Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

Resumo

Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.

Resumo

A detecção precisa e específica de espécies reativas de oxigênio (ROS) em diferentes compartimentos celulares e tecidos é essencial para o estudo de redox-regulado sinalização nas configurações biológicas. Espectroscopia de ressonância paramagnética de electrões (EPR) é o método direto apenas para avaliar os radicais livres de forma inequívoca. Sua vantagem é que ele detecta níveis fisiológicos das espécies específicas com uma elevada especificidade, mas requer tecnologia especializada, preparação cuidadosa da amostra e controlos adequados para garantir a exata interpretação dos dados. Sondas de rotação cíclica de hidroxilamina reagem seletivamente com superóxido ou outros radicais para gerar um sinal de nitroxide que pode ser quantificado por espectroscopia de EPR. Sondas de rotação célula-permeável e sondas de rotação projetadas para acumular rapidamente nas mitocôndrias permitem a determinação da concentração de superóxido em diferentes compartimentos celulares.

Em culturas de células, o uso de célula permeável 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) junto com e sem pré-tratamento de célula-impermeável superóxido dismutase (SOD) ou uso de célula-permeável PEG-SOD, permite a diferenciação de extracelular de superóxido citosólico. O 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondrial] piperidínico dicloreto (mito-ritmo-H) permite a medição de ROS mitocondrial (predominantemente superóxido).

Sondas de rotação e espectroscopia EPR também podem ser aplicados aos modelos na vivo . Superóxido pode ser detectado em líquidos extracelulares como o sangue e fluido alveolar, bem como os tecidos como o tecido pulmonar. Vários métodos são apresentados para processar e armazenar tecido para medições de EPR e entregar intravenosa 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) rotação sonda em vivo. Enquanto as medições podem ser executadas em temperatura ambiente, as amostras obtidas de modelos in vitro e in vivo também podem ser armazenadas a-80 ° C e analisadas pelo EPR em 77 K. As amostras podem ser armazenadas no estábulo de tubos especializados a-80 ° C e executadas em 77 K para habilitar um prático, eficiente e o método reprodutível que facilita o armazenamento e transferência de amostras.

Introdução

Enquanto medidas de estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio são importantes para o estudo de diversas doenças em todos os sistemas do órgão, a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um desafio devido a uma meia-vida curta e alta reatividade. Uma técnica de ressonância paramagnética (EPR) do elétron é o método mais inequívoco para a detecção de radicais livres. Sondas de rotação têm vantagens sobre as sondas fluorescentes mais comumente usadas. Apesar de sondas fluorescentes são relativamente baratos e fáceis de usar e fornecer detecção rápida e sensível de ROS, têm sérias limitações devido a sinais diferente, a incapacidade de se calcular as concentrações de ROS e uma falta geral de especificidade¹ .

Para facilitar o uso de EPR para estudos biológicos, uma variedade de spin sondas foram sintetizadas que pode medir uma gama de espécies radicalares biologicamente relevantes, bem como pO₂, pH e redox afirma^{2,3, 4,5,6,7}. Armadilhas de rotação também foram desenvolvidas para capturar radicais de curta duração e vida longa forma adutos, que proporciona a detecção por EPR⁸. Ambas as classes (sondas de girar e girar armadilhas) têm vantagens e limitações. Uma classe comumente usado de sondas de rotação são hidroxilaminas cíclicas, que são o EPR-silencioso e reagem com os radicais de curta duração para formar um nitroxide estável. Hidroxilaminas cíclicas reagem com superóxido 100 vezes mais rápido do que as armadilhas de rotação, permitindo-lhes competir com antioxidantes celulares, mas eles carecem de especificidade e requerem o uso de controles apropriados e inibidores para identificar a espécie radical ou fonte responsável pelo sinal nitroxide. Enquanto a rotação armadilhas especificidade de exposição, com distintas espectral de que padrões, dependendo da espécie presa, eles têm cinética lenta para superóxido spin trapping e são propenso a biodegradação do radical adutos. Pedidos de interceptação de rotação foram bem documentados em investigação biomédica^{9,10,11,12,13}.

