Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador

Resumo

Complexos de RNA/proteínas purificados usando estratégia botin-streptavidin são eluídos a solução sob condições de desnaturação de forma inadequada para mais de purificação e análise funcional. Aqui, descrevemos uma modificação desta estratégia que utiliza um foto-cleavable vinculador em RNA e um passo de UV-eluição suave, produzindo complexos de RNA/proteína nativos e totalmente funcionais.

Resumo

Por muitos anos, a interação excepcionalmente forte e rapidamente formada entre biotina e streptavidin tem sido utilizada com sucesso para a purificação parcial de complexos de RNA/proteínas biologicamente importantes. No entanto, esta estratégia sofre uma grande desvantagem que limita a sua utilização mais ampla: a interação de biotina/estreptavidina pode ser quebrada apenas sob desnaturação condições que também interrompem a integridade dos complexos eluted, portanto, impedindo sua subsequente análise funcional e/ou purificação mais por outros métodos. Além disso, as amostras eluted são frequentemente contaminadas com as proteínas de fundo que associam nonspecifically com grânulos de estreptavidina, complicando a análise dos complexos purificadas pela coloração prata e espectrometria de massa. Para superar essas limitações, nós desenvolvemos uma variante da biotina/estreptavidina estratégia em que biotina é ligada a um substrato de RNA através de um foto-cleavable vinculador e os complexos imobilizados em grânulos streptavidin são seletivamente eluídos a solução em um forma nativa por ondas longas UV, deixando as proteínas de fundo sobre os grânulos. Substratos de ligação de RNA mais curtos podem ser sintetizados quimicamente com biotina e o foto-cleavable vinculador covalentemente ligado à extremidade 5' do RNA, Considerando que mais substratos de RNA podem ser fornecidos com os dois grupos por do oligonucleotide complementar. Estas duas variantes do método UV-eluição foram testados para a purificação dos complexos processamento de U7 snRNP-dependente que cleave histona pre-mRNAs na extremidade 3' e ambos provaram comparar favoravelmente com outros anteriormente desenvolvido métodos de purificação. As amostras de UV-eluída continham quantidades prontamente detectáveis da snRNP U7 que era livre de contaminantes de proteína maior e adequado para análise direta por espectrometria de massa e ensaios funcionais. O método descrito pode ser facilmente adaptado para a purificação de outros complexos de ligação de RNA e usado em conjunto com sites de single e double-stranded DNA ligando para purificar DNA específicas proteínas e complexos macromoleculares.

Introdução

Em eucariontes, precursores do RNA polimerase II-gerado mRNA (pre-mRNAs) submeter-se a vários eventos de maturação no núcleo antes de se tornar totalmente funcional modelos de mRNA para síntese de proteínas no citoplasma. Um desses eventos é o processamento de final 3'. Para a grande maioria dos pre-mRNAs, processamento de final 3' envolve a clivagem acoplada a poliadenilação. Esta reação em duas fases é catalisada por um complexo relativamente abundante constituído por mais de 15 proteínas¹. Animais de replicação dependente de histona pre-mRNAs são processados na extremidade 3' por um mecanismo diferente em que o papel principal é interpretado por U7 snRNP, uma baixa abundância complexa consistindo de snRNA U7 de ~ 60 nucleotídeos e várias proteínas^2,3 . Os pares de bases de snRNA U7 com uma sequência específica na histona pre-mRNA e uma das subunidades da snRNP U7 catalisa a reação de clivagem, gerando histona madura mRNA sem um poli da cauda. 3' processamento de final de histona pre-mRNA também requer hairpin Loop ligação proteína (SLBP), que vincula um conservado Hairpin loop localizado a montante do local clivagem e melhora o recrutamento da snRNP U7 ao substrato^2,3. Estudos que visam identificar os componentes individuais da snRNP U7 tem sido desafiadoras devido a baixa concentração do U7 snRNP em células animais e a tendência do complexo para dissociar ou sofrer proteólise parcial durante a purificação devido à utilização de detergentes suaves^4,5,6, lavagens de sal elevadas e/ou múltiplas etapas cromatográficas^7,8,9.

