Explorar os efeitos de voo espacial na fisiologia do Mouse usando a plataforma aberta da GeneLab NASA de acesso

Resumo

A plataforma da NASA GeneLab fornece acesso irrestrito para omics preciosos dados de experiências biológicas voos espaciais. Descrevemos como uma experiência típica de rato é conduzida no espaço e como dados de tais experiências podem ser acessados e analisados.

Resumo

Realizar experiências biológicas no espaço requer acomodações especiais e procedimentos para assegurar que estas investigações são executadas eficazmente e eficientemente. Além disso, dada a raridade destas experiências é imperativo que seus impactos ser maximizada. O avanço rápido das tecnologias omics oferece uma oportunidade para aumentar drasticamente o volume de dados produzidos a partir de espécimes preciosos voos espaciais. Para capitalizar este, NASA desenvolveu a plataforma GeneLab para fornecer acesso irrestrito ao voo espacial omics dados e incentivar sua análise generalizada. Roedores (ratos e camundongos) são organismos-modelo comum usados pelos cientistas para investigar impactos biológicos relacionados ao espaço. O recinto que roedores de casa durante o voo espacial são chamados roedores Habitats (anteriormente Animal recinto módulos) e são substancialmente diferentes das gaiolas viveiro padrão em suas dimensões, fluxo de ar e acesso para água e comida. Além disso, devido às condições atmosféricas e ambientais na estação espacial internacional (ISS), os animais são expostos a uma maior concentração de CO₂ . Recentemente, informou que os ratos nos Habitats roedor experimentam grandes mudanças em sua transcriptome independentemente dos animais serem no chão ou no espaço. Além disso, essas alterações foram consistentes com uma resposta hipóxica, potencialmente impulsionada por altas concentrações de CO₂ . Aqui descrevemos como um experimento de roedor típico é executado no espaço, como dados de omics destas experiências podem ser acessados através da plataforma GeneLab e como identificar fatores-chave para esses dados. Usando este processo, qualquer pessoa pode fazer descobertas críticas que poderiam mudar o projeto de missões espaciais futuras e atividades.

Introdução

O objetivo geral do presente manuscrito é apresentar uma metodologia clara de como usar o GeneLab plataforma¹ e roedores como experimentos feitos no espaço da NASA são traduzidos para omics dados para análise. Spacefaring seres humanos estão expostos a inúmeros riscos para a saúde de campos de gravidade alterado, radiação espacial, isolamento da terra e outros fatores ambientais hostis^{2,3,4,5, 6}. experiências biológicas realizadas no espaço e no chão têm ajudado a definir e quantificar esses riscos^{7,8,9,10,11, 12 , 13 , 14}. no espaço, esses experimentos foram conduzidos em outras plataformas orbitais, o ônibus espacial e da estação espacial internacional (ISS). Estes experimentos requer hardware especializado e metodologia, tendo em conta os interesses originais de realizando experiências no espaço, incluindo o tempo limitado de tripulação e o ambiente de microgravidade. Várias plataformas já existem para a realização de experimentos sofisticados no espaço usando a planta, animal e microbiana modelos¹⁵.

Modelos de roedores foram particularmente importantes para fazer avançar a nossa compreensão de como mamíferos, incluindo humanos, respondem à exploração espacial. Estes incluem o impacto da exploração espacial no músculo estrutura^16,17,18 e as funções imunológicas^19,20,21. As gaiolas viveiro padrão usadas para roedores habitação na terra não são adequadas para experimentos de voo espacial^22,23. Portanto, acabou a anos e ratos foram voados e alojados em gaiolas diferentes, incluindo a Agência Japonesa de exploração Aeroespacial (JAXA) Habitat gaiola²⁴, animal carregando cápsulas espaciais utilizadas na BION-M1 não tripulados satélite russo^{25 ,26,27}, os ratos gaveta sistema (MDS) desenhado pela agência espacial italiana^28,29,30, a NASA Animal cerco módulo (AEM) e agora a NASA Roedor transportador e Habitats²³. Experimentos de roedores começaram a bordo do ônibus espacial usando gaiolas referidas como módulo de gabinete o Animal (AEM). Este equipamento foi usado em 27 experimentos roedores em ônibus espacial²³. A AEM foi originalmente desenvolvido para relativamente curtas experiências a bordo da nave (< 20 dias). Desde o desenvolvimento da ISS, as AEMs foram modificados para experimentos de duração mais longos e são agora referidos como Habitats de roedor^22,23. Os novos Habitats de roedores são projetados para apoiar missões de longa duração na ISS usando o Expedito o processamento de experimentos para interface de Rack de estação espacial (EXPRESS). Habitats de roedores são substancialmente diferentes das gaiolas viveiro padrão em suas dimensões, fluxo de ar, filtro e sistema de escape e acesso à comida e água (Figura 1). No entanto, este hardware tem provado para ser uma plataforma de pesquisa eficaz, permitindo ideias-chave para as mudanças induzidas pelo voo espacial a fisiologia de mamífero^{19,31,32,33 ,34,35,36}.

