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Resumo

Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.

Resumo

RNAs extracelulares e circulantes (exRNA) são produzidas por muitos tipos de células do corpo e existem em vários fluidos corporais como saliva, plasma, soro, leite e urina. Um subconjunto destes RNAs são os reguladores posttranscriptional – microRNAs (miRNAs). Para delinear os miRNAs produzidos por tipos de células específicas, sistemas de cultura in vitro podem ser usados para colher e perfil exRNAs derivado de um subconjunto de células. Os fatores secretados de células-tronco mesenquimais estão implicados em aliviar a inúmeras doenças e é usado como o sistema de modelo in vitro. Este artigo descreve o processo de coleta, purificação do RNA pequeno e geração de biblioteca para sequência de miRNAs extracelular. ExRNAs de meios de cultura diferem de RNA celular por serem amostras de entrada baixas de RNA, que exige procedimentos otimizados. Este protocolo fornece um guia completo para sequenciamento de pequenas exRNA de meios de cultura, mostrando pontos de verificação de controle de qualidade em cada etapa durante o sequenciamento e purificação de exRNA.

Introdução

Extracelular e circulando RNAs (exRNAs) estão presentes em vários fluidos corporais e são resistentes no sentido de RNases1,2. Sua abundância elevada, a estabilidade e a facilidade de acessibilidade são atraentes para avaliação clínica como marcadores de diagnóstico e prognóstico3. O modo de transporte para exRNAs incluir vesículas extracelulares (EVs), associação com lipoproteínas (tais como lipoproteína de alta densidade; HDL) e complexos ribonucleoprotein (tais como com complexos Argonaute2)4.

Um subconjunto de exRNAs são microRNAs (miRNAs), que são pequenos não-codificantes RNAs de cerca de 22 nt que regulam a expressão do gene posttranscriptional. Ex-miRNAs têm sido implicados na comunicação célula-célula e regulação da homeostase de células5. Por exemplo, o HDL entrega ex-miR-223 para células endoteliais para reprimir a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e inflamação6. Curiosamente, miR-223 é também visto transportadas por vesículas extracelulares de leucócitos de células de câncer de pulmão, a fazer uma mais invasivo de fenótipo7programação. Assim, a transcriptoma do ex-miRNAs de vários fluidos corporais e meio de cultura celular grandemente irá melhorar a nossa compreensão de ex-miRNA sinalização.

Pequeno RNA sequenciamento (pequeno RNA seq) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para entender a transcriptomics de RNAs pequeno. Não só podem diferentes amostras ser comparadas entre RNAs conhecidos diferencialmente expressos, mas RNAs pequeno romance também pode ser detectado e caracterizado. Consequentemente, é também um método robusto para identificar os miRNAs diferencialmente expressos em condições diferentes. No entanto, um dos obstáculos do pequeno RNA seq é a dificuldade em gerar pequenas bibliotecas seq de RNA a partir de exRNA baixa entrada fluidos como fluidos cérebro-espinhal, saliva, urina, leite, soro e meios de cultura. O protocolo de TruSeq pequeno RNA biblioteca Prep de Illumina requer aproximadamente 1 µ g de RNA total de alta qualidade e o protocolo de NEBNext pequeno RNA biblioteca Prep conjunto de New England Biolabs requer 100 µ g de ng-1 de RNA8,9. Muitas vezes, o RNA total destas amostras estão abaixo do limite de deteção para convencionais espectrofotômetros UV-vis.

Ex-miRNAs derivados de fluidos corporais são potencialmente bons marcadores de diagnósticos e prognósticos. No entanto, a fim de estudar os efeitos funcionais ou para determinar a origem do ex-miRNAs específicos, sistemas de cultura de células são usados frequentemente em vez disso. Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido estudadas extensivamente porque seus EVs têm sido implicados em aliviar muitas doenças, incluindo infarto do miocárdio, a doença de Alzheimer e doença do enxerto contra hospedeiro10. Aqui, demonstramos a purificação do ex-miRNAs de medula óssea-derivado MSCs (BMSCs) e as etapas específicas usadas para otimizar a construção de biblioteca pequena do RNA, sequenciamento e análise de dados (Figura 1).

