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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli expressando co um RNA quimérico que contém o RNA de interesse em um andaime viroid e uma planta ligase do tRNA. O principal produto é uma molécula circular que facilita a purificação de homogeneidade.

Resumo

Com interesse crescente em biologia do RNA e a utilização de moléculas de RNA em sofisticadas aplicações biotecnológicas, limitam-se os métodos para produzir grandes quantidades de RNA recombinante. Aqui, descrevemos um protocolo para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli , com base na expressão co de uma molécula quimérico que contém o RNA de interesse em um andaime viroid e uma planta ligase do tRNA. Viroides são relativamente pequenas, não-codificantes, altamente base-emparelhado RNAs circulares que são infecciosas para plantas superiores. O host planta tRNA ligase é uma enzima recrutada por viroides que pertencem à família Avsunviroidae, tais como berinjela viroid latente (ELVd), para mediar a circularização de RNA durante a replicação viroid. Embora ELVd não Replica em e. coli, um precursor do ELVd eficientemente é transcrito pela RNA polimerase de e. coli e processado pelas martelo incorporado ribozimas em células bacterianas, e os monômeros resultantes são circularizou pela ligase do tRNA co expressa atingindo uma concentração notável. A inserção de um RNA de interesse no cadafalso ELVd permite a produção de dezenas de miligramas do RNA recombinante por litro de cultura bacteriana em condições laboratoriais regulares. Uma fração principal do produto do RNA é circular, um recurso que facilita a purificação do RNA recombinante de homogeneidade virtual. Neste protocolo, um correspondente de DNA (cDNA) complementar ao RNA de interesse é inserido em uma determinada posição do cDNA ELVd em um plasmídeo de expressão que é usada, ao longo do plasmídeo para expressar co berinjela ligase do tRNA, para transformar e. coli. Expressão co de ambas as moléculas sob o controle dos promotores constitutivos fortes leva à produção de grandes quantidades de RNA recombinante. O RNA recombinante pode ser extraído as células bacterianas e separa a maior parte dos RNAs bacterianas, aproveitando sua circularidade.

Introdução

Em contraste com DNA e proteínas, protocolos para fácil, eficiente e econômica de produção de grandes quantidades de RNA não são abundantes. No entanto, investigação e indústria demanda quantidade crescente destas biomoléculas para investigar suas propriedades biológicas únicas1, ou para ser empregado em sofisticadas aplicações biotecnológicas, incluindo a sua utilização como altamente específico aptamers 2, agentes terapêuticos3ou pesticidas seletivos4. In vitro a transcrição e síntese química são comumente usados em pesquisas para produzir RNA. No entanto, estes métodos implicam limitações importantes quando grandes quantidades de produtos são necessárias. A alternativa lógica é usar a maquinaria de transcrição endógeno das células vivas, seguido de um processo de purificação para separar os RNAs de interesse dos companheiros celulares. Na sequência desta estratégia, foram desenvolvidos métodos para produzir RNA recombinante em células bacterianas, tais como o laboratório-friendly Escherichia coli5 ou o marinho roxo fototróficas alfa-Proteobacteria Rhodovolum sulfidophilum 6. a maioria dos métodos para produzir RNA recombinante em bactérias dependem a expressão de um andaime nativo de RNA altamente estável, tais como um tRNA ou um rRNA, no qual o RNA de interesse é inserido7. Isso impõe a necessidade de liberar o RNA de interesse fora a molécula quimérico, se a presença de RNA extra é um problema para as aplicações a jusante de8. Outro conceito em biotecnologia de RNA de recombinação é a produção de complexos ribonucleoprotein recombinante que pode ser o produto desejado por si ou usado como uma estratégia de proteção para aumentar a estabilidade do RNA de interesse9, 10. Da mesma forma, a produção de RNAs circulares também tem sido sugerida como uma estratégia para gerar mais estável produtos11.

