Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Resumo

Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.

Resumo

Zebrafish são capazes de regenerar vários órgãos, incluindo os apêndices (aletas) após amputação. Isso envolve a regeneração do osso, que regrows dentro de aproximadamente duas semanas após a lesão. Além disso, zebrafish são capazes de curar ossos rapidamente após a trepanação do crânio e reparar fraturas que podem ser facilmente introduzidas em raios de barbatana ósseas zebrafish. Estes ensaios de lesões representam paradigmas experimentais viáveis para testar o efeito de drogas administradas em rapidamente formando o osso. Aqui, descrevemos o uso destes modelos 3 lesões e seu uso combinado com tratamento glicocorticoide sistêmico, que exerce efeitos inibitórios e imunossupressoras de osso. Nós fornecemos um fluxo de trabalho sobre como se preparar para tratamento imunossupressor no zebrafish adulto, ilustram como realizar amputação de barbatanas, trepanação de raspagem ossos e fraturas de barbatana e descrever como o uso de glicocorticoides afeta ambos osso formando osteoblastos e células da linhagem de monócitos/macrófagos como parte da imunidade inata no tecido ósseo.

Introdução

Zebrafish representam um poderoso modelo animal para estudar a doença e desenvolvimento de vertebrados. Isto é devido ao fato de que eles são pequenos animais que se reproduzem muito bem e que o seu genoma é totalmente sequenciado e passível de manipulação¹. Outras vantagens incluem a opção de executar a imagem ao vivo contínua em diferentes fases, incluindo no vivo por imagens do zebrafish adulto²e a capacidade de executar telas de drogas de alto throughput em zebrafish larvas³. Além disso, o zebrafish possuem uma alta capacidade regenerativa em uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o osso e, portanto, servir como um sistema útil para estudar a doença do esqueleto e reparar^4,5.

Osteoporose induzida por glicocorticoide (GIO) é uma doença que resulta do tratamento a longo prazo com glicocorticoides, por exemplo, no curso de tratamento de doenças auto-imunes, tais como de asma ou artrite reumatoide. GIO desenvolve-se em cerca de 30% dos pacientes tratados com glicocorticoides e representa uma grande saúde questão⁶; Portanto, é importante investigar o impacto da imunossupressão no tecido ósseo em grande detalhe. Nos últimos anos desenvolveram-se uma variedade de modelos de zebrafish, lidando com a patogênese da GIO. Perda óssea mediada por glicocorticoide tem sido induzida no zebrafish as larvas, por exemplo, que levou à identificação de compostos antídoto, aumentando a massa óssea em uma droga tela⁷. Além disso, efeitos inibitórios óssea induzida por glicocorticoides têm sido imitados no zebrafish escalas tanto in vitro e in vivode^8,9. Estes ensaios são muito convincentes abordagens, especialmente quando se trata de identificação de novos medicamentos imunossupressores e osso de anabólico. No entanto, eles apenas parcialmente levam em conta o endoesqueleto e não tem sido realizados num contexto regenerativo. Assim, eles não permitem a investigação dos efeitos mediados por glicocorticoide durante rápidas modos de formação do osso adulto, regenerativa.

Aqui, apresentamos um protocolo que permite aos pesquisadores estudar os efeitos mediada por glicocorticoide em ossos de zebrafish adultos submetidos a regeneração. Modelos de lesão incluem amputação parcial de zebrafish barbatana caudal, trepanação do crânio, bem como a criação de fraturas de raio de barbatana (figura 1A-1-C) e são combinados com glicocorticoides exposição através de incubação (Figura 1E ). Recentemente usamos uma parte do presente protocolo para descrever as consequências da exposição a prednisolona, um dos medicamentos comumente prescritos corticosteroides, em adultos do zebrafish regenerando fin e crânio osso¹⁰. No zebrafish, administração de prednisolona leva à proliferação osteoblástica diminuída, diferenciação osteoblástica incompleta e rápida indução da apoptose na linhagem monócitos/macrófagos¹⁰. Neste protocolo, também descrevemos como fraturas podem ser introduzidas na única barbatana ósseas ray segmentos¹¹, como esta abordagem pode ser útil quando estudando efeitos mediados por glicocorticoide no osso ocorrendo durante o reparo de fratura. Os métodos apresentados aqui ajudarão a mais endereço subjacente mecanismos de ação do glicocorticoide em rápida regeneração óssea e também podem ser empregados em outras configurações de administração de drogas sistêmicas no contexto da regeneração de tecidos do zebrafish.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Landesdirektion Dresden (permitir números: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, 24-9168.11-1/2011-52 AZ, AZ 24-9168.11-1/2013-5, 24-9168.11-1/2013-14 AZ, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. preparação de materiais e soluções