O objetivo deste projeto é demonstrar métodos práticos de EPR para projetar experiências e preparação de amostras para detectar superóxido, usando a rotação sondas em diferentes compartimentos celulares in vitro e em tecidos diferentes compartimentos na vivo. Diversos manuscritos publicaram protocolos relevantes para esses objetivos, utilizando sondas de rotação alvo permeável ao celular, celular-impermeáveis e mitocondrial ao tecido alvo diferentes compartimentos celulares in vitro e processo para análise em modelos do rato ^{14 , 15}. vamos construir sobre este corpo de literatura, Validando uma abordagem para medir superóxido usando uma sonda de rotação (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine em diferentes compartimentos celulares em vitro para garantir precisão medições, destacando possíveis problemas técnicos que podem distorcer os resultados. Nós também fornecemos métodos para realizar medições de EPR em sangue, líquido de lavagem broncoalveolar e tecido pulmonar usando a sonda de rotação CMH. Estes estudos podem comparar diferentes métodos para processar os tecidos, bem como apresentar um método para injetar outra sonda de rotação, CPH, em ratos antes da colheita de tecidos. Finalmente, nós desenvolvemos um método prático para armazenar as amostras em tubos de politetrafluoretileno (PTFE) para permitir o armazenamento e transferência de amostras antes de medições de EPR em 77 K.

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Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Colorado Denver institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização.

1. preparação dos reagentes

1. Diethylenetriaminepentaacetic estoque de ácido (DTPA) (150 mM)
   1. Adicionar 2,95 g de DTPA (393.35 g/mol) a 10 mL de água desionizada.
   2. Para dissolver DTPA, adicionar 1 M de NaOH, gota a gota e levar a um pH de 7,0.
   3. Trazer o volume para 50 mL com água para uma concentração final de DTPA de 150mm e armazenar a 4 ° C.
2. Solução salina tampão de fosfato (PBS) (50 mM, pH 7,4)
   1. Prepare-se 5 M de cloreto de sódio (NaCl) (58.44 g/mol; 29,22 g/100 mL).
   2. Prepare-se 1 M de potássio Fosfato dibásico HK₂PO₄ (174.18 g/mol; 17,42 g/100 mL)
   3. Prepare-se 1 M de potássio fosfato monobásico KH₂PO₄ (136.1 g/mol; 13,61 g/100 mL). Misture 3 mL de 5 M de NaCl com 4,24 mL de 1 M de fosfato de potássio dibásico e 0,760 mL de 1m potássio fosfato monobásico. Verifica o pH.
   4. Levar o volume a 100 mL com água desionizada.
   5. Armazenar em temperatura ambiente (RT) por curto prazo (dias) e a 4 ° C para armazenamento a longo prazo (semanas).
3. Tampão Krebs-Henseleit (KHB) contendo 100 µM DTPA
   1. Tubo de centrifuga conico de 50 mL, adicione 33,3 µ l de solução-mãe de DTPA 150 mM.
   2. Trazer um volume de 50 mL com tampão Krebs-Henseleit (KHB).
   3. Preparar o buffer fresco com DTPA cada dia e mantém-na RT
4. Tampão Tris-EDTA com sacarose
   1. Preparar o estoque de Tris 0,5 M: dissolver 15,14 g de base de Tris (121.14 g/mol) em 150 mL de água desionizada. Usando HCl, ajustar o pH a 7,8 e trazer até um volume final de 250 mL.