Recentemente desenvolvemos um novo método para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em e. coli que participa em três dos conceitos acima: a inserção de RNA de interesse em um andaime de RNA circular altamente estável e a expressão co do RNA recombinante com uma proteína de interação provavelmente produzir um complexo de ribonucleoprotein estável que se acumula em quantidades notáveis em bacteriana células12. Em contraste com a evolução do anterior, usamos um andaime de RNA completamente alheio a Escherichia coli, ou seja um viroid. Viroides são um tipo muito particular de agentes infecciosos de plantas superiores que são constituídas exclusivamente por um relativamente pequeno (246-401 nt) altamente emparelhado-base de RNA circular13. Curiosamente, viroides são não-codificantes RNAs e, sem a ajuda de suas próprias proteínas, eles são capazes de completar ciclos infecciosos complexos no hospedeiros infectados14. Esses ciclos incluem a replicação de RNA RNA-para nos núcleos ou cloroplastos, dependendo da família viroid —Pospiviroidae ou Avsunviroidae, respectivamente — movimento através da planta infectada e evasão da resposta defensiva do hospedeiro. Viroides devem ser classificados entre os RNAs mais estáveis na natureza, em consequência de ser um RNA circular nu e ter que sobreviver no ambiente hostil de células vegetais infectados. Esta propriedade pode fazer viroides particularmente apropriada como andaimes para estabilizar a recombinação RNA em abordagens biotecnológicas. Além disso, o novo método baseia-se na expressão co do cadafalso viroid com uma interação da planta. Viroides replicam através de um mecanismo de rolamento-círculo no qual host enzimas são recrutadas para catalisar as diferentes etapas do processo. Notadamente algumas viroides, mais especificamente aqueles que pertencem a família Avsunviroidae15, contêm ribozimas que também estão envolvidas na replicação. Dependendo da espécie de viroid, transcrição de viroid RNAs é mediada pelo host RNA polimerase II ou o cloroplástico nuclear codificado RNA polimerase (NEP). Processamento de Viroid RNA parece ser catalisada por um host tipo III RNase, embora em viroides com ribozimas oligoméricas RNA intermediários Self cleave durante a replicação. Finalmente, os resultante monômeros viroid são circularizou, dependendo da família viroid, pelo ligase do DNA de anfitrião 1 ou o isoform cloroplástico de tRNA ligase16,17. Esta última enzima está envolvida na ligadura das formas monoméricas dos viroides da família Avsunviroidae, como berinjela viroid latente (ELVd)18.

No decorrer de um trabalho para analisar os requisitos de ELVd sequência e estruturais que determinam o reconhecimento pela berinjela (Solanum melongena L.) ligase do tRNA, montamos um sistema experimental baseado na expressão co de ambas as moléculas em e. coli 19. notamos que as transcrições de ELVd mais-que-unidade self cleave eficientemente em células de Escherichia coli através da martelo incorporado ribozimas e que eram os monómeros de viroid resultante com 5'-hidroxila e 2', 3'-fosfodiéster termini eficientemente circularizou pelo co expressa berinjela ligase do tRNA. Ainda mais, o RNA circular viroid resultante alcançou uma inesperada alta concentração em Escherichia coli, superiores dos rRNAs endógena12. Ausência de replicação intermediários indicou falta de ELVd de RNA RNA-para amplificação nestas células bacterianas. Curiosamente, inserção de RNAs heterólogos em uma posição específica da molécula viroid teve um efeito moderado na acumulação do circular viroid-derivado RNAs12. Estas observações nos fez imaginar um método para produzir grandes quantidades de recombinante RNAs em bactérias. Neste método, os cDNAs correspondente as RNAs de interesse são inseridos no cDNA a ELVd e o RNA quimérico resultante é expressa em e. coli através de um forte promotor constitutivo. Para o sistema funcionar, e. coli devem ser transformados co com um plasmídeo para expressar a berinjela ligase do tRNA. A transcrição de mais-do que-unidade ELVd-derivado é processada pelas martelo incorporado ribozimas e os monómeros resultantes com o termini apropriado são reconhecidos e circularizou pelo co expressa ligase do tRNA. Deste modo, o RNA de interesse é inserido em um andaime circular muito estável, consistindo da molécula circular viroid. Este RNA recombinante quimérico é provavelmente mais estabilizado no interior das células de Escherichia coli , pela formação de um complexo através da interação com a ligase do tRNA do ribonucleoprotein. Usando este método (Veja o protocolo abaixo), RNA aptamers, gancho de cabelo RNAs e outros RNAs estruturadas facilmente produzidos em quantidades de dezenas de miligramas por litro de cultura de Escherichia coli em condições laboratoriais normais e purificados a homogeneidade tomando vantagem de circularidade12.

