Avaliação não-invasiva da função de músculos levantadores em ratos

Resumo

Medição da função contrátil de músculo esquelético de roedores é uma ferramenta útil que pode ser usada para controlar a progressão da doença, bem como a eficácia da intervenção terapêutica. Descrevemos aqui a avaliação não-invasiva, na vivo dos músculos levantadores que podem ser repetidos ao longo do tempo no mouse mesmo.

Resumo

Avaliação da função contrátil de músculos esqueléticos é uma medida importante para tanto clínica e fins de pesquisa. Várias condições podem afetar negativamente o músculo esquelético. Isso pode resultar em uma perda de massa muscular (atrofia) e/ou perda de qualidade do músculo (reduzida força por unidade de músculo em massa), ambos os quais são predominantes na doença crônica, doença muscular específicos, imobilização e envelhecimento (sarcopenia). Função do músculo esquelético em animais pode ser avaliada por uma variedade de diferentes testes. Todos os testes têm limitações relacionadas com o ambiente de teste fisiológico, e a seleção de um teste específico, muitas vezes depende da natureza das experiências. Aqui, descrevemos uma técnica não-invasiva de in vivo, , envolvendo uma avaliação útil e fácil de força-curva de frequência (FFC) em ratos que podem ser executadas no mesmo animal ao longo do tempo. Isto permite o monitoramento da progressão da doença e/ou a eficácia de um tratamento terapêutico potencial.

Introdução

Músculo esquelético é um tecido metabólico importante que compreende cerca de 40% do peso total do corpo. Desempenha um papel crucial no controle da energia metabolismo e homeostase¹. Músculo esqueletal massa é mantida por um delicado equilíbrio entre as taxas de¹, de síntese e degradação da proteína. Numerosas condições de doença afetam esses processos no músculo esquelético, levando a uma perda líquida de massa muscular (atrofia). Estes incluem, mas não estão limitados a, envelhecimento de câncer, AIDS, jejum e de um membro imobilização^2,3. O envelhecimento da população, perda de força é associada com uma perda de músculo de massa e é preditor de mortalidade de todos-caso⁴. Neste contexto, a avaliação da função muscular fornece uma medida importante ao determinar a eficácia de estratégias terapêuticas para combater e/ou evitar desperdiçar o músculo esquelético e perda de função.

Os investigadores utilizaram muitas abordagens diferentes e modelos animais para compreender as vias moleculares de músculo atrofia^5,6 e as implicações desses mecanismos na função contrátil de músculo^{2,3 ,7}. Portanto, correlacionar as alterações a nível molecular para as diferenças na função muscular é imperativo em entendimento como mudanças de nível moleculares podem afetar a funcionalidade do músculo.

Função do músculo esquelético, especialmente em pequenos roedores, geralmente é executada usando três procedimentos bem-descrito^8,9 para detectar a deficiência de produção de força e/ou monitorar a progressão da doença. (1) ex vivo; onde músculo é removido do animal e incubado em solução de Ringer, um banho para avaliar a função muscular usando campo estimulação¹⁰. (2) In situ; onde a fixação proximal do músculo permanece no animal e o tendão distal está ligado a um transdutor de força, permitindo que a função do músculo deve ser executada por estimulação de nervo direto¹¹. (3) In vivo; onde os eletrodos são colocados por via subcutânea para obter evocado-nervo músculo força produção^9,12. Enquanto esses três procedimentos são usados para finalidades diferentes, cada um possuem vantagens e desvantagens. Portanto, é importante selecionar um método adequado, baseado no objectivo do estudo. A principal limitação com ex vivo experimentos é a remoção do músculo do seu ambiente normal e o uso da estimulação de campo. O método in situ mantém um suprimento de sangue normal e usa a estimulação através do nervo, mas é alterada a anatomia normal e a natureza do experimento é terminal; assim, isto faz medições de função muscular acompanhamento impossível. O método in vivo descrito aqui mais estreitamente imita normal fisiologia em que a anatomia é perturbada, o feixe neuromuscular permanece intacto, e o experimento não é terminal, permitindo que medidas de acompanhamento, dentro do mesmo animal ao longo do tempo⁸.

