excretadas proteínas contra citoplasmática. Na maioria dos casos, a eficácia de qualquer tratamento para a doença metabólica é facilmente analisada através da presença de biomarcadores, muitas vezes disponíveis na circulação.

HT-1 é um erro inato do metabolismo do fígado que resulta de um defeito no fumarylacetoacetate hidrolase (FAH)⁵, a última etapa enzimática em tirosina metabolismo⁶. Deficiência de FAH conduz a compilação de metabólitos tóxicos no fígado que pode causar morte e insuficiência hepática aguda ou na forma crônica da doença pode causar cirrose e carcinoma hepatocelular. Clinicamente, a doença é gerenciada pela administração de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), um inibidor de pequenas moléculas de uma enzima montante de FAH no metabolismo da tirosina. A doença fornece um ambiente ideal testar métodos de terapia de gene, como correção de sucesso de até mesmo um pequeno número de hepatócitos eventualmente resultará no repovoamento do fígado inteiro com células corrigidas em modelos animais pequenos e grandes ^{7 , 8}. isso ocorre porque corrigido as células têm uma vantagem de sobrevivência profunda sobre células não corrigidas devido ao acúmulo de metabólitos tóxicos no último. A perda de hepatócitos não corrigidas permite a expansão seletiva dos hepatócitos corrigidos consistente com a capacidade regenerativa do fígado. Tratamento pode ser seguido facilmente medindo a diminuição nos níveis de tirosina e succinylacetone após transplante circulante.

Para justificar a natureza invasiva do procedimento, que inclui uma hepatectomy parcial, o objectivo desta abordagem deve ser uma cura durável. Portanto, vetores de Lentivirus incompetente de replicação são usados porque eles estàvel integrará no hepatócito genoma⁹. garantindo a entrega do gene corrigida de todas as células-filhas como o fígado cresce e se expande para substituir a rápida perda de células não corrigidas. Isto é vantajoso sobre vetores virais adeno-associado (AAV), que existe principalmente como episomes que só podem ser passados para uma única célula-filha durante a mitose¹⁰ , perdendo assim qualquer efeito da terapia em questão de semanas.

Apesar de um crescente corpo de literatura oferece suporte a segurança de lentivirus¹¹, preocupações sobre genotóxicos eventos são atenuados, limitando a transdução das células do hospedeiro a um ambiente controlado em vitro . Vetor livre nunca sistemicamente é introduzido para o host quando este método é executado, limitar a exposição para os hepatócitos que será re-introduzida com transplante autólogo através da veia portal.

Este relatório descreve o método da cirúrgica e procedimentos ex vivo usados para isolar os hepatócitos para gene terapia ex vivo e posterior transplante autólogo¹² para o tratamento do porco HT-1⁸. O processo completo inclui 1) uma hepatectomy parcial que serve como uma fonte de hepatócitos e um estímulo de crescimento para o fígado do hospedeiro, 2) isolamento dos hepatócitos do fígado extirpado seguido por ex vivo correção do gene e, finalmente, 3) reintrodução do hepatócitos corrigidos de volta para o host. O método descrito é aplicável a todos os modelos animais grandes, com algumas modificações, mas apenas o FAH-deficiente porco¹³ terá a vantagem do ambiente seletivo para hepatócitos corrigidos.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram realizados em conformidade com as orientações institucionais e foram revistos e aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) antes da realização do estudo. Procedimentos descritos aqui foram realizados em suínos machos e fêmeas branco grande fazenda (base genética de 50% Landrace/50% Large White) até 3 meses de idade que são considerados saudáveis e adequados para a cirurgia.  Os animais estão alojados socialmente excepto se for considerada incompatível pela equipe institucional cuidados veterinários.  Os animais são alimentados níveis adequados de chow duas vezes diária e observado para os sinais clínicos pela equipe de cuidados pelo menos uma vez por dia.