Grandes volumes de dados omics agora podem ser gerados a partir de experimentos spaceflight biológica, incluindo aquelas realizadas com roedores. Recentemente, dados destas experiências omics foram disponibilizados publicamente através da NASA GeneLab plataforma¹ , que é um repositório de dados abrangente e plataforma de análise que permite a qualquer pessoa criar hipóteses de experiências de voo espacial. GeneLab fornece ferramentas para a detecção, acesso, partilha e análise de dados. Utilizamos o GeneLab datasets para mostrar que as diferenças entre o padrão de viveiro gaiolas e Habitats de roedor especializado usado no espaço causam enormes diferenças na transcriptoma de ratos³⁶. Foram analisados quatro diferentes à disposição do público conjuntos de dados, comparando os diferentes tecidos de roedores alojados em gaiolas viveiro padrão ou do roedor Habitats. Usando uma análise de biologia de sistemas imparcial, determinamos que os drivers principais e vias que foram alteradas foram consistentes com uma resposta hipoxia devido aos elevados níveis de₂ CO causada por altas concentrações de₂ CO na ISS, o que leva a maior CO ₂ concentrações no Habitat de roedores, tendo em conta que eles são sistemas passivos que levam no ar ambiente. Isso demonstra como os cientistas podem usar ferramentas open source e dados para gerar novos achados com implicação sobre como o ambiente da ISS impacto sobre a saúde de astronauta.

Aqui descrevemos como roedores experimentos são realizados no espaço e como dados destas experiências podem ser acessados através de uma código-fonte aberto, plataforma omic relacionados à biologia de espaço. Vamos discutir a configuração dos roedores Habitats utilizados para missões espaciais, e como o voo espacial tecidos são processados. Também descreveremos como spaceflight omics dados podem ser descobertos e acessados na GeneLab e como principais fatores que levam a resposta global ao voo espacial podem ser identificados³⁶. O exemplo específico que apresentaremos em como este protocolo é implementado irá ser comparando as diferenças biológicas ocorrem em roedores alojados no Habitat de roedores e os controles de viveiro que foram publicados por Beheshti et al.³⁶. É importante notar que controles de solo são essenciais para roedores experiências de voo espacial. Conforme descrito no presente protocolo, esses controles são feitos com ambas as condições idênticas (isto é, condições de CO₂ , umidade, temperatura, dimensões da gaiola, etc.) nos Habitats roedor na ISS e em gaiolas viveiro padrão que têm o padrão ambientais (ou seja,, CO₂ condições, umidade e temperatura) condições na terra. Os roedores alojados nos controles de solo do Habitat de roedor permitem a comparação direta de roedores no espaço. Enquanto roedores alojados em gaiolas viveiro permitem a comparação biológica entre a carcaça diferente (por exemplo, gaiolas viveiro vs ferragem de roedores). O Habitat do roedor é diferente do viveiro gaiolas em que tem o fluxo de ar constante (0.1-0.3 m/s), uma longa duração e um filtro de exaustão secundário que capta e absorve os resíduos animais guiados para o filtro de exaustão por fluxo de ar contínuo em microgravidade. Além disso, os Habitats de roedores têm sistemas passivos e entrada de ar ambiente; Portanto, eles também têm altas concentrações de CO₂ , devido aos níveis elevados da cabine do ISS (~ 5.000 ppm).

Protocolo

Os protocolos de animais para habitação e processamento do tecido siga diretrizes padrão de cuidados com animais de laboratório e foram aprovados pela NASA voo e cuidados institucionais do Animal e uso de comitês (IACUC) à terra.

1. configuração dos Habitats de roedores

Nota: A NASA roedor Habitats (anteriormente AEMs) têm características diferentes das jaulas dos viveiro para acomodar para operações no espaço (Figura 1).

1. Casa 10 ratos em cada Habitat de roedores (até 30 g / rato). Casa 5 ratos por compartimento quando o habitat é configurado em dois compartimentos ou 10 ratos se houver um único compartimento.
   Nota: NASA roedor Habitats têm uma maior área acessível de superfície por roedores do que as gaiolas viveiro padrão.
2. Para chão controla animais, casa ratos no Habitat de roedores dentro simulador ambiental ISS (ISSES), em idênticas condições ambientais como os animais de voo, incluindo CO₂ concentrações, temperatura e umidade relativa.
3. Fornecer acesso ad libitum para personalizado feito NASA nutriente atualizado roedor Foodbars (NuRFB) em conformidade com as exigências nutricionais do Conselho de pesquisa nacional (NRC) para ratos³⁷animais, e a água através de pressão ativado lixits.
4. Monitorar a saúde dos animais e o comportamento que será habilitado nos Habitats roedores com as 12:12 h luz ciclo semelhante ao viveiro gaiolas em instalações padrão com LED iluminação durante o dia e iluminação infravermelha durante verificações de integridade de vídeo que ocorrem durante o ciclo escuro.
5. Coloque quatro câmeras nas gaiolas roedores Habitat para o monitoramento diário de saúde e comportamento e coletamos vídeos de animais durante a noite com iluminação infravermelha.
6. Entrega os roedores para a ISS em um transportador (Figura 2B) a bordo do Dragon cápsula ou veículo de lançamento similar.
7. Certifique-se que os roedores são observados e examinados pelo veterinário voo antes de serem carregados para o transportador para o lançamento da NASA e por membros da tripulação treinada na chegada à ISS e antes da transferência para Habitats de roedores.
8. Para este período de transição, casa até 20 ratos (10 de cada lado) ou 12 ratos no transportador.
   Nota: Semelhantes para o Habitat do roedor, o transportador é uma unidade passiva para condições ambientais. Durante este período de transição curta, este unitárias podem abrigar até 20 ratos.