Aqui, descrevemos um procedimento in vivo que permite várias medições da função muscular no mesmo animal ao longo do tempo. Este procedimento envolve a avaliação dos músculos do compartimento anterior crural — incluindo o tibial anterior(TA), extensor longo dos dedos (EDL) e extensor hallicus músculos longus (EDH), responsáveis pela dorsiflexão — em um procedimento não-invasivo por estimulação de (também conhecido como fibular) nervo fibular. A TA fornece a maioria da força de dorsiflexão do tornozelo¹³, com apenas uma contribuição mínima pelo EDI e EDH que controlar o movimento dos dedos dos pés. Este protocolo não-terminal assegura a preservação do suprimento nervo e sangue. Isto permite a investigação da eficácia de evolução e tratamento de doenças ao longo do tempo no ambiente mais fisiológico atualmente disponível em um modelo animal.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de ética do Animal de Universidade Deakin (projeto #G19/2014).

1. equipamento instalação

1. Certifique-se de que todas as máquinas estão correctamente ligadas.
2. Ligue o computador, o estimulador de bi-fase de alta potência e sistema de alavanca de modo duplo.
3. Configure o grampo de joelho de rato na plataforma, bem como o estribo do mouse sobre o transdutor.
4. Ligue a aquecimento plataforma 37 ° c.
5. Abra o software de controle de músculo dinâmico na área de trabalho.
   Nota: Este é o software necessário para executar testes funcionais.

2. software e configuração de modelo

1. Uma vez que o programa é aberto (Figura 1), calibrar o transdutor e selecione Setup | Meus instrumentos | Calibrar o.
2. No botão "Configuração", selecione InstantStim e altere os parâmetros de "Tempo de execução" para 120 s (figura 1A).
   Nota: Voltagem ideal também pode ser conseguida a realizar contrações musculares único, Configurando manualmente ou começando a InstantStim tantas vezes quanto necessário.
3. Na janela tipo-capaz, rotulada "Autosave Base" para introduzir o nome do auto salve local do arquivo (por exemplo,, mouse1-data-timepoint1). Clique a caixa de seleção à esquerda da janela "Autosave Base" e mude para Habilitar o Autosave.
4. Na parte superior do controle DMC tela ir Sequencer, que abrirá uma nova janela pop-up. Selecione a Sequência aberta e selecione o protocolo do premade para ser usado (figura 1B). Clique sequência de carga | Fechar janela.
   Nota: Esta etapa é usada para gerar um teste de frequência-curva (FFC) força (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz).
5. Coloque o botão de "Intervalo" de 10 mA sobre o estimulador de bi-fase.
   Nota: Verifique se o botão "Ajustar" (lado inferior) está no zero. Este ajuste fino permite a configuração dos eletrodos.

3. Mouse Setup

Nota: Todas as medições de força foram realizadas em camundongos machos do selvagem-tipo (C57BI/6) em 12 semanas de idade.