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Protocolo

Nota: O meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (mídia MSC) é preparado antecipadamente conforme indicado na Tabela de materiais.

1. cultura de pilha

Nota: Células-tronco mesenquimais humanas podem ser obtidas da medula óssea, tecido adiposo ou outras fontes de11. Alternativamente, hMSCs podem ser comprados através de um fornecedor. Os BMSCs usados no presente protocolo foram derivadas da medula óssea de pacientes e comprei de uma empresa.

  1. Descongele 1 x 106 BMSCs para um balão de T175 contendo 20 mL de mídia MSC. Incubar a 37 ° C com 5% CO2 células e substituir os meios de comunicação a cada 2-3 dias até a confluência de 80%.
  2. Lavar as células com 5 mL de 1X PBS e descartar a PBS.
  3. Separar as células pela adição de 5 mL de 0.05% Trypsin-EDTA e incubar as células por 5 min a 37 ° C. Bata nos lados do balão para facilitar o desprendimento.
  4. Adicione 15 mL de mídia MSC para inactivar a tripsina, separar as células da superfície e pipeta de cima e para baixo para obter suspensões celulares simples.
  5. Colete as células em um tubo de 50 mL e spin-down por 5 min a 300 x g para as células de Pelotas.
  6. Ressuspender as células em 1 mL de mídia MSC e contar as células usando um hemocytometer.
    Nota: Primária humano da medula óssea MSCs na confluência de 80% em um balão de T175 é em torno de 2 x 106 células.
  7. Placa hMSCs em 2.000 células/cm2 na mídia MSC fresca em 5 frascos T175. Crescem as células a 37 ° C com 5% de CO2 e substituir os meios de comunicação a cada 2-3 dias até 5 frascos de 90% confluentes T175 frascos são obtidos.

2. EVs e coleção de biomoléculas RNA-associados

Nota: Mídia de coleção EV é preparada previamente (médio modificado águia de Dulbecco [DMEM] com 10% de soro fetal bovino [FBS] e 1% penicilina/estreptomicina [P/S]). EV coleção mídia é mídia normal do MSC, mas preparado com comercial FBS empobrecido EV (Tabela de materiais). Isso é para evitar a contaminação de exRNA bovina de FBS, que normalmente contém exRNAs associado com EVs, ribonucleoproteínas e lipoproteínas. Para preparação de biblioteca pequena do RNA, exRNAs derivados 5 frascos confluentes do MSCs são necessários para permitir a construção da biblioteca.

  1. Lavar as células 3 x com 20 mL de PBS por T175 balão. Adicionar 20 mL de mídia de coleção EV por confluentes T175 balão de MSCs e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 48 h.
  2. Recolher os meios de comunicação e centrifugar a mídia por 10 min a 300 x g e 4 ° C.
  3. Recolher o sobrenadante e centrifugar a mídia por 20 min a 2.000 x g e 4 ° C.
  4. Recolher o sobrenadante e centrifugar a mídia por 30 min a 15.500 x g e 4 ° C. Em seguida, recolha o sobrenadante.
  5. Transferir a mídia para tubos se e pelota a exRNAs para 90 min em 100.000 x g e 4 ° C. Um rotor de ângulo fixo é usado aqui e a pelota é ancorada ao lado do tubo. Marcar o lado da tampa e desenhar um círculo na lateral do tubo onde a pelota é esperada.
  6. Remover o sobrenadante, seque o interior do tubo por inversão do tubo com um papel absorvente e use pequenos pedaços de papel absorvente para remover o líquido dentro do tubo sem tocar no fundo do tubo. Resuspenda o pellet em 200 µ l de PBS vortexing por 30 s e pipetagem e descer 20 x.
  7. Avalie a EVs e biomoléculas com nanopartículas acompanhamento análise (NTA) (Figura 2).
    Nota: O EVs e biomoléculas podem ser avaliadas com nanopartículas acompanhamento análise (NTA), difusão dinâmica da luz (DLS) ou transmissão de microscopia eletrônica (TEM)12.
  8. Armazene o EVs e biomoléculas a-80 ° C até mais experimentos a jusante.
    Nota: Se EVs vão ser utilizados para estudos funcionais, glicerol 20% deve ser adicionado para protegê-los de ruptura. As células podem ser coletadas usando procedimentos padrão, se necessário.