Recentemente, para determinar a composição das máquinas processamento U7-dependente, um pequeno fragmento de biotina contendo de histona pre-mRNA em 3' ou 5' foi incubado com um extrato nuclear e os complexos montados foram capturados na streptavidin-revestido agarose grânulos^5,6,10. Devido a excepcionalmente forte interação entre biotina e estreptavidina, proteínas imobilizadas em grânulos streptavidin foram eluídas sob condições de desnaturação por ebulição em SDS e analisadas por coloração de prata e espectrometria de massa. Enquanto essa abordagem simples identificou uma série de componentes da snRNP U7, isso rendeu amostras relativamente brutas, muitas vezes contaminadas com um grande número de proteínas de fundo nonspecifically acoplado a grânulos de estreptavidina, potencialmente, mascarando alguns componentes do as máquinas de processamento e impedindo a sua detecção a prata manchada géis^5,6,10. Importante, esta abordagem também impedida qualquer estudos funcionais com o material isolado e sua depuração adicional a homogeneidade por métodos adicionais.

Foram propostas várias modificações ao longo do tempo para abordar a natureza praticamente irreversível da biotina/estreptavidina interação, com a maioria deles sendo projetado ou enfraquecer a interação ou para fornecer um braço quimicamente cleavable espaçador na Biotina-contendo reagentes^11,12. O lado negativo de todas essas modificações foi que eles reduzem significativamente a eficiência do método e/ou condições não-fisiológicas, muitas vezes exigidas durante a etapa de eluição, pondo em risco a integridade ou a atividade das proteínas purificadas.

Aqui, descrevemos uma abordagem diferente para resolver o problema inerente da biotina/estreptavidina estratégia usando o RNA de substratos em que biotina está covalentemente ligada à 5' acabam através de uma foto-cleavable 1-(2-nitrofenil) moiety etílico que é sensível a onda longa UV^13,14. Nós testamos esta abordagem para a purificação do mecanismo de processamento do limitante U7-dependente da drosófila e mamíferos nuclear extrai¹⁵. Após uma incubação curta de biotina contendo de histona pre-mRNA e o vinculador foto-cleavable com um extrato nuclear, os complexos de processamento montados são imobilizados em grânulos streptavidin, cuidadosamente lavados e lançados suavemente a solução em um nativo formulário pela exposição à luz de ~ 360 nm UV. O método de eluição de UV é muito eficiente, rápido e simples, produzindo quantidades suficientes da snRNP U7 Visualizar seus componentes por tira mancha de tão pouco como 100 µ l de extracto de¹⁵. O material UV-eluída é livre de proteínas de fundo e adequados para análise de espectrometria de massa direta, as etapas de purificação adicional e ensaios enzimáticos. O mesmo método pode ser adoptado para a purificação de outros complexos de RNA/proteína que exigem relativamente curtos locais obrigatórios de RNA. Biotina e o foto-cleavable vinculador também podem ser ligado covalentemente ligados para single - e ADN double-stranded, potencialmente estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de vários complexos de DNA/proteínas.

Síntese química de substratos de RNA contendo covalentemente ligados a biotina e o vinculador foto-cleavable é prático apenas com as sequências que não excedam ~ 65 nucleotídeos, tornando-se caro e ineficiente para sequências significativamente mais tempo. Para resolver este problema, desenvolvemos também uma abordagem alternativa que é adequada para alvos de ligação de RNA muito mais tempo. Nesta abordagem, RNA de qualquer sequência de comprimento e o nucleotídeo é gerado em vitro pela transcrição T7 ou SP6 e recozido para um curtas do oligonucleotide complementar que contém biotina e o foto-cleavable vinculador na extremidade 5' (trans configuração). O duplex resultante é posteriormente usado para purificar proteínas individuais ou complexos macromoleculares em grânulos streptavidin seguindo o mesmo protocolo descrito para os substratos de RNA contendo biotina foto-cleavable ligada covalentemente (cis configuração). Com essa modificação, a foto-cleavable biotina pode ser usada em conjunto com transcrições em vitro gerado contendo centenas de nucleotídeos, estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de uma ampla gama de RNA/proteína.

Protocolo

1. os preparadores

Nota: Substratos de RNA menores que 65 ~ nucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente com biotina (B) e o vinculador foto-cleavable (pc) (juntas conhecidas como foto-cleavable biotina ou pcB) covalentemente ligado à extremidade 5' do RNA (configuraçãocis ). Substratos de RNA contendo significativamente mais sítios de ligação precisam ser gerado em vitro pela transcrição T7 (ou SP6) e posteriormente recozido para do oligonucleotide curto adaptador complementares contendo agrupamento de pcB na extremidade 5' (trans configuração) (Figura 1).