1. Coloque cada rato na câmara de anestesia, com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min com 5% de isoflurano (através da inalação do cone de nariz) até o mouse perde a consciência. Confirme a anestesia adequada através de perda do reflexo pé.
2. Remova todo o cabelo na perna direita do mouse pelo corte com cortador de cabelo elétrico.
3. Coloque o animal em posição supina na plataforma aquecida e limpa a perna direita (ambos os lados podem ser usados) com 70% de álcool e iodo. Neste ponto, ajustar o isoflurano a 2% (com fluxo de oxigênio a 1 L/min) e aplique o gel condutor para a pele onde serão colocados os eléctrodos.
   Nota: Use uma sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura do corpo durante o procedimento e aplicar a pomada para evitar qualquer ressecamento e/ou danos aos olhos.
4. Coloque o pé sobre o estribo e anexar usando fita adesiva médica. Fixe o joelho para estabilizar e imobilizar a perna durante o procedimento.
   Nota: Alguns estudos têm descrito usando um pino muito fino, inserido através da tíbia proximal (posterior aos músculos dorsiflexors)¹² para proporcionar estabilização. Este protocolo opta por uma pinça, pois isso fornece suficiente estabilização sem compressão e danos desnecessários para o joelho. A pinça também evita potencial inflamação que pode criar um pino trans-ósseo, permitindo ainda a avaliação precisa da contratilidade muscular. Além disso, o grampo de joelho do mouse tem sido usado com sucesso¹⁴.
5. Neste ponto, use os botões na plataforma para posicionar o membro posterior do mouse para que haja um ângulo de 90° na altura da tornozelo (Figura 2).

4. otimização da posição de eletrodos

1. Uma vez que o mouse é colocado sobre a plataforma, posicione os eletrodos sob a pele (subcutânea) na perna direita.
   Nota: Este é um passo crucial, e alguns reposicionamento pode ser necessária para obter a posição desejada durante a instalação no passo 4.4.
2. Colocar os eletrodos no lado lateral da perna direita; Coloque um perto da cabeça da fíbula e o outro eletrodo mais distalmente no lado lateral da perna (Figura 2).
   Nota: Um sistema de eletrodo sob medida é projetado para otimizar esta etapa. No entanto, este teste pode ser efectuado com agulhas de eletrodo fornecidas pelo fabricante neste sistema.
3. Uma vez que estas etapas são alcançadas, sobre o estimulador de bi-fase de alta potência ajuste o botão rotulado "Ajustar" conforme necessário para obter uma estimulação do nervo fibular, o que resulta em dorsiflexão máxima binário.
   Nota: Para ratos adultos do selvagem-tipo, este intervalo é inferior a 2 milhões de anos; no entanto, isto pode ser dependente do tamanho, idade e sexo do animal. A produção de força (picos de curvas) deve ser aumentada lentamente até atingir a força máxima.
4. Durante a estimulação, rode o transdutor para produzir valores negativos (Figura 3), que são importantes para garantir que os eléctrodos estão estimulando apenas os músculos levantadores pelo nervo fibular. Uma vez que esta etapa é alcançada, estabilize os eletrodos, usando uma pinça, impedindo qualquer movimento durante o procedimento.
   Nota: Os picos lentamente vão aumentar em magnitude, e a amperagem máxima é determinada como o nível em que três ou mais consecutivas estimulações resultam em contratilidade idêntica. Resistir, transformando a amperagem maior do que o necessário; a amperagem máxima irá estimular os vizinhos e, potencialmente, antagonista os músculos, causando contração, que pode gerar picos de valores positivos.
5. Pare o Stim instantânea no software.
6. Na tela principal, ative o botão rotulado como "Sequência de começar" para iniciar a sequência de instalação anterior (conforme descrito na etapa 2.4).

5. terminando o procedimento

1. Uma vez que as medições de força estão acabadas, remova os eletrodos, solte o grampo de joelho e remova a fita de pé.
2. Desligue o isoflurano e manter a entrega de oxigênio por alguns minutos, auxiliando a recuperação do animal. Uma vez que o rato começa a se mover e/ou recupera a consciência e auto pode direito, retorne o mouse para sua gaiola.
   Nota: Uma drogas anti-inflamatórias não esteroides (AINE) podem ser injectada por via subcutânea (meloxicam de 1 mg/kg) para evitar qualquer desconforto ou dor após o procedimento.