Nota: Prednisolona, como outros glicocorticoides, leva à imunossupressão. Assim, as precauções devem ser tomadas para prevenir a infecção em animais tratados durante o experimento. Para esse efeito, mercadorias de vidro de autoclave e 'peixe água' (ou seja, a água que é usada para traseira zebrafish adulto) antes de iniciar o experimento.

1. Calcule o número de zebrafish para ser usado no experimento. Não se esqueça de incluir os indivíduos que servem como controles.
2. Provetas de vidro autoclave a 600 mL que são cobertas com folha de alumínio com fita de autoclave. Zebrafish será tratado individualmente, assim 1 copo copo é exigido por zebrafish.
3. Calcule a quantidade de peixes de água necessária para o experimento. 300 mL são necessários por pessoa e dia. Levar em consideração o comprimento da experiência (por exemplo, 1 semana/7 dias).
4. Encha os frascos de vidro com água de peixe, feche-os e autoclave as garrafas com fita de autoclave. Idealmente, use garrafas de 2 L, mas outros frascos de 1 L ou 5 L podem ser usados também.
   Nota: Se as experiências são longas (por exemplo, 4 semanas/28 dias) e a quantidade de garrafas de vidro é limitada, certifique-se de preparar garrafas para um mínimo de vários dias de cada vez e repita o processo (1.3 para 1.4) durante todo o experimento.
5. Prepare uma solução stock de prednisolona de prednisolona 100mm estéril filtrada em dimetilsulfóxido (DMSO). Congele o estoque em 1 mL ou alíquotas de tubo 2 mL microcentrifuge.
   Cuidado: Sempre desgaste protetor roupa quando trabalhando com prednisolona (luvas, óculos de segurança, jaleco).
6. No primeiro dia do experimento, prepare soluções de incubação com prednisolona e DMSO, respectivamente. Para este fim, descongele a quantidade necessária de solução-mãe de prednisolona 100mm e adicionar prednisolona a água esterilizada peixe em uma concentração final de 50 µM.
   1. Para os tratamentos de controle, adicione o volume correspondente de DMSO a água esterilizada peixe. Por exemplo, para produzir água de peixe contendo 2L prednisolona, adicione 1 mL de estoque de prednisolona 100 mM para 2 L de água de peixes. Em outra garrafa de 2 L de água do peixe, adicione 1ml DMSO, correspondentemente.
   2. Trabalhar em local apropriado que é designado para realizar tratamentos com drogas, idealmente em um quarto a 27 ° C.

2. geração de lesões em barbatanas de Zebrafish

Nota: Para ferir o osso no zebrafish barbatanas, realizar a ressecção da nadadeira (amputação, geralmente na barbatana caudal) ou fratura raios individual de barbatana ósseas (modelo de fratura). Para este fim anestesiar zebrafish adulto primeiro.