2. roedor tratamento para experimentos de voo espacial

1. Adquirir roedores de fornecedores padrão.
   Nota: Após o parto, grupo de roedores dentro de gaiolas viveiro padrão e ter os animais se aclimatar a NASA NuRFB, lixits e pisos de arame levantada até os animais são carregados para o transporte. Deixar os roedores nas gaiolas permitirá que os animais possam adaptar-se naturalmente. A manipulação dos ratos dentro e fora de ambos os Habitats de roedores e gaiolas viveiro segue protocolos comumente usados para todos os experimentos roedores^12,,^27,28. O sistema de Habitat de roedores (figura 1A) será utilizado para ambos missão espacial no STS e ISS, respectivamente e para controles de solo, simulando condições ambientais ISS ou STS.
2. Para algumas missões usar gaiolas viveiro padrão (figura 1B) para o controle de viveiro. Use 5 ou 10 ratos por gaiola viveiro padrão.
3. Para roedores de Habitats, coloque 10 ratos em dois compartimentos diferentes com 5 ratos por compartimento. Retire o divisor de gaiola para abrigar 10 ratos por Habitat em um único compartimento.
4. Utilizam três componentes do hardware roedores durante missões de exploração espacial, conforme descrito a seguir (Figura 2).
   1. Coloque roedores em um transportador (Figura 2B), para as viagens entre a terra e o ISS ou vice-versa em dupla densidade (10 ratos cada lado, 20 ratos por transportador).
   2. Uma vez na ISS, anexe o Animal acesso unidade (AAU) (Figura 2) para o transporte. Transferência de roedores de transportador para os Habitats usando caixas de transferência de Mouse (MTB) (5 ratos por MTB) (Figura 2D).
      Nota: O AAU é usado para conter quaisquer produtos de origem animal (por exemplo,, de fezes, urina, pele) de chegar até a cabana ISS.
   3. Desanexar o AAU de transportador e anexar para o Habitat do roedor. Em seguida, transferi os animais do MTB para o Habitat de roedores (Figura 2A), onde residem para a duração da missão.
      Nota: A concentração de₂ CO devido aos níveis elevados da cabine do ISS para todos os Habitats de roedores é a 5.000 ppm.
5. Monitorar a temperatura e a umidade dos Habitats roedor, mas não há nenhum ativo controle térmico. Certifique-se de que a equipe de pesquisa de roedor trabalha com ISS para manter e controlar a temperatura da cabine, que determina a temperatura no Habitat de roedores.
   Nota: O ciclo de luz e a escuridão nos Habitats roedor ocorre a cada 12 h (por exemplo,, 05:00 – 17:00 GMT, luzes acesas) e a tripulação da ISS executa regular e frequente mudança fora a comida (semanal ou quinzenal) e refil de água (cada ~ 28 dias).

3. a eutanásia de roedores e processamento de tecido

1. Para eutanásia, dar roedor uma overdose de anestesia geral (xilazina/cetamina até corpo 150/45 mg/kg massa diluída em tampão fosfato salino para um volume total de 0,3 mL) através da injeção intraperitoneal (IP) combinada com um método secundário de eutanásia ( deslocamento cervical ou toracotomia).
2. Para experimentos conduzidos na ISS:
   1. Retorno de roedores ou vivem, ou
   2. Eutanásia na ISS.
      1. Congelar carcaças de roedores a-95 ± 2 ° C nos freezers na ISS e retornar à terra sobre o veículo de retorno disponível (atualmente a cápsula SpaceX Dragon).
      2. Uma vez que os roedores são retornados à terra, dissecar todos os órgãos e tecidos (ou seja,, fígado, rim, pele, músculos, coração, baço, olhos, glândulas supra-renais, pulmões e cérebro) e armazenar a-80 ° C ou em solução de estabilização de RNA.
3. Siga os mesmos procedimentos e horários para todas as experiências de terreno de controle como a experiência de voo com um deslocamento de 3 a 5 dias para coincidir com os dados de telemetria do ISS.
4. Os tecidos preservados Isole RNA, proteínas e DNA isolamento usando protocolos padrão que são descritos em detalhes associados com cada conjunto de dados na plataforma GeneLab (genelab.nasa.gov).
   Nota: Tecidos de roedores não utilizados pelo investigador principal tornar-se parte da coleção de científica institucional da NASA. Estas amostras são armazenadas no Ames Research Center (ARC) biobanco de não-humanos, onde são catalogados e disponibilizados para solicitação pela comunidade científica. Tecidos disponíveis podem ser encontrados a Life Sciences dados arquivo público na página: https://Lsda.jsc.nasa.gov/Biospecimen.