   2. Dissolver 21,4 g de sacarose (g/mol 342.29; concentração final = 0,25 milímetros) em 150 mL de água desionizada.
   3. Adicione 5 mL de Tris estoque de sacarose para atingir uma concentração de Tris final de 10 mM.
   4. Adicione 0,5 mL de estoque de EDTA 0,5 M Tris-sacarose a obter uma concentração final de 1 mM.
   5. Verificar o pH e ajustá-lo para 7,4.
   6. Trazer para um volume final de 250 mL com água desionizada e armazenar a 4 ° C.
5. Eritrócitos de bovinos estoque de dismutase (SOD) Cu/Zn superóxido (30.000 U/mL)
   1. Reconstitua a 30.000 U de SOD em 1 mL de PBS (aproximadamente 5,7 mg, dependendo da atividade de SOD monte).
   2. Misture bem, alíquota e armazenar a-20 ° C para curto prazo (6-12 meses) e a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
6. Solução de trabalho de SOD (1000 U/mL)
   1. Transferi uma alíquota de 30 µ l de 30.000 estoque SOD U/mL para um 870 µ l de PBS estéril.
   2. Manter a solução no gelo e usá-lo fresco.
7. Estoque de (PMA) do phorbol myristate 12 13-acetato (5 mM)
   1. Dissolver 1 mg de PMA (616.83 g/mol) em 325 µ l de DMSO (concentração final = 5 mM).
   2. Alíquota de uma solução PMA 5 mM e armazená-lo a-20 ° C.
8. Solução de trabalho de PMA (125 µM)
   1. Dilua uma alíquota de 10 µ l do estoque PMA 5 mM em 390 µ l de PBS estéril.
   2. Manter a solução no gelo e usá-lo fresco.
   3. Para um controle de veículo para PMA, use 10 µ l de DMSO em 390 µ l de PBS.
9. Cloreto de Diphenyliodonium (DIP) (2,5 mM)
   1. Dissolver 3,2 mg de DIP (316.57 g/mol) em 4 mL de obter um estoque de 2,5 mM.
   2. Preparar a solução e usá-lo fresco.
10. Sal mesilato de deferoxamina (DFO) (20 mM)
    1. Dissolver 4,5 mg de DFO (656,79 g / mol) em 340 µ l para obter um estoque de 20 mM.
    2. Preparar a solução e usá-lo fresco.
11. Preparação de antimycin ações A (AA) (5 mM)
    1. Dissolver 5,4 mg de AA (532 g/mol) em 2 mL de etanol (concentração final = 5 mM).
    2. Alíquota o estoque em frascos de vidro e em-20 ° C.
12. Preparação de sondas de rotação
    1. Bolha 50 milímetros de fosfato contendo 100 µM DTPA com nitrogênio por 30 min remover o oxigênio dissolvido de buffer de buffer.
    2. Retire a sonda de rotação do freezer-20 ° C e permitir que o contêiner vir para RT (10-15 min).
    3. Pesar 2,4 mg de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CMH) (237.8 g/mol)
    4. Dissolva CMH em 1 mL de tampão de fosfato venoso para uma concentração final de 10 mM.
    5. Pese 5 mg de dicloreto de 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium (H-ritmo-mito) (529.1 g/mol).
    6. Dissolva o mito-ritmo-H em 1 mL de tampão de fosfato venoso para uma concentração final de 9,5 mM.
    7. Pesar 4,9 mg de 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223.7 g/mol).
    8. Dissolva o CPH em 1 mL de tampão de fosfato venoso para uma concentração final de 22 mM.
    9. Alíquota e loja a-80 ° C (gelo-degelo não é recomendado).