1. Amputação
   1. Para anestesiar zebrafish adulto, prepare-se um diâmetro de 100 mm placa de Petri contendo 0,02% MS-222 (Metanossulfonato de-3-aminobenzoato de etilo) em água de peixe (a água não precisa ser esterilizada).
      1. Transferir um zebrafish cada vez para o prato de Petri contendo MS-222 por meio de uma rede de pesca e incube-lo até que ele encontra-se em seu lado sem movimento e não responder ao toque. Teste o último tocando a nadadeira anal com fórceps rombudo.
      2. Espere até o nível 4 de anestesia é alcançado o que é o nível apropriado para ressecção de barbatana¹². Nesta fase, a taxa de movimento odontódios é diminuída, tônus muscular é perdido e o peixe não se move em cima do toque¹².
   2. Leve fórceps rombudo e transferir o zebrafish anestesiado com cuidado a tampa invertidos a 100 mm placa de Petri. Coloque o zebrafish na parte lateral. Certifique-se do zebrafish sempre mentem na mesma orientação, por exemplo, no seu lado direito do corpo. Com um bisturi ou uma lâmina de barbear, ressecar 50% da nadadeira (figura 1A, 2A).
      Nota: A velocidade de regeneração de barbatana zebrafish depende da quantidade de tecido ressecado barbatana, ou seja, o tecido mais de barbatana é ressecado, quanto mais rápido a barbatana regenera¹³. Assim, para minimizar as variações na regeneração de barbatana certifique-se de sempre ressecar a barbatana do mesmo nível no zebrafish todos.
   3. Transferi o zebrafish ferido para um copo de vidro esterilizado contendo 300 mL de prednisolona ou DMSO contendo água esterilizada peixe. Cobrir o copo de vidro com papel de alumínio para evitar a fuga do zebrafish.
   4. Repita as etapas 2.1.2 para 2.1.3 até que seja atingido o número necessário de zebrafish para o experimento.
2. Fratura de barbatana
   1. Prepare uma agarose-revestido 100 mm placa de Petri aquecendo uma solução de agarose 2% em água de peixe ou E3 (embriões 3, 50mm de cloreto de sódio, cloreto de potássio de 0,17 mM, 0,33 mM de cloreto de cálcio, sulfato de magnésio 0,33 mM). Com cuidado, despeje aproximadamente 10 a 15 mL da solução de Petri. O fundo do prato deve ser completamente coberto. Deixe o agarose solidificar.
   2. Anestesiar o zebrafish conforme descrito na seção 2.1.
   3. Leve a fórceps rombudo e transferir o zebrafish anestesiado com cuidado para a agarose-revestido 100 mm placa de Petri. Coloque o zebrafish na parte lateral. Sob o microscópio de dissecação, espalhe a barbatana caudal completamente para ser capaz de identificar os raios da barbatana ósseas distintas e fin ray segmentos. Certifique-se do zebrafish sempre mentem na mesma orientação, por exemplo, no seu lado direito do corpo.
   4. Com uma agulha de injeção (0,3 x 13 mm) apresente uma fratura no centro de um segmento de ray barbatana ósseas (figura 1B). Para fazer isso, a agulha é colocada ligeiramente o segmento até que uma rachadura apareça (seta na Figura 2B). Enquanto uma pressão suave leva à fratura de apenas um dos hemirays opostos dois mais fortes pressão levará à fratura de ambos os segmentos hemiray.
      1. Não introduza muitas fraturas em barbatanas, pois isto prejudicará grandemente a estabilidade da nadadeira. Como sugestão, aplica fraturas apenas em 3 a 5 raios de barbatana.
      2. Sempre produzir fraturas em segmentos correspondentes através de raios diferentes barbatana e zebrafish, por exemplo em raios da barbatana dorsal 3, 7 (ou 8) e ventral fin ray 3. O nível proximal-distal da fratura é ideal em 3 segmentos proximais dos raios da barbatana bifurcação ponto ¹¹.
   5. Transferi o zebrafish ferido para um copo de vidro esterilizado contendo 300 mL de prednisolona ou DMSO contendo água esterilizada peixe. Cobrir o copo de vidro com papel de alumínio para evitar a fuga do zebrafish.
   6. Repita os passos 2.2.2 para 2.2.5 até que seja atingido o número necessário de zebrafish para o experimento.

3. geração de lesões crânio raspagem (trepanação)

Nota: A Calvárias no zebrafish são homólogas aos ossos raspagem em mamíferos. Assim, estes ossos exoskeletal¹⁴ representam um tecido de especial interesse quando estudar a patogênese da GIO. Para ferir o crânio, trepanação é executada por um furação do frontale so e/ou sistema operacional parietale (Figura 1, C 2) com a ajuda de um microdrill¹¹.

1. Anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1.
2. Segure o zebrafish anestesiado na posição vertical com a pinça, para que os ossos de raspagem são bem visíveis sob um microscópio de dissecação da acima (Figura 1).
3. Localize o microdrill rotativa no centro do osso frontal (sistema operacional frontale) e tocar o osso. O buraco produzido é do tamanho da rebarba do microdrill (500 µm, Figura 2, Figura 3B).
   Nota: Certifique-se de não mover o microdrill lateralmente ao produzir a lesão. Também pare imediatamente quando a resistência do osso de repente cai. Não faça qualquer um mais, caso contrário, o cérebro será danificado ¹⁵.
4. Transferi o zebrafish lesionado para uma gaiola cheia de água de peixe até que ele se recupere totalmente da anestesia. Vê-lo com cuidado.
5. Transferi o zebrafish lesionado para uma água de peixes além de prednisolona ou copo de vidro contendo DMSO.

4. tratamento de Zebrafish durante a incubação

Nota: Durante a aplicação de prednisolona/DMSO, o medicamento contendo peixes água precisa ser mudada diariamente, e zebrafish precisam de ser alimentados regularmente.

1. Mudanças de água
   1. Para trocar a água de peixes, descongelar o estoque de prednisolona 100mm e preparar a quantidade necessária de 50 prednisolona µM em peixes autoclavados água fresca todos os dias do período de tratamento. Prepare o DMSO contendo água do peixe para o controle do zebrafish conformemente.
   2. Tomar um copo de vidro contendo um único zebrafish alojado em sua solução de incubação e transferir a solução, incluindo o zebrafish em um recipiente apropriado, por exemplo, uma gaiola de habitação temporal.
      Nota: Sempre usar recipientes separados de intercalar para prednisolona e DMSO trataram zebrafish, respectivamente, para certificar-se de DMSO controle zebrafish não ficam expostas a prednisolona e vice-versa.
   3. Encha o copo de vidro com droga fresca contendo água de peixe (300 mL).
   4. Transferi o zebrafish do recipiente provisório para o copo de vidro contendo solução de incubação fresco usando uma rede de pesca. Colocar de volta o papel alumínio para evitar a fuga do zebrafish.
   5. Se o tempo da experiência superior a 2 semanas, troca os copos de vidro.
2. Alimentação
   1. Não alimente zebrafish durante tratamentos curtos (para até 2 dias). Durante experimentos mais, alimente zebrafish. Tome especial cuidado para evitar a poluição da solução de incubação. Assim, alimentação com Artemia SSP. em vez de com comida floco e somente em cada segundo dia.
      Nota: Artemia são regularmente usados para alimentar o jovem zebrafish e deve estar disponível na unidade haltering zebrafish.
      1. Cerca de 2 h antes da água do peixe é trocada, alimentar o zebrafish com Artemia ssp seus copos de vidro. Para fazer isso, use uma pipeta plástica e avanço de 0,5 a 1 mL de solução de Artemia eclodida por copo de vidro.
      2. Esperar por 2h e trocar a solução de incubação com drogas fresca contendo água de peixes, de acordo com a seção 4.1.

5. as análises de amostras

Nota: Após a incubação de zebrafish ferido em prednisolona e DMSO contendo água de peixe, respectivamente, ou realizar análises de mineralização/calcificação do osso (5.1 para 5.3) ou realizar imagens ao vivo de zebrafish sob o microscópio de dissecação (5.4) ^10,11,16. Uso de imagens ao vivo para determinar o comprimento regenere barbatana e para detectar diferenças na expressão do gene repórter no zebrafish transgênico.

