Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Resumo

Um protocolo detalhado é descrito para a separação, identificação e caracterização de proteoforms em amostras de proteínas usando a zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS). O protocolo pode ser usado para a caracterização de alta resolução do proteoforms em amostras da proteína simples e a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome.

Resumo

Zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS) tem sido reconhecida como uma ferramenta útil para proteômica de cima para baixo que visa caracterizar proteoforms no complexo proteomes. No entanto, a aplicação de CZE-MS/MS para proteômica de cima para baixo em larga escala tem sido dificultada pela baixa capacidade de carregamento de amostra e estreita janela de separação de CZE. Aqui, um protocolo é descrito usando CZE-MS/MS com um volume de amostra-carregamento microlitro-escala e uma janela de separação de 90 min para proteômica em grande escala de cima para baixo. A plataforma CZE-MS/MS é baseada em uma linear poliacrilamida (LPA)-revestida separação capilar com electroosmotic extremamente baixo fluxo, um método de concentração dinâmica amostra on-line baseados em pH-junção com uma eficiência elevada para empilhamento de proteína, uma interface de fluxo CE-MS bainha electro-cineticamente bombeado com sensibilidade extremamente elevada e um espectrômetro de massa ion trap com alta resolução de massa e velocidade de digitalização. A plataforma pode ser usada para a caracterização de alta resolução das amostras simples da proteína intacta e a caracterização em grande escala de proteoforms em vários proteomes complexos. Por exemplo, são demonstrados uma altamente eficiente separação de uma mistura de proteína padrão e uma detecção altamente sensível de muitas impurezas utilizando a plataforma. Como outro exemplo, esta plataforma pode produzir mais de 500 proteoform e executar 190 identificações de proteína de um proteome de Escherichia coli em uma única CZE-MS/MS.

Introdução

Proteômica de cima para baixo (TDP) destina-se para a caracterização em grande escala de proteoforms dentro de um proteome. TDP depende a separação líquido-fase eficaz das proteínas intactas antes da análise de electrospray (ESI-MS/MS), espectrometria de massa em tandem-ionização devido a alta complexidade e alcance dinâmico de grande concentração do proteome^{1,2 ,3,4,5}. Eletroforese capilar de zona (CZE) é uma técnica poderosa para a separação de biomoléculas com base em suas proporções de tamanho-de-carga....

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Protocolo

1. preparação da LPA revestimento na parede interna do capilar separação

1. Pré-tratamento do capilar
   1. Liberar um capilar de sílica fundida (120 cm de comprimento, 50 µm de diâmetro interno [ID], 360 µm de diâmetro exterior [overdose]) sucessivamente com 500 µ l de 1 M de hidróxido de sódio, água deionizada, ácido clorídrico 1 M, água deionizada e metanol grau de LC-MS usando uma bomba de seringa.
   2. Secar o capilar com gás de nitrogênio (10 psi, ≥ 12 h) e preencher o capilar com 50% (v/v) 3-(trimetoxissilil) metacrilato de propilo em metanol usando uma bomba de seringa. Selar as duas extremidades do capilar com borracha de si....

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Resultados

A Figura 1 mostra um diagrama do dinâmico baseados em pH-junção CZE-ESI-MS sistema usado no experimento. Uma longa ficha da amostra em um buffer de base é injetada uma LPA-revestido separação capilar preenchida com um ácido BGE. Após a aplicação de alta tensão I e II, os analitos na zona de amostra será concentrada através o método de junção de pH dinâmico. Para avaliar o desempenho do sistema CZE-MS, uma mistura de proteína padrão.......

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Discussão

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para usar CZE-MS/MS para a caracterização de alta resolução de proteoforms em amostras da proteína simples e para a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome. Um diagrama do sistema CZE-ESI-MS/MS é mostrado na Figura 1. Existem quatro passos críticos no protocolo. Primeiro, a preparação do revestimento de alta qualidade LPA na parede interna da separação capilar é extremamente importante. Uma separaç.......

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fused silica capillary	Polymicro Technologies	1068150017	50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets	Macron Fine Chemicals	7708-10	Corrosive
LC-MS grade water	Fisher Scientific	W6-1
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA48-1	Corrosive
Methanol	Fisher Scientific	A456-4	Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M6514	Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid	Acros Organics	423805000	Highy toxic
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic, health hazard
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678	Health hazard, Oxidizer
lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Cytochrome C	Sigma-Aldrich	C7752
Myoglobin	Sigma-Aldrich	M1882
ß-casein	Sgma-Aldrich	C6905
Carbonic anhydrase	Sigma-Aldrich	C3934
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Urea	Alfa Aesar	36428-36
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	Health Hazard
Iodoacetamide	Fisher Scientific	AC122270250	Health Hazard
Formic Acid	Fisher Scientific	A117-50	Corrosive, Health Hazard
C4 trap column	Sepax Technologies	110043-4001C	3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998SK-4	Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters	Thermo Scientific	126-0020	0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells			K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537
BCA assay	Thermo Scientific	23250
Acetone	Fisher Scientific	A11-1
HPLC system for protein desalting	Agilient	1260 Infinity II
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
CE autosampler	CMP Scientific	ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface	CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis	Branson	101063196	Model S-250A
Vaccum concentrator	Thermo Fisher Scientific	SPD131DDA-115