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Protocolo

1. plasmídeo construção

  1. Amplificar pelo PCR (ou pela transcrição reversa PCR se a partir de um modelo de RNA) o cDNA correspondente para o RNA de interesse usando as primeiras demão com extensão de 5' para permitir que o assembly para o plasmídeo de expressão. Para evitar mutações indesejáveis, use uma DNA polimerase de alta-fidelidade.
    1. Para inserir o cDNA no plasmídeo de expressão por Gibson montagem20, adicionar as seguintes extensões de 5' para os primers PCR: avanço, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; reversa, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X representa nucleotídeos homólogos às extremidades terminais do RNA de interesse.
    2. Incubar durante 30 s a 98 ° C, seguido de 30 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 30 s a 72 ° C e uma extensão final de 10 min a 72 ° C.
  2. Digest 100 ng do plasmídeo pLELVd-BZB com 10 U da enzima de restrição do tipo-IIS Bpi por 1 h a 37 ° C, em uma reação de 20 µ l em um 0,5 mL do tubo no buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50mm NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Nota: Todos os plasmídeos estão disponíveis mediante pedido ao autor correspondente. BPI É equivalente a Bbs eu.
  3. Separe os produtos PCR e digestão por eletroforese em gel de agarose a 1% em tampão TAE (40 mM Tris, pH de ácido acético, EDTA 1 mM, 20 mM 7.2). Manche o gel durante 15 minutos, agitando em 200 mL de brometo de etídio 0,5 µ g/mL. Visualize o DNA usando um transiluminador UV e cortar as bandas correspondentes do cDNA amplificado e o Bpi eu digerido do plasmídeo (2046 bp) usando uma lâmina de bisturi.
    Nota: BPI Eu digestão de pLELVd-BZB também libera um produto de bp 528 correspondente ao repórter de azul e branco de LacZ.
  4. Eluir os DNAs dos fragmentos gel usando colunas de sílica gel (gel kit de recuperação de DNA na Tabela de materiais) e quantificar a concentração de DNA pela análise espectrofotométrica.
  5. Configure uma reação de montagem Gibson usando o cDNA amplificado e o plasmídeo digerido. Use um 3 vezes excesso molar de inserção contra vetor20. Incubar durante 1 h a 50 ° C e purificar os produtos de reação usando uma coluna de sílica gel (DNA limpo & kit de concentrador na Tabela de materiais).
  6. Use os produtos purificados da reação de electroporate competente montagem Gibson Escherichia coli DH5α células. Usando cubetas de eletroporação de 1 mm, aplique as seguintes configurações: 1.500 V e 5 ms. Incubar durante 1 h a 37 ° C em caldo super otimizado com repressão catabolite (SOC; triptona de 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L, 0,5 g/L em NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 glicose de 20 mM, pH 7,0) meio líquido e então propagação para Luria-Bertani (LB; triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, 10 g/L de NaCl) placas de ágar (1,5%) contendo ampicilina de 50 µ g/mL.
    1. Para tela para colônias correspondentes a transformada e. coli clones que provavelmente incorporaram a inserção, 15 min antes do chapeamento as células electroporated, espalhar 30 µ l de 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) em dimetilformamida. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
  7. Escolha várias colónias brancas e crescer durante a noite a 37 ° C em meio líquido LB. Purificar plasmídeos usando um miniprep kit (veja a Tabela de materiais) e analisar seus tamanhos por eletroforese em gel de agarose a 1% em tampão TAE.
  8. Selecione o plasmídeo recombinante mais provável com base na migração eletroforética em comparação com o controle pLELVd-BZB. Confirmar a sequência do plasmídeo selecionado pelo sequenciamento utilizando primers 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' e 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' que ladeiam a fita toda expressão em pLELVd-BZB.
    Nota: Lembre-se que este plasmídeo contém um 528 polylinker bp com o marcador de LacZ é substituído do cDNA de interesse. Mapeamento de restrição pode ajudar a selecionar o plasmídeo recombinante bem.