1. Fixação de tecidos de interesse
   1. Para a fixação das aletas e/ou crânios preparar paraformaldeído 4% (PFA) em PBS e congelar a-20 ° C para armazenamento. Utilizar recentemente preparadas 4% PFA em PBS ou descongele a quantidade necessária antes da utilização. Como alternativa, 2% PFA em PBS pode ser usado.
      Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado sob uma coifa. Utilizar vestuário de protecção.
   2. Para a fixação das barbatanas, preparar um pequeno prato de Petri (por exemplo, 30 mm) com frio 4% PFA em PBS e certifique-se de que o fundo do prato é totalmente coberto. Para a fixação de crânios, preparar um pequeno frasco de vidro com tampa ou um tubo com frio 4% PFA em PBS.
      Cuidado: Punho PFA contendo soluções somente sob a coifa como é tóxico. Utilizar vestuário de protecção.
   3. Colheita no tecido de interesse.
      1. A colheita se regenerando tecido barbatana ou barbatanas com fraturas anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1 ou eutanásia o zebrafish de acordo com a secção 5.1.5.
      2. Transferi o zebrafish anestesiado para a tampa de uma caixa de Petri. Usando um bisturi ou lâmina de barbear, colha a regenerar de barbatana. Certifique-se de incluir tecido do tronco em regeneração barbatanas para facilitar a manipulação do tecido colhido.
   4. Corrigi as barbatanas flat no PFA contendo placa de Petri a 4 ° C durante a noite. Fixação plana evita ondulando acima do tecido barbatana durante a fixação.
      1. Para corrigir plana, pegue o tecido da aleta com uma pinça bem na borda dorsal ou ventral do coto e mergulhá-lo na solução de fixação. Agarre a borda oposta do coto com uma segunda pinça fina e pressione ligeiramente o tecido para o fundo do prato.
      2. Segure por 10 a 20 s antes de liberar. O tecido de barbatana não deve enrolar mais. Se isso acontecer, repita.
   5. Eutanásia em zebrafish para colher tecido crânio lesionado. Preparar um diâmetro de 100 mm placa de Petri contendo 0,1% MS-222, em água de peixe. Transferi um zebrafish cada vez para o prato de Petri contendo MS-222 por meio de uma rede de pesca. Quando é atingido o nível 6 de anestesia (colapso medular) espera pelo menos 10 min para garantir a morte do espécime¹².
   6. Usar um bisturi corta fora a cabeça mais um pouco tecido do porta-malas do resto do corpo. Mergulhe o tecido colhido na solução preparada PFA 4% na jarra de vidro ou tubo plástico. Correção para 24 h a 4 ° C, com balanço suave.
   7. Para armazenar as amostras a longo prazo após a fixação, lave-os com PBS (3 x 20 min RT) e metanol-deleite em uma série crescente de metanol (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% metanol em PBS por 20 min cada).
      1. Armazená-los em metanol 100% a-20 ° C. Caso contrário, diretamente proceda com osso manchar ou outras análises após a lavagem com PBS.
2. Técnicas de coloração de osso eu (coloração de vermelho de alizarina)
   Nota: Esta coloração é realizada de acordo com van Eeden et al . 1996¹⁷ e Walker & Kimmel 2007¹⁸ com modificações.
   1. Para realizar a coloração de vermelho de alizarina sobre adultas barbatanas ou crânios, colheita e reparar o tecido, conforme descrito nas seções 5.1.
   2. Se as amostras foram armazenadas em metanol a-20 ° C, reidratar amostras, fazendo uma série de metanol inversa (70%, 50% e 30% em PBS, cada 1 x 20 min) e lavar duas vezes 20 min com PBS. Lave as amostras por 5 min mínimo com água desionizada.
   3. Para fazer a coloração de vermelho de alizarina em crânios, tratar as amostras com tripsina 50 mg/mL em 30% saturado Na₂B₄O₇ , à temperatura ambiente durante a noite. Amostras de rocha durante este tempo. Amostras de enxágue em 30% Na₂B₄O₇ solução saturada. Lave as amostras com água desionizada, 2 vezes por 5 min cada. Esta etapa não é executada pelo tecido de barbatana.
   4. Adicionar solução de vermelho de alizarina (parte b: 0,5% vermelho de alizarina S pó, 10% de glicerol em água desionizada) e as amostras de rock durante a incubação a RT. Check para coloração após 1, 2, 4 h ou durante a noite.
   5. Para limpar as amostras tratá-los com uma série de glicerol: hidróxido de potássio 1% decrescente (3:1 durante a noite, 1:1 durante a noite, a noite de 1:3).
   6. Armazenar as amostras em solução de hidróxido de potássio 0,1% 1:1:80 % de glicerol e montá-los com 80% de glicerol para a imagem latente.
      Nota: Para combinado Alcian blue/alizarina vermelha manchando amostras de deleite com Alcian azul coloração solução (parte a: 0.02% final Alcian azul, 50 mM MgCl₂, 70% de etanol) após reidratação (seção 5.2.2) por 2 h em RT. Treat aletas com uma série de etanol decrescente em 50 mM MgCl₂ (70%, 50%, 30%, cada 1 x 15 min) e lave-os durante um período mínimo de 1 h (3 x 20 min) em água desionizada. Proceda com vermelho de alizarina, coloração (seção 5.2).
3. Técnicas de coloração II (calceína coloração) do osso
   Nota: Para detectar a deposição de cálcio na barbatana fraturas e lesões de crânio, peixes vivos são incubados em calceína contendo a solução.
   1. Prepare a quantidade necessária de calceína 0,2% em água desionizada (pH 7,5). Certifique-se que o pH é neutro. Use 1 M de NaOH para ajustar o pH.
   2. Incube até 3 zebrafish simultaneamente em 100 mL de solução de calceína por 20 min em um copo de vidro coberto com papel alumínio.
   3. Transferi o zebrafish para um copo com água de peixe. Deixá-los nadar brevemente antes de transferi-los para um novo copo com água de peixe. Deixá-los nadar neste copo de novo por 20 min lavar. Tire fotos (ver secção 5.4).
4. Viver a imagem latente de zebrafish
   1. Use essa abordagem para adquirir imagens de regenerar o tecido ósseo, tais como na barbatana ou crânio durante todo o experimento sem sacrificar o zebrafish. Anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1.
   2. Para adquirir imagens de barbatana regenera, transferi o zebrafish anestesiado para um prato de Petri revestida de agarose (veja a seção 2.2.1 e figura 1B).
   3. Para adquirir imagens de regenerar ossos do crânio, endireite o zebrafish em uma esponja (Figura 1) ou coloque em um prato de agarose-revestido que foi preparado para segurar o porta-malas do zebrafish.
   4. Adquira imagens na ampliação desejada e resolução usando uma configuração de stereomicroscopic.
   5. Retorne o zebrafish para um recipiente com fresco ou drogas que contenham água de peixe.