3. EVs e coleção de biomoléculas associada a RNA de células diferenciadas

Nota: EVs e RNA associado biomoléculas também podem ser coletadas dos meios de cultura de células, enquanto as células sofrem diferenciação. O exemplo descrito no protocolo descreve diferenciação osteoblástica e a coleção de exRNA no dia 0 e 7 de diferenciação. Se nenhuma diferenciação é necessária, Então pule 3 seção e vá para a seção 4.

  1. Preparar a mídia de diferenciação osteoblástica (DMEM com 10% FBS, 1% P/S, β-glicerofosfato de 10 mM, 10 dexametasona nM, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10mm 1.25-vitamina-D3) fresco toda vez.
  2. Uma vez MSCs são 80% de confluencia, alterar a mídia MSC para mídia de diferenciação osteoblástica.
  3. Repor os meios de comunicação de diferenciação osteoblástica após 2-3 dias.
  4. No dia 5 de diferenciação, remova a mídia e lavar as células 3 x com 20 mL de PBS por T175 balão.
  5. Adicionar 20 mL de EV coleção mídia contendo β-glicerofosfato de 10 mM, 10 nM dexametasona, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10mm 1.25-vitamina-D3 por confluentes T175 balão de MSCs. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO2 por 48 h garantir a continuação diferenciação, recolhendo o EVs e biomoléculas.
  6. Coletar a mídia no dia 7 e siga para isolar o EVs e biomoléculas como descrito nos passos 2.2-2.6.
  7. Para controle de qualidade, sementes células em 96-poços ou 6-poços para avaliar a diferenciação usando um ensaio de atividade da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ou com reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), respectivamente.
    Nota: A Figura 3 é um exemplo que mostra diferenciação osteogênica das células.

4. RNA extração e controle de qualidade

  1. Descongele as amostras da etapa 2.8 no gelo. Extraia o RNA usando um kit de isolamento de RNA (Tabela de materiais).
  2. Eluir o RNA da coluna fornecido no kit de isolamento de RNA (Tabela de materiais) em 100 μL de água livre de RNase.
  3. Concentre-se o RNA através da precipitação do álcool etílico, adicionando 1 μL de glicogênio, 10 μL de acetato de sódio 5.5 pH 2 M e 250 μL de pre-refrigerados 99% de etanol em 100 μL de RNA purificado.
  4. Incube as amostras a-20 º C durante a noite para precipitar o RNA. Pelota do RNA por centrifugação por 20 min em 16.000 x g e 4 ° C.
    Nota: A pelota é branca devido à co-precipitação com glicogênio.
  5. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento de RNA com 1 mL de etanol a 75%. Pelota do RNA novamente por 5 min à 16.000 x g e 4 ° C.
  6. Remover o etanol e deixe a tampa do tubo do RNA aberto por 5-10 min para o ar seco a pelota do RNA. Resuspenda o pellet de RNA em 7 μL de água livre de RNase.
  7. Verifique a qualidade do RNA e concentração usando uma máquina de chip baseada em eletroforese capilar para detectar o RNA de acordo com o protocolo do fabricante antes da construção da biblioteca.
    Nota: Uma distribuição de tamanho representativo do RNA é mostrada na Figura 4.
  8. Extraia o RNA celular usando um kit de purificação comercial (Tabela de materiais), se necessário.

5. Biblioteca construção e controle de qualidade

Nota: Bibliotecas de pequeno RNA são construídas usando jogos comerciais (Tabela de materiais) com ajustes devido o baixo RNA de entrada. Construção de biblioteca é realizada sobre o bloco refrigerado.