6. análise de dados

1. Abra o software de análise de dados.
2. Ir ao Alto Throughput (superior esquerdo na tela). Selecione Frequência força para analisar o acima descrito sequência de instalação.
3. Selecione Manual e altere o valor de "Cursor End" para 3. Também selecione Remover linha de base.
4. Clique em Escolher arquivos para acessar o procedimento anteriormente realizado e em seguida, clique em analisar. Neste ponto o resultado pode ser acessado no ecrã ou exportado para uma planilha para análise adicional e/ou cálculos.
   Nota: Os dados foram medidos em mN; no entanto, o torque pode ser calculado multiplicando o valor da força pelo comprimento do braço de alavanca (força absoluta). Se normalização é necessária (força específica), binário pode ser normalizado ao peso corporal, ou experiências terminais podem ser realizadas para coletar a massa muscular, da idade de correspondência.

Resultados

A curva força-frequência é um teste útil no qual os músculos podem ser estimulados por frequências inferiores e superiores para distinguir a força ideal e suboptimal respostas¹⁵. A força em frequências mais baixas pode estimular uma única contração, ativando o motor menor e menos unidades, e em frequências mais altas, é atingido um pico estável, onde isolados twitches fundiram (tétano), alcançando a força máxima através da activação de todas as unidades motoras¹⁶ . No teste apresentado, a curva tetânica começa a ~ 60 Hz, onde a potenciação pode ser visualizada (Figura 4A) e a força máxima são determinadas em ~ 150 Hz (Figura 4B), quando o patamar é atingido com uma curva fundido preenchido^{9, 16}.

Qualquer variação destes resultados pode indicar que os músculos não estão a ser devidamente estimulados pelos eléctrodos. Colocação do eletrodo é um passo importante na preparação deste procedimento, como a estimulação elétrica deve ser posicionada corretamente para inervar o nervo fibular e, portanto, totalmente ativar os músculos de dorsiflexão, o que fornece (TA, EDI e EDH). Correto posicionamento do eletrodo resulta na geração de picos negativos (Figura 3) durante este processo, enquanto o desalinhamento dos eletrodos ou maior amperagem pode levar à estimulação dos músculos, causando contração da músculos vizinhos e os músculos antagonista, que por sua vez, gera picos de valores positivos.

Figura 5A mostra dados de frequência-curva representativa da força de um rato ao longo do tempo, onde o procedimento foi repetido uma vez por semana até 5 momentos foram concluídos. Estas observações mostraram força consistente de valores de produção em todo os momentos e/ou observações medidas. Este procedimento também tem mostrado para ser consistente entre as medições de ratos, como a Figura 5B mostra o representante área abaixo da curva da FFC estimulada por 5 diferentes observações em 6 ratos testados uma vez por semana.

Figura 1 : Sistema de software. (A) controlar a ilustração de software dos passos para configurar os parâmetros de "Instant Stim". Sobre a foto de fundo, clique Setup | Stim Instant. Sobre o pequeno apareceu janela (primeira foto), configurar os parâmetros. (B) ilustração do modo de exibição de configuração "Sequencer". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Instalação de Mouse. Visão geral da posição do animal anestesiado. A braçadeira do joelho direito é colocada para que o joelho é a 90°, e para que o pé e o tornozelo estão em ângulos de 90° (linha branca pontilhada). Contração dos músculos dorsiflexors é conseguida através da estimulação do nervo fibular, que está localizado logo abaixo (distal) a cabeça da fíbula. Nós usamos eletrodos personalizados (inserção); no entanto, os eletrodos de agulha que são fornecidos com o aparelho, ou comprados separadamente, também são suficientes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Saída de colocação dos eletrodos. Uma vez que os eletrodos são posicionados sob a pele e a tensão é iniciada, picos com valores negativos são observados. Neste ponto, atingir valores negativos (linhas verdes) é um passo crucial no sentido de assegurar que a estimulação é alcançada em levantadores músculos única (TA, EDI e EDH). A medição em tempo real é indicada entre as duas linhas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Curvas representativas. (A) amostra da curva força a 60 Hz (rato #06). (B) amostra da curva tetânica a 150 Hz (rato #03). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Representante forçar a área sob os dados de curva e curva de frequência (FFC). (A), FFC (eixo x) mais de 5 diferentes momentos (semanas 1, 2, 3, 4 e 5) em um rato de amostra (#05). (B) área sob a curva (AU, eixo y) do FFC sobre 5 momentos diferentes (mouse #01, 02, 03, 04, 05 e 06, respectivamente; eixo x). Os resultados são expressos como média ± erro padrão de medida (SEM) de cinco momentos (testes) em 6 ratos e foram analisados por ANOVA One-Way teste (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Discussão