Resultados

O protocolo apresentado aqui tem sido usado repetidamente para induzir a formação de osso rápida durante a regeneração do zebrafish fin e crânio^10,11,16. Em combinação com o método apresentado da administração de prednisolona, estudos sobre os efeitos do prednisolona durante a regeneração óssea podem ser perseguidos. Por exemplo, estudos sobre a formação óssea e mineralização n...

Discussão

Zebrafish provaram ser úteis em pesquisa esquelética em muitos aspectos. Selecionado mutantes imitam aspectos das doenças humanas, tais como osteogênese imperfeita ou osteoartrite^{23,24,25,26,27}, e as larvas, bem como escalas estão sendo usadas para Identifica compostos anabólicos de osso na molécula pequenas telas^7,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prednisolone	Sigma-Aldrich	P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Blunt forceps	Aesculap	BD027R
Fine forceps	Dumont	91150-20
Scalpel	Braun	5518059
Agarose	Biozym	840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm)	BD Beckton Dickinson	30400
Micro drill	Cell Point Scientific	67-1000	distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter)	Fine Science tools	19007-05
Artemia ssp.	Sanders	425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette)	Alpha Labs	LW4111
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Alizarin red S powder	Sigma-Aldrich	A5533
Alcian blue 8 GX	Sigma-Aldrich	A5268
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Trypsin	Sigma-Aldrich	T7409
Stereomicroscope	Leica	MZ16 FA	with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope	Olympus	MVX10	with Olympus DP71 or DP80 camera