  1. Refrigere o bloco de aquecimento para tubos PCR 0,2 mL no gelo e adicionar 5 μL do RNA da etapa 4.6 em cadeia da polimerase 0,2 mL RNase-livre em um bloco de refrigerados.
  2. Dilua 3' adaptadores (01:10) em água livre de RNase em um tubo PCR de 0,2 mL RNase-livre. Adicionar 0,5 μL de adaptador diluído e misturar com 5 μL de RNA pipetando e descer 8 x e centrífuga brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior do tubo.
  3. Incubar a mistura de adaptador de RNA e 3' a 70 ° C por 2 min em um termociclador pré-aquecido e em seguida, colocar a amostra volta no bloco refrigerado.
  4. Adicione 1 μL de tampão, ligadura, 0,5 μL de inibidor de RNase e 0,5 µ l de RNA T4 ligase do (mutante de exclusão) na mistura de adaptador de RNA e 3'. Misture por pipetagem e descer 8 x e centrifugar brevemente.
  5. Incube o tubo a 28 ° C, durante 1 h no termociclador pré-aquecido.
  6. Adicionar 0,5 μL de solução de paragem para o tubo de amostra com o tubo ficar no termociclador, misturar pipetando subindo e descendo a 8x e continuar a incubar a 28 ° C por 15 min.
  7. Dilua 5' adaptadores (01:10) em água livre de RNase em um tubo PCR de 0,2 mL RNase-livre. Adicionar 0,5 μL de 5' adaptador em um separado RNase-livre 0,2 mL PCR tubo, calor o adaptador de 5' a 70 ° C por 2 min no termociclador pré-aquecido e em seguida, coloque a amostra no bloco refrigerado.
  8. Adicionar 0,5 μL de 10 nM ATP, 0,5 μL de ligase do RNA T4 ao tubo adaptador de 5', misturar pipetando subindo e descendo a 8x e centrifugue brevemente para recolher os líquidos na parte inferior.
    Nota: Mantenha o adaptador 5' no bloco refrigerado tanto quanto possível.
  9. Adicionar 1,5 μL da mistura de adaptador de 5' para a amostra da etapa 5.6 e misture gentilmente por pipetagem 8x lentamente. Incube a amostra a 28 ° C, durante 1 h no termociclador pré-aquecido.
  10. Dilua RT cartilha 01:10 em água livre de RNase em um tubo PCR de 0,2 mL RNase-livre. Adicionar 0,5 μL de primer de RT diluído em amostra da etapa 5.9, misture suavemente pipetando subindo e descendo 8x lentamente e centrifugar brevemente.
  11. Incubar a amostra a 70 ° C por 2 min no termociclador pré-aquecido e em seguida, coloque a amostra em um bloco de refrigerados.
  12. Adicione 1 μL de 5x buffer de primeira vertente, 0,5 μL de mistura de 12,5 mM dNTP, 0,5 μL de 100mm ditiotreitol (DTT), 0,5 μL de inibidor de RNase e 0,5 μL de transcriptase reversa. Misture suavemente pipetando lentamente subindo e descendo a 8x e centrifugar brevemente.
  13. Incube a amostra a 50 ° C, durante 1 h no termociclador pré-aquecido para obter o cDNA.
  14. Adicione 4,25 μL de água ultrapura, 12,5 μL de mistura PCR, 1 μL de primer de índice e 1 μL de primer universal para o cDNA. Misture por pipetagem e descer 8 x e centrifugar brevemente.
  15. Colocar a amostra em um termociclador e configurar o reciclador da seguinte forma: 98 ° C por 30 s; 15 ciclos de 98 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 15 s; e terminar o ciclo com 72 ° C por 10 min.
    Nota: A biblioteca preparada pode ser armazenada a-20 ° C, durante uma semana.
  16. Purificar a biblioteca de RNA separando a biblioteca em um gel de DNA e cortando o gel (gel de extração) entre 140 160 e bp bp e a biblioteca do gel seguindo o protocolo fornecido pelo kit de construção de biblioteca de eluição.
    Nota: Neste estudo, a biblioteca preparada da etapa 5.15 é carregada em um gel comercial (Tabela de materiais) e a biblioteca entre 140 160 e bp bp é purificado para fora por um automatizado fracionador de DNA tamanho (Tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
  17. Concentre-se e lavar a biblioteca da etapa 5.16 usando um kit de purificação de PCR baseado em coluna (Tabela de materiais) e eluir a biblioteca em água livre de RNase a μL 10 finalmente.
  18. Carrega 1 μL da biblioteca purificada em uma microplaqueta de DNA (Tabela de materiais) para verificar o tamanho da biblioteca, seguindo o protocolo do fabricante.
  19. Diluir 1 μL da biblioteca purificada (1: 1000) em pH 10 mM 8.0 Tris-HCl com 0,05% polissorbato 20 e quantificar a biblioteca por qPCR usando um kit de quantificação de biblioteca comercial para quantificar a concentração de biblioteca usando os padrões de DNA no kit.
  20. Piscina quantidades iguais das bibliotecas de acordo com os requisitos da máquina de sequenciamento e sequência em um sistema de sequenciamento de alto rendimento.
    Nota: A construção da biblioteca de RNA celular pode ser feita usando os mesmos kits, seguindo o protocolo padrão dos kits.

