Transdermal medição da taxa de filtração Glomerular em ratos

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para medir a taxa de filtração glomerular (TFG) em consciente, movimentando-se livremente ratos usando um monitor de TFG transdérmica.

Resumo

Transdermal análise da taxa de filtração glomerular (TFG) é uma técnica estabelecida que é usada para avaliar a função renal em modelos do rato e do rato, de insuficiência renal aguda e doença renal crônica. O sistema de medição consiste de um detector de fluorescência miniaturizado que é diretamente ligado à pele na parte de trás dos animais conscientes, livremente movente e mede a cinética de excreção do traçador GFR exógeno, isotiocianato de fluoresceína (FITC) sinistrin conjugado (uma analógico de inulina). Este sistema tem sido descrito em detalhes em ratos. No entanto, devido a sua menor dimensão, medição de TFG transcutânea em camundongos apresenta desafios técnicos adicionais. Neste artigo, nós fornecemos, portanto, o primeiro guia prático detalhado para o uso de monitores de transdermal GFR em camundongos com base na experiência combinada de três investigadores diferentes que vêm realizando este ensaio em ratos ao longo de vários anos.

Introdução

O uso de transcutânea GFR monitores em camundongos foi primeiramente relatada por Schreiber e colegas em 2012 e foi validado comparando as medições de TFG obtidas usando esta técnica, com resultados obtidos por medição directa do apuramento de bólus FITC-sinistrin de amostras de sangue serial¹. Até à data, tem havido 35 publicações em que monitores de TFG transcutânea têm sido utilizados em ratos e camundongos (uma lista atualizada regularmente de artigos de periódicos e resumos de conferência, em que o monitor de TFG pré-clínicos foi usado pode ser encontrada na MediBeacon site²). Medições de TFG Transdermal em ratos e camundongos tem sido descrita em um número de publicações^1,3,4,5, e um tutorial em vídeo demonstrando seu uso em ratos tem sido publicado⁶. No entanto, medição em camundongos apresenta desafios técnicos adicionais. Aqui, nós fornecemos o primeiro guia prático detalhado para o uso de monitores de TFG transdermal em camundongos.

Há uma variedade de razões por que os investigadores estão começando a favorecer o uso de monitores de TFG transdérmica para avaliar a função renal em modelos de roedores. Medição de Transdermal de apuramento FITC-sinistrin foi mostrada para fornecer uma medida mais sensível e exata da função renal, em comparação com os tradicionais parâmetros de função renal como soro creatinina e sangue ureia nitrogênio (BUN)^{7, 8}. Com a implementação de um algoritmo de avaliação melhorada, Friedemann e colegas demonstraram que o sistema atinge precisão comparável ao padrão-ouro, a técnica de infusão constante para TFG medida³. Estudos recentes demonstraram também que a análise sequencial usando monitores de TFG transcutânea pode ser usado para estudar cedo alterações na função renal, bem como a recuperação funcional após a indução de insuficiência renal aguda (LRA) sem interferir com o sangue dos animais volume ou hemodinâmica, desde que o ensaio não exige sequencial sangue amostragem^9,10. A capacidade de medir o TFG com alta precisão e sensibilidade repetidamente no mesmo animal torna esta técnica atraente para uma variedade de disciplinas de investigação diferentes. Transdermal GFR monitores utilizaram-se pelas empresas farmacêuticas para avaliar a toxicidade de novos compostos, bem como nas universidades de investigação básica e de translação.

Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as directrizes locais do Reino Unido e EUA. Experimentos conduzidos na Universidade de Liverpool foram realizados sob uma licença concedida ao abrigo da lei de animais (procedimentos científicos) UK 1986 e foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade de Liverpool. Todas as experiências em animais realizadas no centro médico da Universidade Vanderbilt foram aprovadas pelo Comitê de uso e cuidado Animal institucional do Vanderbilt.