2. detecção de superóxido in vitro

1. Deteção de superóxido total, extracelular e intracelular na PMA-estimulada de 264.7 pilhas no RT
   1. Seguir a técnica asséptica apropriada, descongelar 264.7 pilhas e passagem-los em mídia DMEM suplementada com 10% FBS (baixa livre de endotoxinas) e 1% antimicótico/ampicilina a 37 ° C numa incubadora de CO₂ .
   2. Semente 264.7 pilhas a 1 x 10⁶ células/poço em placas de 6 boas um dia antes do tratamento.
   3. Gentilmente remover mídia e lavar as células uma vez com 1 mL de tampão KHB.
   4. Adicionar KHB contendo 100 µM DTPA a cada poço e tratar em um volume total de 500 µ l, com o seguinte:
   5. Para poços pré-tratados com SOD, adicione 15 µ l/poço de solução de trabalho de SOD (1000 U/mL; concentração final de SOD = 30 U/mL) e incubar durante 10 minutos a 37 ° C antes da adição de CMH e PMA.
   6. Adicionar 12,5 µ l/poço de estoque CMH 10mm (concentração final = 0,25 mM).
   7. Adicionar 40 µ l/poço 125 µM PMA da solução de trabalho (concentração final = 10 µM) ou veículo de 40 µ l (estoque 10 µ l de DMSO em 390 µ l de PBS).
   8. Incube durante 50 min a 37 ° C numa incubadora de CO₂ .
   9. Retire as placas da incubadora e colocá-los imediatamente no gelo.
   10. Recolha reserva de cada poço em separado, 1,5 mL, rotulado de tubos. Manter-se no gelo ao longo.
   11. Adicione 100 µ l de tampão KHB fresco contendo 100 µM DTPA, delicadamente raspar as células e ressuspender pipetando subindo e descendo várias vezes. Manter-se no gelo ao longo de ressuspensão de célula.
   12. Carga da amostra recolhida em etapas 2.1.10 e 2.1.11 (50 μL) em cada um dos tubos capilares. Ambas as extremidades do selo e executar o EPR.
       Nota: Sempre um tubo de teste ou bem (sem pilhas) contendo a sonda no buffer (mesma concentração = 0,25 mM), tratados sob as mesmas condições que as células (mesmo tempo de incubação e temperatura), como um controle, desde que a intensidade do fundo da sonda é temperatura... e dependente do tempo.
   13. Definir os parâmetros de aquisição de EPR para o seguinte: frequência de microondas = 9,65 GHz; centro do campo = 3432 G; amplitude de modulação = 2,0 G; varrer a largura = 80 G; energia de microondas = 19,9 mW; número total de exames = 10; tempo de varredura = 12.11 s; e constante de tempo = 20,48 ms.
2. Deteção de superóxido mitocondrial em 264.7 pilhas
   1. Siga os passos 2.1.1 e 2.1.2 para 264.7 pilhas de semente um dia antes do experimento.
   2. Remova a mídia e lave as células uma vez com 1 mL de tampão KHB.
   3. Adicione 200 µ l de KHB contendo 100 µM DTPA para cada poço.
   4. Adicionar 5,3 µ l/poço de estoque de mito-ritmo-H de 9,5 mM (concentração final = 0,25 mM)
   5. Incubar durante 10 minutos a RT.
   6. Adicionar 1 µ l/poço de antimycin A (AA), solução etanólica de 5mm (concentração final = 25 µM).
   7. Incube durante 50 min a 37 ° C numa incubadora de CO₂ .
   8. Retire as placas da incubadora e colocá-los imediatamente no gelo.
   9. Delicadamente, raspe as células e ressuspender pipetando para cima e para baixo. Manter-se no gelo.
   10. Carrega a amostra em um tubo capilar. Ambas as extremidades do selo.
   11. Consulte a seção anterior para APE.
3. Deteção de superóxido em 264.7 pilhas a 77 K
   1. Coloque o buffer coletado na etapa 1.1.10 pré-preparadas PTFE tubo 1-2 polegadas de comprimento (3/16" OD x 1/8" ID). Certifique-se de que o tubo de PTFE é reto, então pode ser facilmente inserido e removido do dedo dewar. Use uma rolha de borracha para fechar uma das extremidades do tubo de PTFE, pipetar o buffer ou suspensão de células (100 a 150 µ l) para o tubo de PTFE e selar o tubo com uma rolha de segunda.
   2. Flash congelar a amostra em nitrogénio líquido. A amostra pode ser transferida para um tubo de criopreservação etiquetados para armazenamento a-80 ° C ou executar imediatamente.
   3. Preencher o dedo dewar com nitrogênio líquido e inserir o tubo de PTFE que contém a amostra para o dedo dewar. Verifique se a amostra é centralizada no espaço ativo do ressonador e EPR em 77 K.
      Nota: Iniciar o fluxo de gás nitrogênio para seu espectrômetro de 15-30 min antes das medições e continuar este fluxo durante as medições para impedir a condensação de água no ressonador.
   4. Definir parâmetros de aquisição de EPR para o seguinte: frequência de microondas = 9,65 GHz; centro do campo = G 3438; amplitude de modulação = 4,0 G; varrer a largura = 150 G; energia de microondas = 0,316 mW; número total de exames = 10; varrer o tempo = 60 s; e constante de tempo = 1,28 ms.