4. gerar dados Omics de RNA, DNA e proteína extrai

1. Das macromoléculas extraídas (RNA, DNA, proteína) use protocolos padrão para gerar dados omics. Estes são descritos em detalhe no estudo respectivos metadados na GeneLab.

5. GeneLab repositório e apresentação de dados

Nota: Espaço biologia relacionados são apresentados dados omics no repositório de dados GeneLab. GeneLab aceita e hospeda dados espaciais omics financiados por várias agências do espaço ao redor do mundo.

1. Gerar omics relacionadas com dados que podem ser hospedados no repositório da GeneLab.
   1. Submeta dados gerados para GeneLab, ou quando a análise é completa ou com base no critério do investigador.
      Nota: Dados submetidos a outros bancos de dados públicos omics importados e publicados no repositório do GeneLab. GeneLab gerado dados são curadoria e publicados sem um período de embargo. GeneLab, especificamente a amostra processamento laboratório, gera dados de várias experiências de voos espaciais, usando técnicas e protocolos de extração otimizado para aumentar os dados omics das experiências de voo espacial.
2. Quando os dados estão prontos para ser enviado, Formatar e transferir os dados e metadados para GeneLab com o seguinte método (Supplemental Figura 1):
   1. Use as ferramentas de ISAcreator para definir um estudo experimental e armazenar os metadados.
      Nota: ISAcreator a ferramenta está disponível para download com um aqui tutorial guiado³⁸.
   2. Consulte os dados listados aqui³⁹ para entender os tipos de dados aceitos e formatos de arquivos de dados crus e processados.
      1. Para otimizar o upload e armazenamento, comprima os arquivos de dados.
   3. Transferi os metadados e os dados brutos e/ou transformados para curadores de dados GeneLab através do espaço de trabalho de⁴⁰.
   4. Crie um username e uma senha e carregar os dados.
3. Uma vez que os dados foram enviados para o espaço de trabalho, compartilhe dados de um curador de GeneLab.
   Nota: As etapas detalhadas sobre como fazer o upload e compartilhar arquivos podem ser encontradas no guia de apresentação de dados⁴¹.
4. Cada apresentação é verificada por um curador e publicada no GeneLab repositório⁴².

6. encontrar conjuntos de dados para análise usando recursos de pesquisa na GeneLab

1. Busca por diferentes conjuntos de dados na GeneLab, indo para a ligação (Supplemental Figura 2)³⁸.
   1. Especificamente relacionados a uma anterior publicação³⁶, busca os seguintes termos: GLDS-21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63.
2. Acesse a homepage GeneLab clicando no "Sistema de dados GeneLab" no lado esquerdo da tela.
3. Digite as palavras-chave na caixa "dados de busca" para pesquisar por áreas específicas de interesse. Nesse caso, digite cada um dos identificadores de conjunto de dados a seguir separadamente: GLDS-21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63.
4. Além de Pesquisar o repositório GeneLab, pesquisa em outros bancos de dados, inclusive GEO NIH, EBI orgulho e ANL MG-RAST, selecionando as caixas de seleção desejadas na barra de pesquisa.
   Nota: Atualmente somente para o repositório do GeneLab, um usuário pode pesquisar usando as seguintes categorias de filtro: organismos, tipo de ensaio, fatores e tipo de projeto.

7. armazenamento e transferência de arquivos de interesse para a análise

Nota: O espaço de trabalho do GeneLab é projetado para armazenar e transferir arquivos diretamente do banco de GeneLab (Supplemental Figura 3).

1. Clique em "Área de trabalho" no topo do menu de sistemas de dados.
2. Se novo usuário, registre-se para uma nova conta.
   Nota: O espaço de trabalho do GeneLab é alimentado por GenomeSpace⁴³.
3. Acesso instruções detalhadas sobre como usar o espaço de trabalho, selecionar "Ajuda" no menu superior e clique em guia do usuário.
4. Para cada usuário, acesse todos os conjuntos de dados no repositório GeneLab, selecionando a pasta "Público/genelab" no menu da esquerda.
5. Copie os conjuntos de dados de interesse para um espaço de trabalho do diretório local, indo para a pasta com os dados de interesse. Clique com o botão direito sobre o arquivo específico, selecione "copiar/mover" no menu que aparece, selecione a pasta para copiar o arquivo e, em seguida, clique em "copiar".
   1. Encontrar os seguintes conjuntos de dados relacionados a uma anterior publicação³⁶ conforme as instruções acima e copie para o local de trabalho: GLDS-21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63.

8. acesso a metadados e descrição de cada estudo

Nota: Arquivos de metadados para cada conjunto de dados no repositório GeneLab estão na subpasta de dataset "Público/genelab" no menu do lado esquerdo.