2. expressão do RNA

  1. Co-electroporate (ver condições no 1.6) o selecionado Escherichia coli estirpe (Escherichia coli BL21 ou um derivado BL21) com o pLELVd-BZB-derivado que contém o cDNA correspondente para o RNA de interesse e do plasmídeo p15LtRnlSm co expressar o berinjela ligase do tRNA. Use o Escherichia coli HT115(DE3), que carece de RNase III21, para expressar RNAs com regiões de longa dupla-hélice.
    Nota: Tanto o RNA de interesse e a ligase tRNA mRNA são transcritas pelo polymerase do RNA de Escherichia coli . Não lysogen DE3 para expressar T7 ARN-polimerase é necessária a estirpe de e. coli , embora a presença desta lysogen tem sem efeitos deletérios.
  2. Após incubação de 1 h a 37 ° C em meio líquido SOC, placa electroporated de bactérias em meio sólido LB, contendo 50 µ g/mL ampicilina e cloranfenicol 34 de µ g/mL. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
  3. Escolher uma colônia e inocular um 1L perplexo Erlenmeyer de 250 ml de meio líquido maravilhoso caldo (TB) (12 g/L triptona, 24 g/L de levedura extrato, 0,4% de glicerol, 0,17 M KH2PO4e 0,72 M K2HPO4), contendo 50 ampicilina µ g/mL e cloranfenicol 34 de µ g/mL. Incube a 37 ° C, com agitação vigorosa em 180 rotações por minuto (rpm). Após a inoculação da cultura da colheita bactérias entre 12 e 16 h.

3. purificação e extração do RNA

  1. Para fins analíticos, tome alíquotas de 2 mL da cultura nos pontos de tempo desejado e centrifugar a 14.000 x g por 2 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM de EDTA) pela utilização do vortex.
    1. Adicionar um volume (50 µ l) de uma mistura 1:1 (v/v) de fenol (saturado com água e incubado com Tris-HCl, pH 8.0 pH 8.0) e clorofórmio. Quebrar as células vortexing vigoroso e separar as fases aquosas e orgânicas por centrifugação por 5 min a 14.000 x g.
    2. Cuidadosamente, recupere as fases aquosas (superior) que contém o RNA total bacteriano.
      Nota: As preparações podem ser armazenadas a-20 ° C para posterior análise.
  2. Para fins preparativa, despeje a cultura em um frasco de 250 mL centrífuga e spin-down células a 14.000 x g durante 10 min. Discard sobrenadante. Lave as células por resuspending em 30 mL de água. Transfira para um tubo de centrífuga e spin para baixo as células novamente nas mesmas condições.
  3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de tampão de cromatografia (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM de NaCl, 0,2 mM EDTA) pela utilização do vortex.
    Nota: Neste momento, as células podem ser congeladas a-20 ° C para prosseguir com a purificação em qualquer outro momento.
  4. Usando uma preparação bacteriana fresca ou descongelada, quebrar células adicionando 1 volume (10 mL) de fenol: clorofórmio (consulte a etapa 3.2) e num Vortex vigorosamente.
  5. Centrifugar durante 10 min a 12.000 x g, recuperar a fase aquosa e extrair novamente com 1 volume (10 mL) de clorofórmio nas mesmas condições.
    Nota: A preparação do RNA pode ser armazenada a-20 º C neste momento.
  6. Purifica ainda mais o RNA total bacteriano por cromatografia de troca aniónica. Filtre a preparação do RNA através de um filtro de seringa µm 45 e carga em uma coluna de diethylethanolamine (DEAE) de 1 mL.
    1. Para a purificação de cromatografia, use um sistema de cromatografia líquida em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Antes de carregar de amostra, equilibrar a coluna com 10 mL de tampão de cromatografia (consulte Etapa 3.3 para composição).
    2. Carregar a amostra e lavar a coluna com 10 mL de tampão de cromatografia. Eluir RNA com 20 mL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) e recolher as alíquotas de 1 mL.
      Nota: RNA elutes rapidamente nas fracções iniciais. A coluna pode ser reutilizada para novas purificações. Por isso, lavar a coluna com 10 mL de água e armazenar a 4 ° C em 20% de etanol.
  7. Desde uma parte importante da recombinação que RNA acumula em e. coli em uma forma circular, esta propriedade pode ser lucrada para purificação de homogeneidade12. Separe os RNAs circulares as contrapartes lineares por eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) combinando não-desnaturação e desnaturação (ureia 8m) condições12,22.