1. preparar o FITC-sinistrin

1. Prepare-se 40 mg/mL FITC-sinistrin em salina tamponada fosfato (PBS).
   Nota: Alíquotas podem ser armazenadas a-20 º C durante vários meses sem diminuição perceptível na qualidade; no entanto, vários ciclos de congelamento e descongelamento devem ser evitados. FITC-sinistrin é sensível à luz...-Mantenha o tubo protegido da luz.
2. Calcule o volume de FITC-sinistrin necessário para cada mouse:
   1. Pese cada rato em cada dia da medição.
   2. A dose recomendada é de 0,15 mg FITC-sinistrin por grama de peso corporal.

2. Mouse preparação

1. Prepare as gaiolas separadas para os ratos enquanto submetidos a medições de TFG. Fornece toalhas de papel absorvente e alguns pellets de comida.

3. remover o cabelo do Mouse (1-2 dias antes da medição GFR)

1. Anestesiar o mouse com 3% de isoflurano e uma vez que o mouse está dormindo, manter a anestesia com isoflurano 1,5 a 2%, dependendo da taxa de respiração do rato. Coloque o mouse inclinado sobre uma almofada de calor.
2. Use um barbeador elétrico, indo contra a direção do pelo, para remover a maioria do pelo de um lado de trás do rato. Fazer a barba da parte superior das patas até o pescoço e entre as costelas.
3. Aplique uma camada fina de creme de depilação para a área depilada, utilizando um cotonete (figura 1A). Mova o cotonete contra a direção do pelo para assegurar que o creme é aplicado como perto da pele quanto possível.
4. Retire o creme após 1 a 3 min por lavá-la com cotonetes de algodão e água morna. Não realize a medição se a pele parece muito vermelha e irritada após a medição e não repetir a depilação dentro de 72 h para não danificar a pele.

4. preparar o Monitor de TFG Transdermal

1. Use um dos dois tamanhos de patches que estão disponíveis. O primeiro é de 2,5 x 3 cm² em tamanho e pode ser usado diretamente para medições em camundongos. Os outros patches são 6 x 3 cm² em tamanho e são feitos para serem usados em ratos ou animais maiores, mas podem ser cortados para um tamanho menor para uso em camundongos.
2. Descascar o revestimento protetor fora um lado do patch e manter o dispositivo de TFG no lado adesivo, posicionando os LEDs exatamente acima da janela transparente.
3. Corte o excesso remendo adesivo para ajustar o tamanho da bateria e ficar de um lado do patch para a bateria.

5. anexar o Monitor de TFG Transdermal

1. Anestesiar o mouse com isoflurano, conforme descrito na etapa 3.1 e posicione o mouse inclinado sobre uma almofada de calor. ANESTHETIZE ratos apenas para colocação do monitor GFR transdermal e injeção de FITC-sinistrin; permita a recuperação da anestesia para a medição do decaimento FITC.
2. Limpe a pele previamente depilada com etanol a 70%. Coloque aproximadamente 12 cm de fita de seda hipoalergênica sob o mouse (figura 1B; a largura da fita deve ser reduzida para 1,5 a 2 cm de modo que não é demasiado largo para o mouse).
3. Posicione a fita de modo que somente aproximadamente 2 cm é do lado direito do mouse, e o resto é à esquerda. Dobre a borda sobre um do lado direito da fita para fácil colocação e remoção após a medição. As instruções de esquerda-direita para etapas 5.3 e 5.6 são para a colocação do dispositivo no lado direito do animal e podem ser trocadas para colocação do dispositivo no lado esquerdo do animal, se necessário.
4. Conecte a bateria ao dispositivo, remover o revestimento protetor da bateria e colocá-lo firmemente na parte superior do dispositivo. O dispositivo está pronto para usar e aquisição de dados começa quando os azuis díodos (LEDs) começam a piscar.
5. Retire o apoio do dispositivo e colocar sobre a pele depilada. Colocar o dispositivo de forma a janela expondo os LEDs é sobre as costelas – não tê-lo perto demais para a coluna vertebral ou Membros (Figura 1).
6. Fixe o dispositivo com a fita branca. Prenda o lado direito primeiro (Figura 1), envolvendo-o firmemente em torno de todas as bordas do dispositivo e, em seguida, envoltório do lado esquerdo ao redor do rato e o dispositivo (Figura 1E). Idealmente, o lado esquerdo da fita cobre apenas o dispositivo, e do lado direito termina sob o abdômen do rato.
7. Anexe a fita pressionando-ao lado da circunferência do corpo do mouse. A fita precisa ser anexado com firmeza, mas não apertada. Se é muito solto, em seguida, o dispositivo irá mover muito e causar artefatos de movimento. No entanto, não deve ser tão apertado que restringe a respiração ou movimento ou coloca muita pressão sobre a pele.
8. Deixe o dispositivo intocado por 3 minutos antes da injeção de FITC-sinistrin para permitir que um fundo constante leitura para serem levados. Neste tempo, quente a cauda com uma almofada de calor ou luva cheia com água morna para preparar para a injeção de veia da cauda (se estiver usando esta rota).