1. Encontre as informações de metadados para o conjunto de dados de interesse, acessando um ou mais arquivos de metadados contidos em uma subpasta de "metadados" de cada conjunto de dados. Por exemplo, para GLDS-100, existem 2 arquivos na subpasta "Público/genelab/GLDS-100/metadados": "GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-ISA.zip-olho" e "GLDS-100_metadata_RR1ExpDesign.pdf".
   1. Certifique-se de que cada conjunto de dados tem um único arquivo zipado que fornece metadados de acordo com a especificação de ISATab (que engloba o MIAME, MIAPE e outros padrões de estrutura MIBBI para metadados mínimos requisitos). Sempre acaba com este tipo de nome de arquivo em "ISA.zip". Por exemplo, para GLDS-100, este arquivo é "GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-ISA.zip-olho".
2. Use a ferramenta de ISACreator⁴⁴ ou um editor de texto para visualizar e acessar os metadados de ISATab, que contém a descrição de texto para o estudo e ensaio de metadados para cada conjunto de dados.
   Nota: Dentro os metadados ISATab, amostras são descritas e associadas bioensaios e bioensaios são descritos e associados a arquivos de dados de saída.
3. Verificar a presença dos arquivos de dados de ensaio de saída que estão localizados dentro de cada conjunto de dados em subpastas pelo tipo de ensaio. Por exemplo, para GLDS-100, RNA-Seq saída ensaio arquivos estão localizados no "público/genelab/GLDS-100/transcriptomics /" pasta.

9. análise de dados GeneLab

Nota: Diversas condutas podem ser implementadas para vários dados de omics. Aqui, o exemplo específico concentra-se em um pipeline de transcriptomic de biologia de sistemas imparcial que é usado para determinar os drivers"chaves" do sistema a ser estudado.

1. Cheque anteriormente publicada literaturas^{36,45,46,47,48,},^49,50 para entender esse pipeline.
2. Uma vez que um conjunto de dados específico de interesse é selecionado para análise, baixe os dados para um computador local com o seguinte método:
   1. Clique sobre o conjunto de dados específico.
   2. Clique na guia "Arquivos de estudo" à esquerda dos cabeçalhos.
   3. Certifique-se de que todos os arquivos de dados e metadados estão disponíveis neste menu.
   4. Para baixar cada arquivo, clique sobre os nomes de arquivo específico.
3. Para os conjuntos de dados de microarray que serão baixados do GeneLab, use as seguintes etapas de pré-processamento.
   1. Processo os dados brutos para cada conjunto de dados separadamente usando Quantil normalizada usando RMAExpress⁵¹ para os comerciais microarrays e subtração de fundo.
   2. Crie a princípio componente análise (PCA) parcelas usando R para determinar como pròxima o biológico Replica agrupados juntos.
   3. Importar dados para o visualizador MultiExperiment⁵² e calcular genes significativos primeiro usando as estatísticas de taxa (FDR) falsa descoberta começando com FDR < 0,05. Se não há genes significativos apareceram com estatísticas FDR, use t-testes padrão, começando com um p-valor < 0,05 para determinar os genes significativos.
   4. Uma vez que os genes regulados estatisticamente significativos foram determinados, implemente um corte dobra-mudança de ≥ 1.2 ou ≤ -1,2 para comparar as amostras experimentais com os controles.
4. Use análise de enriquecimento conjunto Gene (GSEA)⁵³ para caminho e previsões funcionais.
   1. Usar o GSEA através de de^54,GenePattern⁵⁵, diretamente através de GSEA, ou usando o ambiente de programação de R.
   2. Determinar os caminhos significativamente regulamentados usando os seguintes conjuntos de gene: C2, C5 e marcas.
   3. Executar análise de vanguarda na moda gene significativamente regulamentado e determinar a vanguarda genes associados com cada comparação experimental e Gene Set.
   4. Encontre os genes de ponta que se sobrepõem entre todos o gene define para cada condição experimental.
5. Use uma outra plataforma para determinar funções previstas e caminhos que estão sendo regulados significativamente. Neste caso use análise de caminho de engenho (IPA) para determinar os reguladores de montante significativos, biofunctions e caminhos canônicos.
   1. Carregar a lista de genes com dobra-mudança de valores para os genes estatisticamente significativos determinados na etapa 9.4.4.
   2. Siga as instruções do IPA para gerar reguladores upstream, biofunctions e os caminhos canônicos para cada comparação experimental.
   3. Determine que o gene associado para reguladores upstream, biofunctions e caminhos canônicos que têm um ativação pontuação z ≥ 2 (ativação indicada) ou ≤ -2 (indica inibição).
   4. Encontre os sobreposição genes relacionados com todas as previsões acima.
6. Determine genes comum/sobreposição entre etapas 9.4 e 9.5.
   Nota: Estes genes são considerados como os genes chave/motorista, controlando a maioria de funções previstas e atividade com as condições experimentais sendo analisadas. Estudos anteriores demonstraram que bater para fora ou promover estes genes fará a condição experimental ou sistema sendo estudado não-funcional^45,46,49.
   1. Construa redes através de IPA (ou qualquer software de montagem de rede) para determinar a conectividade dos genes.
   2. Considere o gene mais ligado como hub central, dirigindo os genes-chave.
   3. Para determinar a conectividade entre os conjuntos de dados, agrupe todos os genes-chave em uma rede e conectividade repetição teste para determinar o ponto central que está ocorrendo entre todos os genes-chave de todos os conjuntos de dados sendo analisados.