6. Bioinformática do pipeline

Nota: Este é um encanamento interno e os programas usados aqui são listados no tabela de materiais.

  1. Aparar fora leituras de baixa qualidade e retire o cru lê sequências de adaptador.
  2. Mapear o lê limpo para diferentes tipos de RNAs.
    1. Anote os tRNAs, permitindo que as dois incompatibilidades porque as sequências de tRNA fortemente modificadas com misincorporation base frequente por transcriptase reversa.
    2. Anote os miRNAs pelo mapeamento de miRNAs humanos de miRBase v21 permitindo zero incompatibilidades. Desde que os miRNAs estão sujeitas A e U nontemplated 3' final adições, sequências que não são mapeadas são 3' Aparados da nts até três A e/ou T após o qual leituras são mapeadas para miRNAs humanos e outros miRNAs de miRBase v21 permitindo zero incompatibilidades.
    3. Anote a outro RNAs pequeno relevante (snRNA snoRNA, piRNA e Y RNAs), permitindo que uma incompatibilidade.
    4. Mapear o restante lê não mapeado ao longo do RNA datasets (rRNA, outro RNA de Rfam e mRNA) para avaliar a degradação.
    5. Anote as sequências para o genoma humano.
    6. Anote as sequências de genomas bacterianas.
    7. Normalizar a miRNA expressão usando a seguinte fórmula: miRNA conta / o total de contagens de todos os miRNAs mapeados) x 106.

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Resultados

O método descrito neste protocolo é otimizado para coletar exRNA de cultura MSC para sequenciamento de próxima geração. O esquema geral de fluxo de trabalho está na Figura 1 , à esquerda e os pontos de verificação do respectivo controle de qualidade estão à direita.

A morfologia das células no dia da coleta para indiferenciado (Figura 3A) e diferenciados (

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Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para o sequenciamento de geração próxima de exRNAs que permite análises de expressão diferencial de amostras de entrada baixas. Aderindo a um protocolo específico para isolamento EV e exRNA é importante porque mesmo pequenas alterações (ou seja, a etapa de ultracentrifugação ou uma mudança no tipo de rotor) podem influenciar a transcriptoma e miRNA níveis13,14. Assim, independentemente de como o exRNA é isolado, é imp...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Nós estamos gratos ao Sr. Claus Bus e Sra. Rita Rosendahl em iNANO para sua assistência técnica. Agradecimentos especiais a Dr. Daniel Otzen para permitir que nosso uso frequente dele se. Este estudo foi suportado pelo fundo de inovação Dinamarca (revista projeto).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem CellsATCCPCS-500-012Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBSGibcoA2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTAGibco25200056
T175 FlaskSarstedt833,912
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Phosphate Buffered SalineSigma806552
UltracentrifugeBeckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap AssemblyBeckman Coulter355618
Beckman Coulter Type 60 TiRotor used here
NucleoCounterChemometecNC-3000Cell Counter
β-glycerophosphateCalbiochem35675Components of the osteogenic differentiation media
DexamethasoneSigmaD4902-25MGComponents of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10GComponents of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3SigmaD1530-1MGComponents of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini KitQiagen217004miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1514Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAChip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification KitsRocheKK4824Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)IlluminaRS-200-0012Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin PrepSage ScienceAutomated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification KitQiagen28004PCR purification in step 5.17
FASTX_ToolkitCold Spring Harbor LabTrimming low-quality reads in step 6
cutadaptAdaptor removal in step 6
BowtieMapping of clean reads in step 6
SamtoolsTo make the expression profile in step 6
BedtoolsTo make the expression profile in step 6

Referências

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