Medição da função contrátil de muscular máximo de forma exata e reproduzível é fundamental para a avaliação progressiva da genética, metabólica e muscular condições¹⁷. Da mesma forma, função contrátil muscular in vivo permite a avaliação de novos tratamentos e terapêuticas para debilitante condições músculo. Aqui Demonstramos a medição da produção de força dos músculos levantadores do membro inferior posterior de rato através de um procedimento em que vivo.

Aparelhos comerciais são eficientes e úteis para executar este procedimento não-invasivo. Este teste fornece vantagens importantes relacionadas com a avaliação da função contrátil do músculo, preservando um ambiente fisiológico nativo, em que o sangue de abastecimento e inervação permanecem intactos. Por outro lado, suas desvantagens estão relacionadas à normalização da força por unidade de área seccional do músculo (força específica), que só pode ser verificada em um músculo isolado que é colhido após a experimentação da Cruz. No entanto, o teste não-invasivo permite várias medições da função contrátil dos músculos flexores no mesmo animal ao longo do tempo, resultando em número reduzido de animais experimentais, sendo necessários, especialmente se o objetivo é avaliar as alterações relativas ( alterações em vigor absoluto ao longo do tempo).

Há passos importantes que devem ser considerados durante este procedimento, a fim de obter dados consistentes sobre os momentos. Primeiro, um deve tentar padronizar o posicionamento animal, sempre que possível. Em segundo lugar, durante a criação é importante ser consistente com o posicionamento de eletrodo para que a estimulação ideal pode ser alcançada através da estimulação do nervo fibular. A localização dos eletrodos deve ser no lado lateral da perna (direita neste caso), perto da cabeça da fíbula e outros mais abaixo do lado lateral da perna (Figura 2). Com base nisso, os eletrodos feitos sob medidos são projetados como tal que ambos podem ser colocados na mesma posição sempre. No entanto, estimulação suficiente também pode ser conseguida usando as agulhas de eletrodo fornecidas com os aparelhos comerciais. Em terceiro lugar, é fundamental atingir picos negativos durante a configuração de tensão, girando no sentido horário o transdutor conectado para o estribo. Correto posicionamento dos eléctrodos de perna de rato com configuração máxima tensão tem demonstrado ser uma técnica que pode ser executada no mouse mesmo ao longo do tempo.

A capacidade de avaliar e controlar a função muscular em diferentes momentos do mesmo animal é uma importante avaliação para caracterizar doenças musculares diferentes, bem como a sua progressão. Além disso, esta medida de dorsiflexão muscular em ratos pode ser uma ferramenta para avaliar a eficácia de tratamentos potenciais em um ambiente fisiológico nativo, com o mínimo de estresse metabólico¹². Assim, ele fornece uma técnica para avaliar o tratamento de doenças, sua progressão e potencial do músculo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse	Aurora Scientific Inc.	305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus	Complete muscle function system
Conductive gel	Livingstone	ECGEL250	conductive gel used in the mice
Eye ointment	Alcon	Poly Visc	pharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)	Ilium	Metacam	veterinary medicine (injectable 5mg/ml)
Isoflurane	Zoetis	Isoflo	veterinary inhalation Anaesthetic