10. usando a Interface de⁵⁶ de galáxia em GeneLab para analisar os dados de Transcriptomic

Nota: Aqui, um protocolo para usar a interface de GeneLab galáxia (disponível queda 2018) para analisar os dados de transcriptomic de GeneLab é descrito. TUTORIAIS Galaxy abundam. Tutoriais de exemplo sobre como usar a galáxia em geral estão disponíveis elesewhere^57,58.

1. Os usuários podem entrar no GeneLab usando credenciais do Google ou a NASA. GeneLab galáxia ferramentas estão localizadas sob o menu de "Analisar".
2. Siga estas três formas de trazer dados para a plataforma da galáxia GeneLab.
   1. Upload de dados do sistema de arquivos local, usando a função "Enviar dados".
   2. Importar dados do GeneLab GenomeSpace usando a ferramenta importador de GenomeSpace sob a seção "Obter dados".
      Nota: Todos os arquivos de dados do GeneLab estão disponíveis na pasta "pública", organizada pelo número de adesão dataset (veja acima).
   3. Importar dados aparecem na "história" da seção de análise do lado direito. Os usuários podem ter várias histórias, que são gerenciadas usando os botões "History Options" ou "Exibir todas as histórias" na parte superior do painel de história.
3. Ferramentas para análise são pesquisáveis e listadas no lado esquerdo da interface.
4. Verifique a aparência de conjuntos de dados que foram importados na história atual.
   Nota: Muitos detalhes em relação aos dados estão disponíveis para inspeção para cada conjunto de dados.
5. Selecione uma ferramenta do lado esquerdo para preencher um formulário no painel central, com opções para análise e especificação de entradas de dados. Crie postos de trabalho para executar a análise do formulário e pressionando "Execute".
6. Verifique para trabalhos apresentaram que são representados na história e um código de cores para indicar o status de execução (em fila, em execução, concluídas, com ou sem erros).
7. Vincule as ferramentas em fluxos de trabalho complexos. Gerencie fluxos de trabalho através de ferramentas localizados no menu "Fluxos de trabalho". A Figura 3 mostra um fluxo de trabalho de exemplo criado para processar dados do RNA-seq.
8. Compartilhar os conjuntos de dados, fluxos de trabalho e as histórias com outras pessoas usando o menu "Dados compartilhados".

Resultados

Determinar os impulsores-chave de dados de transcriptomic de voo espacial ajudará a NASA com determinação de riscos para a saúde e desenvolver potenciais contramedidas para combater os efeitos negativos sobre a saúde de astronauta. Em nossa recente publicação, temos seguido os passos acima e utilizados GeneLab datasets para mostrar com sucesso um romance achando que concentrações de CO₂ na ISS podem afetar saúde³⁶. Nós também usamos a técnica acima em outros estudos para determinar com sucesso os fatores chaves dirigindo o sistema sendo estudado^45,46,47,,^48,49,50 . Aqui vamos mostrar como os resultados de usando este protocolo podem ser usados com sucesso para determinar os impulsores-chave.

Neste estudo, enfocamos principalmente as diferenças biológicas que ocorrem nos roedores alojados em controles de solo o roedor de hábitos e os controles de viveiro. Conforme descrito acima, é a chave para entender melhor estes dois hábitats, que irão fornecer-nos informações sobre possíveis fatores de confusão que podem impactar a saúde devido ao ambiente na ISS. Para todas as experiências do voo espacial de roedores, estes controles de solo também são essenciais para determinar quais fatores biológicos estão associados diretamente com voos espaciais ou devido as condições ambientais na ISS. Conforme o protocolo, a condição ambiental para o habitat do viveiro não é exposta ao maior nível CO₂ que está presente para o Habitat do roedor. O habitat do viveiro tem o nível normal de₂ CO que está presente na terra (atualmente sendo 300 a 380 ppm). A temperatura e umidade para ambos os habitats são semelhantes.

Usamos os seguintes conjuntos de dados da plataforma GeneLab para determinar os genes-chave entre os roedores alojados no Habitat de roedores solo controles e controles de solo de viveiro que são responsáveis por conduzir as diferenças entre os dois habitats: GLDS-21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63. Análise para determinar os genes significativos foi realizada conforme descrito acima, entre o Habitat de roedores (anteriormente AEM) e controles de viveiro independentemente para cada conjunto de dados. Agrupamento de parcelas mostrou PCA do biológico Replica (Figura 4 mostra que o PCA parcelas para GLDS-21). A partir dos dados pré-processados, determinamos os genes de ponta dos diferentes conjuntos de gene GSEA. Usando os genes com 1.2-vezes-mudança (log₂), fomos capazes de prever os genes envolvidos com previsões para montante reguladores e dos percursos canônicos e biofunctions. Para cada conjunto de dados então encontramos os genes comum/sobreposição envolvidos para todos os genes (Figura 5). Estes genes são agora acreditava estar dirigindo a resposta entre os roedores no roedor Habitats (ou AEM) e controles de viveiro. Rede de representação de como conectam esses genes-chave mostra que as bases centrais para cada conjunto de dados sendo analisaram (Figura 6). Por exemplo, MAPK1 é o centro dos tecidos do músculo esquelético STS-108 de ratos (figura 6A). Isso seria interpretado como o gene que está deixando os genes-chave e muito provavelmente o jogador central para causar diferenças biológicas para ratos alojados em Habitats de roedores contra as gaiolas viveiro. Em nosso trabalho anterior, discutimos como esses genes-chave estão associados com CO₂ resposta da literatura científica existente, e como estes genes podem ser responsáveis por mudanças biológicas observadas em ratos³⁶.