1. Para locais obrigatórios consistindo de menos de 65 ~ nucleotídeos, use um fabricante comercial (Tabela de materiais) para sintetizar quimicamente RNA de interesse com o pcB covalentemente ligado à extremidade 5' do RNA (figura 1A e Figura 2A). Dissolver em água estéril para atingir a concentração desejada e armazenar em pequenas alíquotas a-80 ° C.
2. Para locais obrigatórios significativamente mais do que 65 ~ nucleotídeos, forma um duplex parcial de um em vitro gerado RNA de interesse e do oligonucleotide adaptador complementares contendo o agrupamento de pcB na extremidade 5' (Figura 3A).
   1. Execute a transcrição de T7 em um Plasmídeo linear ou um modelo apropriado de PCR para gerar RNA com o sítio de ligação de interesse estendido na extremidade 3' por uma sequência arbitrária de ~ 20-nucleotide.
   2. Use um fabricante comercial (Tabela de materiais) para sintetizar quimicamente do oligonucleotide adaptador que é complementar a extensão de 3' no ARN T7-gerado e contém pcB na extremidade 5' (Figura 3A).
      Nota: Dois espaçadores de 18-átomo e 2-3 nucleotídeos complementares-não podem ser colocados na extremidade 5' do oligonucleotide para reduzir potencial estérico entre o complexo ligado e grânulos de estreptavidina. É também desejável que o oligonucleotide uniformemente é modificado com um grupo 2' O-metil para aumentar a força de duplex e para fornecer a resistência contra vários nucleases.
   3. Recoze o RNA T7-gerado para do oligonucleotide adaptador de pcB.
      1. Mix 20 pmol do RNA e 100 pmol do adaptador pcB do oligonucleotide (razão molar de 1:5) em um 1,5 mL tubo contendo 100 µ l de tampão de ligação com a seguinte composição: 75 mM KCl, pH HEPES 15mm 7,9, 15% de glicerol, ácido de 10mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
         Nota: É importante usar uma quantidade mínima do do oligonucleotide adaptador que é suficiente para formar um duplex com substrato de pre-mRNA maioria (se não todos) usado na reação de recozimento. Isso poderia ser convenientemente determinado pela rotulagem substrato RNA na extremidade 5' com ³²P, recozimento o substrato rotulado com o aumento da quantidade do adaptador do oligonucleotide usando vários de buffer condições de monitoramento e a retenção da sinal radioativo em grânulos streptavidin após várias lavagens dos grânulos com o tampão de ligação.
      2. Coloca o tubo em água fervendo por 5 min.
      3. Permitir que a água arrefecer à temperatura ambiente.

2. complexo Assembly

1. Suplemento 1 mL de um extrato nuclear do mouse (ou outro extrato de escolha) com 80 mM EDTA pH 8 uma concentração final de 10 mM para bloquear inespecíficas nucleases dependente de metal que estão presentes no extrato.
   Nota: Isto irá resultar em ajustando o buffer no extrato para a mesma composição que no buffer de ligação (consulte a etapa 1.2.3.1). EDTA não afeta em vitro processamento de histona pre-mRNAs mas pode ser prejudicial na purificação de proteínas ou complexos de proteína que reúnam de forma dependente de magnésio. Nesses casos, o EDTA deve ser evitado.
2. Adicionar 5-10 pmol do substrato RNA marcado com o moiety do pcB em cis (consulte Etapa 1.1) ou trans (consulte a etapa 1.2.3.3) a 1 mL de extracto que contenha 10 mM de EDTA.
   Nota: A quantidade de RNA deve ser cuidadosamente avaliado em uma série de experimentos de julgamento. Usando muito substrato RNA para a purificação de um complexo limitante talvez contraproducente, aumentando significativamente o plano de fundo de proteínas não específicas do RNA sem ter qualquer efeito sobre o rendimento de proteínas específicas.
3. Incube o substrato de RNA com o extrato por 5 min no gelo, ocasionalmente, misturar a amostra.
   Nota: Tanto o tempo e a temperatura de incubação devem ser estabelecidas empiricamente e podem variar significativamente, dependendo da natureza específica do complexo RNA/proteína.
4. Gire a mistura de incubação em pre-cooled microcentrifuga durante 10 minutos a 10.000 g x para remover qualquer potenciais precipitados e recolher cuidadosamente o sobrenadante evitando transferir a pelota.

3. imobilização dos complexos RNA/proteína em grânulos de estreptavidina.