6. FITC-sinistrin injeção

1. Prepare uma seringa de insulina com a quantidade calculada de FITC-sinistrin necessário para injeção (isto pode ser arredondado para o mais próximo 10 μL).
2. Administre FITC-sinistrin pela veia da cauda ou injeção retro-orbital. FITC-sinistrin deve ser administrado em um bólus suave mas rápida para evitar vários picos na curva de apuramento. É melhor administrar uma dose única parcial do to ter múltiplas tentativas de administrar o FITC-sinistrin.

7. medir o TFG

1. Coloque o mouse em uma gaiola por conta própria para recuperar de isoflurano anestesia e para a duração do período de medição.
2. Observar o rato na gaiola para 1,5 h e em seguida, remover o dispositivo. Remover o dispositivo do mouse consciente é geralmente bem tolerada pelo mouse, rápido e eficiente, mas os novos usuários podem preferir anestesiar o mouse para esta etapa.
   1. Como uma opção, anestesiar o mouse com isoflurano.
   2. Como a outra opção, coloque o mouse sobre a grelha em cima da gaiola, permitindo que o mouse agarrar as barras de metal, enquanto o dispositivo é removido.
3. Retire a fita branca de gesso de debaixo da barriga em um movimento rápido, suave e remover o dispositivo e gesso preto da pele. Cuidado que a bateria não desconecte o dispositivo ainda.
4. Retorne o mouse para sua gaiola em casa.

8. leitura e avaliação dos dados

1. Cuidadosamente, desconecte a bateria do dispositivo
2. Conecte o dispositivo ao cabo USB e, em seguida, conecte o cabo ao computador
3. Abra o software de leitura (Sensor_ctrl_app.exe)
4. Em ordem, clique em "conectar", "ler", "re-nome" e "save", em seguida, feche o programa
5. Processar e avaliar dados do software de análise, conforme descrito no respectivo manual

Resultados

Nesta seção apresentamos resultados representativos da utilização do monitor GFR transdérmica. O monitor de transdermal tem sido usado em uma variedade de cepas de rato e modelos de AKI e CKD².

A Figura 2 mostra curvas de apuramento FITC-sinistrin representante em camundongos BALB/c machos antes e após a lesão de reperfusão de isquemia (IRI) com simultânea nefrectomia contralateral. FITC-sinistrin está desmarcado rapidamente a circulação em ratos saudáveis (Figura 2A), mas o apuramento está dramaticamente atrasado em camundongos com AKI (Figura 2B, C). Em camundongos com AKI muito severa, não pode haver qualquer mudança na fluorescência do FITC-sinistrin durante o período de medição de 90 minutos, indicando uma completa ausência de filtração glomerular (Figura 2).

Medição de TFG Transdermal é minimamente invasiva e pode ser usada para monitorar alterações na função renal em ratos a mesma ao longo de vários pontos de tempo. A Figura 3 retrata mudanças na TFG determinado através de medições de liberação transdérmica sequencial FITC-sinistrin na linha de base e 1, 2 e 4 dias após a indução IRI (isquemia unilateral com nefrectomia contralateral simultânea). Dados mostrados incluem Half-Life do FITC-sinistrin afastamento (Figura 3A) e TFG (Figura 3B) calculado a partir do medido FITC-sinistrin afastamento Half-Life, como descrito por Schreiber et al.¹.