Tomando uma abordagem de biologia de sistemas, em seguida determinamos um regulador"mestre" que conecta todos os conjuntos de dados/tecidos e é potencialmente responsável pela universais efeitos biológicos em roedores alojados na AEMs em comparação com as gaiolas viveiro. Isto foi feito, determinando-se o gene de todos os conjuntos de dados que é o mais ligado ao construir uma rede de todos os genes chaves. Fomos capazes de mostrar que o MAPK1 é o gene mais ligado e o hub central de todos os genes chaves (Figura 7). Para confirmar se o MAPK1 pode ser responsável por alterações biológicas nos ratos de CO₂ níveis mais elevados na AEMs, procuramos através da literatura científica para elementos comprovativos. Encontramos vários estudos indicando a correlação de MAPK1 com CO₂⁵⁹ e hipoxia^19,60,61.

Figura 1 : O Habitat de roedores (anteriormente AEM) em comparação com as gaiolas viveiro. Imagem do (A) da gaiola AEM fornecida pela NASA (créditos: NASA/Dominic Hart). (B) a gaiola viveiro padrão que é atualmente utilizado (foto tirada pelo nosso laboratório). Esta figura foi modificada em Beheshti et al.³⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : O sistema de Hardware de Habitat de roedores com os três módulos diferentes envolvidos durante o transporte de e para as missões espaciais. O módulo à esquerda (A) é o módulo de Habitat de roedores (anteriormente AEM), o módulo do centro (B) é o transportador e o módulo certo (C) é a unidade de acesso de Animal (AAU). (D) A caixa de transferência de Mouse (MTB). (Créditos: NASA/Dominic Hart). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Fluxo de trabalho de análise de exemplo que pode ser usado na interface do GeneLab galáxia para processar dados de RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 4 : Principais (PCA) da análise de componentes do conjunto de dados representativo após o pre-processamento passos. GLDS-21 dataset para AEM vs viveiro gaiola é mostrado para o músculo esquelético murino da missão STS-118. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Diagrama de Venn representando que genes chaves são determinados usando ferramentas de previsão diferente caminho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 6 : Os genes chaves determinados para todas as condições e tecidos murino entre o AEM vs . gaiolas viveiro. (A-E) Representação dos genes chaves para cada dataset/roedor tecido de rede. Log₂ dobra-alterações (com uma interrupção de 1.2 vezes-mudança) para a expressão do gene foram utilizadas para obter diferentes tons de verde para dobra-mudança nos genes de ativador, enquanto que os diferentes tons de vermelho retratam dobra-mudança nos genes upregulated. Quanto mais escuro o tom de verde ou vermelho, maior a mudança de dobra. Esta figura foi modificada em Beheshti et al.³⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Determinando o regulador"mestre" para roedores em habitação de Habitat de roedores em comparação com as gaiolas viveiro. Conexões entre todos os genes-chave individuais (Figura 6) foram determinadas e exibidas como uma rede através do IPA. Rede é representado como uma trama radial com o gene chave mais ligado, MAPK1, no centro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1: integração GeneLab-GenomeSpace com ISACreator para racionalizar as operações de processamento de dados. Clique aqui para baixar esta figura. 

Suplementar Figura 2: Screenshot do GeneLab pesquisas usando Federação/integração com bancos de dados externos bioinformática heterogêneos (GEO, orgulho, MG-RAST). Por favor clique aqui para baixar esta figura

Suplementar a Figura 3: Screenshot do espaço de trabalho colaborativo GeneLab mostrando o usuário de gerenciamento de conta e acessar controles (por exemplo,, particulares, compartilhadas, públicas pastas).  Por favor clique aqui para baixar esta figura

Discussão

A plataforma da NASA GeneLab é uma plataforma de banco de dados e análise de omics abrangente que permitirá que a comunidade científica gerar novas hipóteses relacionados à biologia de espaço. Aqui nós apresentamos um procedimento abrangente para roedores experiências desde o início da exploração espacial para a geração de nova hipótese de análise de dados utilizando uma plataforma de biologia de espaço à disposição do público. Além disso, também oferecemos um extenso protocolo em uma análise de biologia de sistemas imparcial para a identificação de genes-chave conduzir o sistema a ser estudado. Nós usamos nosso recente estudo³⁶ como um exemplo de como este protocolo é utilizado eficazmente para gerar uma hipótese de romance para espaço de biologia. Esperamos que isso ajuda os investigadores a entender melhor como são realizados os experimentos de voo espacial e como dados a partir deles levam com os dados disponíveis na GeneLab e, finalmente, permitir a interpretação mais clara dos dados de omics publicamente disponível espaço de biologia.