1. preparação para a cirurgia

1. Administre 5 mg/kg de telazol e xilazina 2 mg/kg por via intramuscular para induzir sedação. Administrar a buprenorfina SR por via subcutânea na dose de 0,18 mg/kg para analgesia pós-operatória (antecipado de analgesia desta dose será até 72 h). Verificar manualmente o animal para respostas verificar se a sedação.
2. Uma vez sedado, inserir um cateter intravenoso na veia periférica orelha para acesso farmacológico.
3. Administre a cefazolina 25mg/kg por via intravenosa e intramuscular 5 mg/kg de ceftiofur pré-operatório.
   1. Administre o soro por via intravenosa para manter a pressão arterial e frequência cardíaca dentro dos limites fisiológicos normais durante todo o procedimento.
4. Coloca um tubo orogástrico para descomprimir o estômago. Realizar intubação endotraqueal com um tubo endotraqueal de tamanho adequado, verificar a correcta colocação comprimindo o peito manualmente para detectar exalação e então, ventilar mecanicamente o animal com isoflurano 1 – 3%.
5. Coloque pistas de eletrocardiograma (ECG), esfigmomanômetro, sonda de temperatura e oxímetro de pulso para monitorar e gravar os sinais vitais. Coloque o animal em posição supina, esfregue o abdômen da caixa torácica, a pélvis com betadine e drapeje sterilely.
6. Ventile o assunto com 1-3% de isoflurano durante o procedimento de manter um plano cirúrgico da anestesia. Continuar a monitorar os sinais vitais para mudanças e ajustar o isoflurano em conformidade para manter o ritmo cardíaco em níveis de pré-incisão se gotas de pressão arterial dramaticamente, reduzem o isoflurano e início agentes autorizados institucionalmente para restaurar a vitalidade, tais como epinefrina intravenosa.
   1. Gravar o ritmo cardíaco, ritmo respiratório, pressão arterial e temperatura corporal em um registro de procedimento cirúrgico para controlar e manter o bem-estar dos animal, conforme política de instituição específica para garantir o cumprimento das normas de bem-estar dos animais grandes.

2. laparoscópica Hepatectomy parcial

1. Execute a porta inicial entrada de site usando uma técnica aberta de Hassen cefálica para o umbigo. Quando o peritônio é visualizado, com segurança, introduza um trocarte de 12 mm na cavidade abdominal. Passe um 5mm, 30°, o escopo deste porto.
2. Insufle o abdômen com CO₂ a 15 mmHg. Sob visualização directa com a câmera laparoscópica, coloque duas portas adicionais 5mm triangular no lóbulo lateral esquerdo do fígado. A colocação exata das portas vai depender tamanho e anatomia do animal.
   1. Neste ponto, coloque o laparoscópio em uma das portas de 5 mm.
3. Identifica o segmento lateral esquerdo do fígado no ponto de maior fissura de lóbulo esquerdo. Esta fissura separa os segmentos laterais esquerdos e médicos. Proteger as estruturas portal juntamente com a veia hepática ao longo desta fissura usando um grampeador cirúrgico (ver Tabela de materiais). Transecto o parênquima através desta fissura usando disparos sequenciais do grampeador usando cargas de tempo vascular de 30 mm, 45 ou 60.
   1. Quando parenquimatosa ressecção completa, avalie o fígado remanescente para garantir a adequada hemostasia. Controle qualquer sangramento do parênquima com cauterização ou sutura.
4. Recupere a fígado seção usando alavancas endoscópicas e um saco de recuperação de tecido endoscópica.
5. Remover as portas e fechar a incisão do porto de 12 mm em três camadas com sutura interrompida tamanho 0 para a fáscia da linha mediana, uma execução sutura 2-0 para a camada dérmica profunda e uma execução sutura de 4-0 para a camada subcuticular. As portas de 5 mm podem ser fechadas em uma camada com 2-0.
6. Coloque um curativo estéril sobre as incisões (ver Tabela de materiais).
7. Quando as células estará prontas em menos de 4 horas, manter os animais sob anestesia geral no período pós-operatório até a hora do auto-implante.
8. Alternativamente, se manipulações de célula requerem períodos mais longos (como para permitir a formação de esferoides hepatócito ou longos períodos de transdução/seleção, com base em aplicativos individuais deste método) permitir que o animal se recuperar da anestesia e repetir a etapas de indução anestésica antes auto-implante quando as células estão prontas.