4. RNA análise

  1. Preparar um gel de poliacrilamida de 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, relação massa) em ureia de 8 M contendo TBE tampão (89 mM Tris, o ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM).
  2. Mix 20 µ l de preparações de RNA com 1 volume (20 µ l) de carga Reserva (98% formamida, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,0025% de azul de bromofenol e 0,0025% xileno cianol), incubar por 1,5 min a 95 ° C, em um bloco de aquecimento e snap cool no gelo.
  3. Carregar as amostras no gel poliacrilamida e executar a eletroforese em condições apropriadas, dependendo das dimensões do gel (por exemplo, executar 140 x 130 x 2 mm géis para 2,5 h a 200 V). Manchar o gel durante 15 min em brometo de etídio 0,5 µ g/mL, lavar com água e visualizar o RNA sob luz UV.

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Resultados

Para produzir RNA de recombinação em Escherichia coli usando o sistema derivado de ELVd12, o RNA de interesse é enxertado em um andaime de RNA ELVd. Este RNA quimérico é co expressa ao longo da berinjela ligase do tRNA em e. coli. Uma vez processadas, clivado e circularizou, o quimérico RNA circular, do qual o RNA de interesse se projeta, provavelmente forma um complexo com a enzima de berinjela co expressa que atinge notável concentração...

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Discussão

Enquanto pesquisava a sequência de ELVd e requisitos de estrutura envolvidos no reconhecimento pela berinjela ligase do tRNA, notamos essa expressão co de ambas as moléculas no host não Escherichia coli levado a uma inesperada grande acumulação de viroid circular formas em células bacterianas19. Entendemos que o grande acúmulo de viroid RNA em e. coli mais provavelmente foi consequência da co, expressando uma molécula de RNA altamente estável, tais como o relativamente...

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Divulgações

Os autores declaram que a tecnologia descrita neste protocolo foi patenteado (nos patente no. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios BIO2017-83184-R e BIO2017-91865-EXP do espanhol Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (co-financiado fundos do FEDER).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermo ScientificF530S
Bpi IThermo ScientificER1011
AgaroseConda8010D1 low EEO
TrisPanReac AppliChemA1086,1000
Acetic acidPanReac AppliChem131008.1214
EDTASigma-AldrichE5134-500G
Ethidium bromidePanReac AppliChemA1152,00251%
Zymoclean Gel DNA RecoveryZymo ResearchD4001
NanoDropThermoFisher ScientificND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BioLabsE2621S
DNA Clean & ConcentratorZymo ResearchD4003
EporatorEppendorf4309000019
Escherichia coli DH5αInvitrogen18265-017
TryptoneIntron BiotechnologyBa2014
Yeast extractIntron Biotechnology48045
NaClPanReac AppliChem131659.1211
AgarIntron Biotechnology25999
AmpicillinPanReac AppliChemA0839,0010
X-galDuchefaX1402.1000
N,N-DimethylformamidePanReac AppliChem131785.1611
NucloSpin PlasmidMacherey-Nagel22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)Novagen69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)Ref. Timmons et al., 2001
ChloramphenicolDuchefaC 0113.0025
GlycerolPanReac AppliChem122329.121187%
KH2PO4PanReac AppliChem131509.1210
K2HPO4PanReac AppliChem122333.1211
HClPanReac AppliChem131020.1211
PhenolScharlauFE0479100090%
ChloroformPanReac AppliChemA3691,1000
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF columnGE Healthcare Life Sciences17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography systemGE Healthcare Life Sciences11001313
AcrylamydePanReac AppliChemA1089,10002K
N,N’-methylenebisacrylamideSigma-AldrichM7279-100G
UreaPanReac AppliChem146392.1211
Boric acidPanReac AppliChemA2940,1000
FormamidePanReac AppliChemA0937,2500
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026-5G
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamineSigma-AldrichA4929-5G

Referências

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