Existem várias etapas críticas dentro de nosso protocolo relativo a ambos os experimentos spaceflight roedores e análise dos dados produzidos. Noções básicas sobre o Habitat de roedor instalação é fundamental para desenvolver e projetar o experimento ideal para voo espacial. Isto implicaria, especificamente, o protocolo e nós fornecemos na etapa 1 do nosso protocolo de descrição. Uma vez que um investigador compreende totalmente as diferentes condições existentes nos Habitats roedor em comparação com as gaiolas viveiro, os resultados biológicos sendo interpretados podem ser correlacionados adequadamente para as condições ambientais no espaço. Em adições, modificações para o Habitat do roedor não podem ser feitas, já que o Habitat do roedor otimamente projetado e aprovado pela NASA para uso dos voos espaciais.

Para interpretar os resultados biológicos, nós fornecemos um protocolo completo sobre cada passo envolvido de carregar seus dados para o GeneLab para análise dos dados para gerar hipótese de romance de espaço de biologia. Apesar de todas as etapas são importantes na compreensão de como gerar dados, os passos mais críticos para análise de dados são as etapas 9 e 10. Passo 9 fornece um protocolo para analisar dados de transcriptomic usando um método de biologia de sistemas imparcial para determinar genes/caminhos que são verdadeiramente conduzir a condição experimental sendo analisada. Passo 10 é fundamental, pois fornece usuários com uma metodologia fácil de analisar omics GeneLab conjuntos de dados usando a plataforma GeneLab. Modificações no protocolo fornecido podem ser feitas de algumas etapas de análise de dados a respeito. Especificamente, passos 9.4 – 9.6 podem ser feitos usando programação R ou quaisquer outras ferramentas favoritas que o usuário prefere. Dependendo do conjunto de dados, estatísticas diferentes e pontos de corte dobra-mudança podem ser usados para determinar os genes significativamente regulamentados. Além disso, para determinar os genes chaves em etapas 9.5 e 9.6, o usuário pode modificar este protocolo e usar qualquer ferramenta que utiliza os genes significativamente regulamentados para prever as funções. O conceito importante é que usar várias ferramentas preditivas omics funcional permite a determinação de genes envolvido com a maioria das funções a ser regulada no sistema a ser estudado.

A GeneLab plataforma continua a desenvolver e enquanto as análises descritas aqui foram realizadas após o download de dados, a próxima fase da GeneLab permitirá uma análise de omics dados diretamente na plataforma GeneLab, que irá fornecer um fluxo de trabalho fácil para gerar dados processados para análise de ordem superior. Além disso, Considerando que nos focamos em um protocolo para interpretação dos dados transcriptomic, GeneLab contém uma grande variedade de dados omics incluindo proteômica, genômica, metabolómica e epigenomic. A eventual plataforma conterá condutas e orientações para a análise destes tipos diferentes de omics. A última fase da GeneLab irá também implementar uma interface de visualização de nível de sistema para permitir que o usuário básico para facilmente gerar hipóteses de biologia do espaço.

Por último, nossa análise de biologia de sistemas fornece um método exclusivo e imparcial para determinar a chave genes/vias de condução em qualquer sistema sendo estudado usando datasets omics. Nós usamos esta metodologia em vários diferentes estudos independentes, com grande sucesso para determinar os impulsores-chave envolvidas^{36,45,46,47,48,49 ,50}. Em um câncer relacionado omics estudo, usando esta metodologia nós experimentalmente validados que nossos genes/caminhos chaves previstos na verdade estava dirigindo a resposta de tratamento de drogas ao nocautear os genes chaves em vitro⁴⁵. Observamos, como nos havia previsto pelo presente protocolo, que o tratamento não foi eficaz mais devido à ausência de genes chaves. Acreditamos que este protocolo de biologia de sistemas imparcial pode ser uma ferramenta útil para determinar os caminhos principais para qualquer estudo de omics.

Este protocolo fornece um método rápido e eficiente para a geração de hipóteses de romance de espaço de biologia. Os dados gerados a partir de GeneLab podem ser aproveitados pelos investigadores para futuras oportunidades de financiamento, validação experimental e alvos potenciais para o desenvolvimento de contramedidas contra radiação de microgravidade e espaço. O protocolo fornecido aqui permitirá para investigações futuras espaço biologia ocorra com eficiência otimizada para permitir a missões de espaço seguro a longo prazo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mice	The Jackson Laboratoy	C57BL/6J	C57BL/6 mice were used for datasets related to Rodent Research-1 experiments
BALB/C Mice	Taconic	BALB	BALB/C mice were used for datasets related to Rodent Research-3 experiments
Vivarium Cages	Charles River Laboratory		Standard murine cages purchased from Charles River Laboratory
Rodent Habitat	NASA		This cage and all components are built internally at NASA
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	RNAlater is used to store the tissue for further RNA isolation