3. hepatócito isolamento

1. Conecte uma bomba peristáltica com perfusão conjunto para fornecer soluções de dispersão quente (mantidas em banho de água de 43 ° C) para cateteres para ser colocado nos grandes vasos expostos da seção de fígado, tal que a temperatura da solução é de 38 ° C, após a introdução no tecido. Todos os tubos, equipamentos e soluções devem ser mantidas estéril para garantir que as células são adequadas para transplante.
   1. Primeiro a bomba e o tubo com Per II até uma torneira de passagem posicionado para alternar entre por eu e entrega por II para o tecido. Mudar a torneira para o Per I Posicione e prime o resto do conjunto de tubos, preenchendo um borbulhador em linha completamente para evitar a introdução de bolhas de ar no tecido.
2. Preparar um corte perpendicular à circulação para revelar as seções transversais dos ramos da veia porta hepática de transverso limpo e hepática veias para cateterização.
3. Cateterismo das veias expostas disponíveis com um cateter de confortável-encaixe para evitar a fuga do perfusato. Canule pelo menos 1 portal e 1 veia hepática para garantir adequada perfusão do tecido.
   1. Certifique-se de que os catheter(s) é aprontadas/livre de ar antes de colocar o cateter na veia.
4. Perfundir com morno por eu a 100 mL/min, movendo-se o tubo de saída da veia a veia a cada 30 segundos para 1 min. ciclo por todas as veias disponíveis para 15-20 min. Durante Per I infusão, defina um tubo de evacuação para esvaziar a bandeja de procedimento em um recipiente de resíduos sob vácuo.
5. Mudar para por II a 100 mL/min, andar de bicicleta nas veias como com por que, para um total de 30 min. Durante Per II, use uma bomba de retorno para reciclar II por volta para o reservatório para re-administração conservar a preparação da enzima activa. Conjunto da bomba de retorno a menos que a bomba de saída (isto é, 94 mL/min), tomando cuidado para não voltar ar excessiva no frasco de origem.
   1. Se quebrar a cápsula hepática, este tempo pode ser reduzido.
   2. Se o fígado não é totalmente digerido (não permaneça ondeado com ligeira pressão focal) um adicional 5 min de perfusão pode ser executada.
6. Ocasionalmente (aproximadamente a cada 5 minutos) documentar a temperatura da superfície do borbulhador e/ou fígado para garantir os hepatócitos não estão esfriando. Se o fígado está esfriando (< 35 ° C) aumentar o calor do banho-maria para restaurar a temperatura do fígado mais perto de 38 ° C. O fígado deve blanche que procede a perfusão.
7. Remova o fígado a placa estéril ou placa de Petri para transporte para capa de cultura de células. Campo estéril de tampa com um pano estéril para manter a integridade durante o processamento do hepatócito.
8. Expor a seção fígada de cortina estéril e submergir o fígado com mídia de lavagem do hepatócito frio (HWM). Rompa a cápsula, arrastando a tesoura na parte superior. Usar luvas estéreis, Massageie suavemente o fígado para liberar os hepatócitos entram no meio.
9. Filtre a HWM contendo hepatócitos através de gaze estéril, em frascos de centrífuga grande (~ 200 mL). Lave os hepatócitos através do seguinte procedimento em triplicado, combinando o centrifugado pelas várias garrafas após o primeiro ressuspensão (conforme aplicável):
   1. Centrífuga em 50 x g, 5 min, 4 ° C.
   2. Aspirar e ressuspender em 150 mL de HWM.
   3. Deixe a pelota em HWM após a lavagem 3^rd .
10. Concentração de contagem celular usando um hemocytometer ou outro dispositivo, como disponível. Estas células estão agora prontas para manipulação de ex vivo de interesse, incluindo a terapia de gene, célula classificação ou outra especialização antes esquistossomática. Volume final de HWM pode ser ajustado para atingir uma concentração específica (células/mL).

4. hepatócito transdução

1. Resuspenda hepatócitos em mídia (meio de eagle modificado de Dulbecco [DMEM], 10% de soro fetal bovino [FBS], penicilina-estreptomicina, 4 ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic [HEPES], dexametasona, fator de crescimento epidérmico [EGF] e NTBC) no 1-2 milhões de células por mL em um tubo cônico no gelo.
2. Descongelar o vetor de Lentivirus à temperatura ambiente e adicionar ao tubo cônico no gelo na multiplicidade de 20 alvo de infecção (MOI) para ligar as células. Gire as células a 4 ° C a 10 rpm para 90 min vincular o vetor viral à superfície da célula.
3. Transferi os tubos a 37º C por 30-40 min invertido a mistura a cada 5 minutos para facilitar o vetor transducing as limite células.
4. Centrifugar as células a 50 x g a 4 ° C por 4 min. Ressuspender centrifugado em soro fisiológico na concentração desejada no gelo. Repeti esta lavagem para garantir a remoção de qualquer vetor desvinculado da preparação.
5. Se possível, placa alíquotas suficientes de células (ou seja, 500.000 células por poço em um 6 bem celular placa de cultura) para verificar a viabilidade, eficiência de transdução, adesão, etc.
   Nota: Muitas vezes não é possível avaliar estes parâmetros antes auto-implante, especialmente para os procedimentos do mesmo dia. Por exemplo, o procedimento descrito neste documento empregou um cDNA Fah não marcado sob o controle do Alfa-1 antitripsina específicos do fígado promotor, que não foi prontamente assayable nos hepatócitos antes da transplantação. No entanto, estas células chapeadas podem ser analisadas na sequência o auto-implante como indicador de sucesso de transdução (i.e., através de mancha ocidental) ou um predictor do sucesso geral do procedimento.