Na Figura 4, doença renal crônica (DRC) foi induzida em camundongos BALB/c machos realizando IRI unilateral prolongada, seguido de nefrectomia contralateral retardada, como descrito¹¹. GFR foi avaliada por liberação transdérmica FITC-sinistrin no dia 26 após o IRI inicial. O aumento de Half-Life FITC-sinistrin (Figura 4A) e, por conseguinte, a diminuição da TFG (Figura 4B), indicam insuficiência renal nestes ratos. Estes dados demonstram que a medida transcutânea de TFG pode ser usada para medir mudanças na função renal em ratos com DRC.

Figura 5A mostra que Half-Life FITC-sinistrin correlaciona-se estreitamente com semi-quantitativa de avaliação histológica da lesão tubular sobre as medições de gama completa de TFG em camundongos ilesos e em camundongos com diferentes severidades de IRI-induzido AKI. Em contraste, o soro creatinina e sangue azoto ureico (BUN) mostrou um positivo mas mais fraca correlação com folga FITC-sinistrin (Figura 5B, C), indicando que as medições de TFG transcutânea fornecem uma medida mais confiável de renal lesão (golo de lesão tubular) seguindo AKI IRI-induzido do que ou creatinina sérica ou BUN.

Figura 1: anexar o monitor de TFG transdermal. Fotografias da remoção do cabelo (A), colocação da fita sob o mouse (B), colocação do dispositivo na pele (C) do mouse e fixar o dispositivo envolvendo a fita ao redor do rato e o dispositivo (D-E), , por favor clique aqui para Ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: curvas de apuramento exemplo FITC-sinistrin em camundongos BALB/c machos antes e após a lesão de reperfusão de isquemia (IRI) com simultânea nefrectomia contralateral. Curvas de apuramento na linha de base (A) e um dia após cirurgia IRI (B) no mesmo mouse, indicando insuficiência da função renal neste rato. (C) afastamento curva de um mouse mais gravemente ferido um dia após a cirurgia IRI. Não havia nenhuma liberação de FITC-sinistrin durante o período de medição, indicando falha renal. Pontos de dados preto representam dados brutos, linhas azuis representam o ajuste 3-compartimento e linhas verdes representam os intervalos de confiança de 95%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: 8-10 semanas de idade de camundongos BALB/c masculino, foi submetido a isquemia unilateral com nefrectomia contralateral simultânea (n = 5). GFR foi avaliada na linha de base e nos dias 1, 2 e 4, após a cirurgia e comparado com ratos de operação controle (n = 5). Half-Life FITC-sinistrin em (A) foi utilizado, juntamente com o peso corporal dos ratos, para calcular a TFG em (B). Pontos de dados representam animais individuais e barras de erro representam média e erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: idade de camundongos BALB/c masculino 8-10 semanas foi submetido a isquemia unilateral com nefrectomia contralateral atrasada no dia 8 (n = 5). GFR foi avaliada por dia 26 e foi comparado aos ratos controle saudável correspondência idade (n = 5). Half-Life FITC-sinistrin em (A) foi utilizado, juntamente com o peso corporal dos ratos, para calcular a TFG em (B). Pontos de dados representam animais individuais e barras de erro representam média e desvio padrão. Lesão tubular foi marcado com base no grau de formação de necrose e elenco por um observador cego (L.R.) 0-50 em seções de rim ácido periódico-Schiff-manchado. Este método foi adaptado de Wang e colegas¹². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: correlação das três medidas de função/danos nos rins (avaliação histológica da lesão tubular (n = 39), creatinina sérica (n = 30) e azoto ureico (BUN) de sangue (n = 30)) com folga FITC-sinistrin (Half-Life). Camundongos BALB/c machos foram submetidos a períodos variáveis de pedículo renal unilateral de aperto (25 – 45 min) ou cirurgia de Souza, com simultânea nefrectomia contralateral para induzir diferente severidade de AKI, e histopatologia e parâmetros de função renal foram avaliados no dia 4 Depois IRI. O escore de lesão tubular mostrou uma forte correlação positiva com folga FITC-sinistrin (A; R² = 0,88), enquanto que o soro creatinina (B) e (C) ambos mostraram positiva mas mais fraca correlação com FITC-sinistrin autorização (R² = 0,64 e 0,52, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este manuscrito e o vídeo de treinamento que acompanha fornecem orientações práticas para o uso de transdermal monitores GFR em camundongos. As etapas mais críticas no procedimento são a fixação correta do dispositivo nas costas do animal e envolvendo firmemente a fita em torno do abdômen. A melhor posição é ligeiramente à esquerda ou direita da linha média, ao longo da caixa torácica. O patch e o dispositivo precisam ser firmemente ligados à pele, mas eles não devem ser tão apertados que restringir a respiração, movimento, ou afetar a circulação de sangue da pele sob o dispositivo, como isso levaria a medidas com defeito/imprecisas. Além disso, desde o monitoramento ocorre em camundongos conscientes depois que eles se recuperaram de anestesia, corrigi a colocação do dispositivo na parte do corpo com menor interferência de resultados de movimento nas medições transdérmica com pequenos artefatos de movimento. Por este motivo, é importante que o dispositivo não é colocado muito próximo a parte superior dos membros para que os ratos podem mover seus ombros livremente.