3. EPR medições em fluidos

1. Sangue total
   1. Trate ratos (8-12 semanas de idade), com uma dose única de bleomicina intratraqueal (Bleo; 100 µ l a 1 U/mL) dissolvida em PBS ou PBS sozinho como descrito anteriormente,^16,17.
   2. Eutanásia em ratos através da administração de isoflurano inalado (1,5-4%) seguido de sangria e deslocamento cervical. Aspire o sangue do ventrículo direito através de uma seringa revestido com heparina (USP de 1000/mL) contendo 100 µM DTPA e transferir para um tubo de 1,5 mL.
   3. Em um tubo separado 1,5 mL, adicionar 15 µ l de PBS contendo 100 µM DTPA e 3 µ l de CMH (10 mM) para 132 µ l de sangue para um volume total de 150 µ l e concentração de CMH final de 0,2 mM.
   4. Incube o sangue por 10 min a 37 ° C em banho-maria.
   5. Retire os tubos do banho-maria.
   6. Tomar uma alíquota carregando sangue em um tubo capilar e execute o EPR em RT com os seguintes parâmetros de aquisição de EPR: frequência de microondas = 9,65 GHz; centro do campo = 3432 G; amplitude de modulação = 1,0 G; varrer a largura = 80 G; energia de microondas = 19,9 mW; número total de exames = 3; tempo de varredura = 12.11 s; e constante de tempo = 20.48 MS. Alternativamente, as amostras podem ser congelada como descrito no passo 2.3 para medições em 77 parâmetros de aquisição de K. EPR são os seguintes: frequência de microondas = 9,65 GHz; centro do campo = G 3438; amplitude de modulação = 4,0 G; varrer a largura = 150 G; energia de microondas = 0,316 mW; número total de exames = 2; varrer o tempo = 60 s; e constante de tempo = 1,28 ms.
2. Líquido de lavagem broncoalveolar (LBA)
   1. Após eutanásia (ver passo 3.1.2), recolher BALF lentamente incutir e retirada de 1 mL de PBS contendo 100 µM DTPA três vezes em uma seringa através de uma cânula colocada na traqueia.
   2. Em um tubo de 1,5 mL, trate a 200 µ l de LBA com 4 µ l de CMH (10 mM) para obter uma concentração final de 0,2 mM.
   3. Incube BALF 50 min a 37 ° C em banho-maria.
   4. Tome tubos de sair do banho de água e colocá-los no gelo.
   5. BALF de carga em um tubo capilar e execução EPR na RT com as mesmas configurações de EPR como usado no passo 1.1.13, ou flash congelamento em nitrogênio líquido, conforme descrito na etapa 2.3.
3. Medições de EPR em sangue e LBA a 77 K
   1. Siga o protocolo acima para coletar sangue (etapas 3.1.1. a 3.1.4) e LBA (etapas 3.2.1 a 3.2.4).
   2. Lugar de 150 µ l de sangue tratada ou LBA em PTFE tubo (dentro de 1-2). Use uma rolha de borracha para fechar uma das extremidades do tubo de PTFE antes da adição da amostra e outra rolha para fechar o tubo.
   3. Flash congelar a amostra em nitrogénio líquido.
   4. Ver secção 2.3 para obter detalhes sobre a execução de EPR em amostras congeladas, no tubo de PTFE, usando o dedo que Dewar em 77 K. Run congelados CMH tratados com as amostras de sangue em uma semana.