5. hepatócito transplante

1. Identifica a veia porta através do ultra-som, usando um transdutor de 2 a 5 MHz. Dirigir um 18g, agulha de 5 polegadas para a veia porta principal proximal à sua bifurcação.
2. Começa a infusão manual lento de cima 1 x 10⁹ hepatócitos (aproximadamente 10 g), utilizando uma seringa. Monitor portal pressões durante transplante utilizando um cateter de infusão.
   1. Se as pressões portal aumentam mais de 8 mmHg acima da linha de base, pausar a infusão e permitir que a pressão retorne aos níveis de base.
   2. Se as pressões portal não retornar à linha de base após a pausa infusão por 5 minutos, descontinuar a infusão.
3. Após o transplante e remoção do cateter, use o ultra-som para avaliar a presença de eventos trombóticos e encaminhar o fluxo na veia portal.

6. manutenção e recuperação de pós-operatório

1. Mover-se sujeitos a uma área de recuperação adequada e observar até que o animal é totalmente ambulatorial, monitoramento frequência cardíaca, saturação de oxigênio e temperatura corporal cada 15-30 min. manter a temperatura do corpo com cobertores ou um envoltório de ar aquecido, conforme necessário.
2. Administre o Omeprazol 1mg/kg por via oral diariamente (até o final do estudo) para reduzir as chances de ulceração gástrica, o que pode ocorrer com crises de inappetence.
3. No pós-operatório, o animal é monitorado de perto pelo laboratório e pessoal veterinário e normalmente não requer medicação para dor adicional separada a dose pré-operatória buprenorfina.  Se são observados sinais de desconforto/dor pelo pessoal qualificado cuidados veterinários (incisão guardando, inappetence, letargia), agentes anti-inflamatórios (i.e., carprofeno) podem ser administrados.

7. receitas

1. Consulte a tabela 1 para receitas utilizadas neste protocolo.

Reagente	HWM	Reagente	Por que (10x)	Por II (10x)
Williams-E pó (g/L)	10,8	NaCl (g/L)	83	39
NaHCO3 (g/L)	2.2	KCl (g/L)	5	5
HEPES (g/L)	2.6	HEPES (g/L)	24	240
Caneta/Strep (100 x, mL/L)	10	EGTA (g/L)	9.5	-
Soro fetal bovino (mL/L)	100	N-acetil-L-cisteína	8	8
pH	7.3	(N-A-C, g/L)
		Nitroglicerina (mL/L)	5	5
		CaCl2 2 H2O (g/L)	-	7
		Colagenase D (mg/mL)	-	0.2
		pH	7.4	7.6

Tabela 1: Receitas de soluções utilizadas no isolamento de hepatócitos do fígado seções.

Resultados

A ressecção hepática e transplante autólogo são representados esquematicamente na Figura 1. Em uma coorte representativa de 5 porcos, que foram submetidos a ressecção hepática, a maioria tinha rendimentos de > 1 x 10⁹ hepatócitos com viabilidade de aproximadamente 80% (tabela 2), fornecendo a abundância de células para qualquer tipo de desejado manipulações, incluindo gene terapia. Cultura subsequente da parte não-tra...

Discussão

Este relatório descreve uma ex vivo gene autólogo terapia abordagem para curar um modelo suíno de HT-1. Envolve uma hepatectomy parcial, seguido por ex vivo hepatócito isolamento e transdução de hepatócitos isolados com lenti vírus carregando o transgene corretivo. Hepatócitos autólogos corrigidos então são transplantados para o animal deficiente FAH através da veia porta⁸. Embora o método descrito é aplicável a todos os modelos animais grandes, com algumas modifi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314