É importante depilar os ratos um ou dois dias antes da medição de TFG, como depilação afeta a medida de afastamento FITC-sinistrin, com dados preliminares indicando que depilação imediatamente antes da medição de transdermal TFG aumenta a meia-vida aparente de FITC-sinistrin. O mecanismo para isso é desconhecido. Portanto, a fim de obter medições correctas sobre vários pontos de tempo e entre as experiências, é aconselhável depilar os ratos com antecedência, para permitir que a pele se recuperar este processo antes de proceder às medições de TFG. Creme de depilação não deve ser aplicado para a mesma área da pele até 72 horas após uma aplicação prévia, para evitar dano químico para a pele. Em muitos casos, o re-crescimento de pelo leva vários dias ou até uma semana, e então re-aplicação de depilação creme dentro de 72 h pode ser facilmente evitado.

Porque acima de 50% de soro de creatinina é excretada pela seção tubular em ratos¹³, e porque há maior reabsorção de ureia dos túbulos renais, quando os ratos são desidratados¹⁴, creatinina sérica e BUN são pobres marcadores da função renal. No entanto, por causa de sua conveniência, estes ensaios continuam a ser usado como a principal medida da função renal em estudos pré-clínicos de AKI e CKD em camundongos. No entanto, consistente com a importante contribuição da secreção tubular de excreção de creatinina em camundongos com normal ou perto de uma função renal normal¹³, creatinina sérica mostrou pouca correlação com FITC-sinistrin acesso às taxas de liberação de alta (baixa Half-Life FITC-sinistrin), indicando que a creatinina é uma medida insensível da função renal em ratos com insuficiência renal ligeira. Em contraste, enquanto BUN correlaciona-se bem com FITC-sinistrin folga nos ratos com disfunção renal moderada, há correlação pobre entre afastamento BUN e FITC-sinistrin em ratos com lesão renal mais grave (alta FITC-sinistrin Half-Life). Isto é provavelmente causado por um efeito de reabsorção de ureia associado com desidratação em animais doentes com insuficiência renal grave.

Uma grande vantagem da medição GFR transdérmica, em comparação com todos os outros afastamento em bolus ou infusão constante as técnicas para medição de TFG, é que não exige cuidadosamente cronometradas coleções de sangue ou urina. Estes podem ser particularmente desafiadoras em camundongos, como eles têm sangue total baixos volumes e saída urinária em comparação com ratos. Além disso, os ratos precisam ser manipulado somente para a fixação do dispositivo e injeção, mas não para múltiplos venipunctures, conforme exigido por bólus clássica apuramento experimentos¹⁵. Além disso, a duração da anestesia é curta, e como tal, é possível realizar medições repetidas em camundongos individuais ao longo do tempo. A frequência na qual as medições podem ser realizadas principalmente depende o estado de saúde de ratos, aptidão do investigador para injeções intravenosas e regulamentos institucionais locais em sessões repetidas de anestesia. Em ratos saudáveis, ilesos, medições de TFG transdérmico podem ser executadas diariamente, com efeitos mínimos ou não adversos no mouse. No entanto, ratos feridos, sofrendo AKI ou DRC são improváveis tolerar a anestesia repetidas sessões, bem como os ratos saudáveis, e, portanto, a frequência das medições deve ser reduzida.