4. EPR medições no tecido pulmonar

1. Flash do tecido pulmonar congelados
   1. Depois de coletar a LBA na etapa 3.2.1, o peito é aberto e pulmões liberadas com 10 mL de PBS frio através do ventrículo direito para remover o sangue. Flash congelar o tecido pulmonar em nitrogênio líquido. Tecido pulmonar congelado pode ser armazenado a-80 ° C por até 6 meses até o uso para medições de EPR.
   2. Estabilizar o tecido pulmonar em gelo seco com uma pinça e cortar vários pedaços pequenos (5-15 mg) do tecido pulmonar, usando uma lâmina de borda única.
   3. Pesar o tecido em um tubo de 1,5 mL, colocar o tubo na escala e tare a balança, em seguida, adicione os pedaços de tecido e registar a sua massa.
   4. No tecido no tubo de 1,5 mL, adicione µ l 196 de KHB contendo DTPA e 4 µ l de CMH (0,2 mM) para alcançar um volume total de 200 µ l.
   5. Incube durante 1 h a 37 ° C em banho-maria.
   6. Spin para baixo (por alguns segundos) numa microcentrifuga a 3.884 x g.
   7. Coloque no gelo e pipetar 150 µ l do sobrenadante para o tubo de PTFE e congelar para as medições de 77 K, conforme descrito na seção 2.3.
      Nota: Para este método, a heterogeneidade da lesão precisa ser considerado. Para uma lesão pulmonar induzida por bleomicina, dado que é uma lesão muito heterogênea, é aconselhável cortar vários pedaços de tecido de diferentes partes do pulmão de cada rato. Alternativamente, um pedaço maior de tecido pode ser homogeneizado em tampão KHB contendo 100 µM DTPA em uma relação de peso-para-volume 1:6 (mg / µ l), conforme descrito abaixo.
2. Tecido de pulmão fresco preservado no buffer de sacarose
   1. Lave os pulmões lavaged com PBS fria para remover sangue como feito no passo 3.1.2.
   2. Homogeneizar o tecido de pulmão fresco em tampão Tris-EDTA com 0,25 M de sacarose com um rácio de 1:6 pulmão/tampão (mg / µ l) usando homogenizacao moedor de tecido com um vidro ou pilão PTFE.
   3. Adicione 50 µ l de homogeneizado o pulmão a 450 µ l de KHB contendo 100 µM DTPA.
   4. Em um tubo de 1,5 mL (em um volume total de 100 µ l), para µ l 98 de pulmão homogeneizado em KHB, adicione 2 µ l de CMH de estoque de 10 mM para obter uma concentração final de 0,2 mM.
   5. Incube durante 20 min 37 ° C em banho-maria.
   6. Colocar as amostras no gelo e carregá-los em um tubo capilar. Execute o EPR na RT (configurações usadas na etapa 2.1.13).
   7. Para testar a contribuição de determinadas espécies e fontes usando diferentes inibidores, pré-tratamento 88 µ l de pulmão homogenate + /-inibidor, ajustando com KHB para atingir um volume final de 98 µ l. Neste experimento, os inibidores incluíam 10 µ l de SOD (100 U/mL), 4 µ l de deferoxamina (DFO; concentração final = 800 µM), ou 4 µ l de cloreto de diphenyliodonium (DIP; concentração final = 100 µM). Incube durante 20 min a 37 ° C em banho-maria.
   8. Adicionar 2 µ l de CMH e incubar durante mais 20 minutos a 37 ° C, seguido por medições de EPR, como descrito acima. Inclua uma única amostra em branco combinada com CMH KHB contendo tampão de sacarose. Alternativamente, armazene alíquotas dos restantes homogenates de pulmão (passo 3.1.2) a-80 ° C para medições futuras.
      Nota: O volume total pode ser dimensionado conforme necessário.
3. Medições de EPR em tecido pulmonar de ratos injetados com rotação sondas na vivo (no RT usando tecido celular)
   1. Prepare a solução-mãe CPH dissolvendo 4,9 mg de CPH em 1 mL de tampão de fosfato 50mm filtrada e pobre em oxigênio.
   2. ANESTHETIZE ratos com isoflurano inalado (1,5-4%) por 20-30 segundos até que não respondem aos pés pitada. Injetar camundongos através de retroorbital rota com 100 µ l de sonda de rotação CPH para um peso de corpo do mouse 25g (dose final = 20 mg/kg) e permitir que a sonda circular por 1 h. imediatamente após a injeção de retroorbital, adicione uma gota de proparacaine 0,5% HCl na área dos olhos para preve dor nos olhos NT e ressecamento. Monitorar os ratos por 1h e proceder à colheita de tecidos.
   3. Colheita do tecido pulmonar, como descrito acima e flash congelar os pulmões.
   4. Corte de 20-30 mg de tecido congelado em gelo seco e registrar o peso exato.
   5. Limpe cuidadosamente o tecido com limpeza toalhetes para absorver qualquer água de superfície.
   6. Coloque o tecido dentro da janela da célula de tecido (um acessório permite medições de EPR para amostras de tecido) e executar o EPR para determinar o total de rodadas. Os dados podem ser expressas como total de rodadas por mg de tecido.

5. análise de dados

1. Simule os espectros EPR usando o módulo SpinFit incorporado no software Xenon do espectrómetro bancada EMXnano EPR. Determine a concentração de nitroxide pelo módulo SpinCount. Como alternativa, pode efectuar-se uma curva de calibração de um nitroxide estável como 4-hidroxi-TEMPO ou TEMPOL, e a concentração pode ser obtida comparando a intensidade do sinal com a amostra e padrão.
2. Para os dados coletados em 77 K, use integração dupla, seguida por SpinCount.

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Resultados

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Discussão

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	LifeTech	10566-016	cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)	Sigma Aldrich	D6518-5G
sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212	used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )	Fisher Scientific	BP363-500	used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )	Sigma Aldrich	P-5379	used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish
Krebs-Henseleit buffer (KHB)	(Alfa Aesar, Hill)	J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)	Sigma Aldrich	S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich	P1585-1MG	Dissolve in DMSO
Antimycin A (AA)	Sigma Aldrich	A8674-25MG	Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)	Enzo Life Sciences	ALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)	Enzo Life Sciences	ALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)	Enzo Life Sciences	ALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)	Enzo Life Sciences	ALX-430-131-M250
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride	Sigma Aldrich	43088
Deferoxamin mesylate salt	Sigma Aldrich	D9533-1G
Critoseal	Leica	39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark	Sigma Aldrich	708733	Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID	NORELL	1598774A	Teflon tubing
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR	NORELL	94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer	Bruker BioSpin GmbH	E7004002
EMX NANO TISSUE CELL	Bruker BioSpin GmbH	E7004542