A principal limitação da medição de TFG transdérmica, em comparação com métodos de apuramento em bolus para medir o TFG em ratos é que a cinética de excreção são apenas medidos como alteração na intensidade da fluorescência relativo ao longo do tempo e não como as concentrações do marcador absoluto. Devido a isso, só é possível medir a constante de velocidade do único decaimento exponencial de excreção cinética, que é uma estimativa muito perto de TFG normalizado no volume extracelular¹⁶. Para expressar a TFG em mL/min, o volume extracelular do animal tem que ser estimado usar um fator de conversão que foi estabelecido em estudos prévios, em que as medições simultâneas de concentrações plasmáticas de FITC-sinistrin foram realizadas¹. No entanto, este factor de conversão pode não corretamente estimar volumes de fluido extracelulares ingualmente bem em todos os ratos, desde que o volume de fluido pode ser afectado por uma variedade de fatores externos, incluindo idade, sexo, estado de hidratação (que pode ser afetado por cirúrgica as intervenções, bem como lesão renal) e peso¹⁷. No entanto, ao contrário o bólus de dosagem método para avaliar a TFG em camundongos, medida transcutânea de TFG está sujeito menor variabilidade de dependente do operador, como não é afetado por erros de dosagens ou por erros no sincronismo das coleções de sangue.

Outra limitação da técnica de medição da GFR transcutânea é que mudanças de sinal de linha de base podem ocorrer durante o curso da medição devido ao clareamento da pele fluorophores e a anestesia necessária para injeção de dispositivo acessório e marcador. Esta limitação foi dirigida por Friedemann e colegas através da implementação de um algoritmo de correção³. A implementação desse algoritmo levou a uma melhoria na precisão da técnica transdermal comparável a uma técnica de infusão constante de avaliação do TFG.

Uma pergunta frequente é se a pigmentação da pele em cepas de mouse diferente afeta o transdermal FITC-sinistrin autorização. Pigmentação da pele reduz a intensidade de sinal FITC-sinistrin desde pigmentos escuros absorve a excitação azul e a verde emissão sinais de medições FITC-sinistrin. No entanto, a taxa de excreção de FITC-sinistrin é independente da global intensidade de sinal. Além disso, enquanto o sinal medido é baixo, o sinal de fundo também é menor em camundongos pigmentados. Porque o sinal de fundo é uma mistura de autofluorescência de pele fluorophores e reflexão da luz da excitação, encontramos que a relação de fundo-de-máximo sinal é comparável, ou até mesmo melhorado, em animais pigmentados. Além disso, os artefatos de movimento, que são causados pela exposição da pele ao redor para luz refletida, são reduzidos em camundongos pigmentados, uma vez que a luz refletida é também absorvida pela pele pigmentada.

Em conclusão, a técnica que apresentamos permite uma medição precisa da TFG no consciente, movimentando-se livremente os ratos de todos os tipos de pele. Como a técnica é independente da amostragem do sangue, pode ser usada repetidamente no mesmo animal para observações longitudinais em modelos CKD, bem como para a medição de mudanças rápidas de TFG que ocorrem após a indução de AKI.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger)	MediBeacon GmbH	TDM-MH001	Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio
Additional Batteries	MediBeacon GmBH	PWR-BT0001
Attachment patches	MediBeacon GmbH	small: PTC-SM001; large: PTC-LG001
FITC-sinistrin	MediBeacon GmbH	FTC-FS001
Hypoallergenic silk tape	e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00)
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen
Heat pad
Electric shaver
Depilatory (hair removal) cream	e.g. Veet or Nair
Cotton buds
Cotton swabs
Timer
Scales
70% ethanol wipes