1. Transferir ~ 100 µ l de suspensão de grânulo de agarose streptavidin de um fornecedor comercial (Tabela de materiais) para um tubo de 1,5 mL e aumente o volume com o tampão de ligação (75 mM KCl, pH HEPES 15mm 7,9, 15% de glicerol, 10 mM de EDTA).
   Nota: Esta reserva deve ter a mesma composição que a mistura de recozimento e no extrato utilizado para montagem complexa (passo 2.1).
2. Recolher as gotas na parte inferior do tubo por fiação para 2-3 min a 25 x g e aspire o sobrenadante.
3. Repita o mesmo procedimento de lavagem/fiação 2 - 3 vezes para equilibrar as contas com o tampão de ligação.
   Nota: No final desta etapa, a pelota dos grânulos deve ter um volume de ~ 30 µ l.
4. Carrega o sobrenadante contendo o complexo montado (passo 2.4) o terço de agarose streptavidin equilibrado.
5. Gire 1 h a 4 ° C para imobilizar RNA e os complexos limite sobre os grânulos.
6. Recolha as gotas na parte inferior do tubo por fiação para 2-3 min a 25 x g.
   Nota: Use um swing rotor para evitar perda substancial dos grânulos se eles tendem a aderir ao lado do tubo em rotores angulares.
7. Aspirar o sobrenadante e enxágue os grânulos duas vezes com 1 mL de tampão de ligação, usando as mesmas condições de centrifugação.
8. Adicionar 1 mL de tampão de ligação e girar a amostra 1 h a 4 ° C.
   Nota: Este passo pode ser reduzido se o complexo formado no substrato tende a dissociar.
9. Spin para baixo os grânulos para 2-3 min a 25 x g, adicionar 1 mL de tampão de e a suspensão de transferência para um novo tubo.
10. Girar para uma 1h adicional ou mais curtos, se o complexo não é estável, spin para baixo durante 2-3 min a x 25 g e transferir as contas para um tubo de 500 µ l em 200 µ l de tampão de ligação.

4. UV-eluição.

1. Liga uma lâmpada de UV, emitindo luz de UV 365 nm por 5-10 min antes de atingir o brilho cheio de alta intensidade.
   Nota: Isto é essencial para alcançar o máximo de energia de emissão de UV no início da irradiação.
2. Encha o fundo de um prato de Petri (100 x 15 mm) com gelo hermeticamente embalado e empilhá-la sobre a tampa do prato.
3. Brevemente vórtice o tubo contendo o complexo imobilizado, colocá-lo horizontalmente no gelo e tampa com a lâmpada pré-aquecido, assegurando que a amostra está localizada a distância de 2 a 3 cm da superfície do bulbo.
   Nota: Se a distância for muito grande, use pratos de Petri adicionais ou outros objetos adequados para levar a amostra mais perto ao bulbo.
4. Irradiar para um total de 30 min, frequentemente invertendo e utilização do Vortex o tubo para assegurar exposição uniforme da suspensão ao UV e para evitar o superaquecimento.
   Nota: Para fornecer resfriamento adicional, a etapa de UV-eluição pode ser efectuada em uma sala fria. Alternar para uma placa de Petri com gelo fresco em caso de excessivo gelo derretendo.
5. Gire para baixo as contas para 2-3 min a 25 x g e recolher o sobrenadante.
6. Re-spin do sobrenadante usando as mesmas condições e recolher o sobrenadante.
   Nota: Deixe uma pequena quantidade de líquido sobrenadante na parte inferior para evitar transferir contas residuais.

5. amostra análise pela coloração prata seguido por espectrometria de massa.

1. Uso electroforese do gel de SDS/poliacrilamida, para separar uma fração do líquido sobrenadante UV-eluída e a mesma fração do material deixado sobre os grânulos após eluição de UV.
   Nota: A análise também pode incluir uma alíquota dos grânulos retirados da amostra antes de UV-eluição.
2. Manche o gel, que contenham proteínas separadas usando uma prata comercialmente disponível kit de coloração.
3. Avalie a eficiência da eluição de UV, comparando as intensidades das proteínas presentes no sobrenadante UV-eluída e aqueles deixados sobre as contas após a irradiação UV.
4. Impostos especiais de consumo das bandas de proteínas de interesse e determinar suas identidades por espectrometria de massa usando protocolos padrão^10,15.

6. global análise da amostra de UV-eluída por espectrometria de massa.

1. Analise diretamente uma fração do líquido sobrenadante UV-eluída por espectrometria de massa para determinar o proteome inteiro do material purificado de forma imparcial.
   Nota: Isto pode ser feito por tratamento na solução das amostras purificadas com tripsina seguida por protocolos padrão espectrometria de massa para determinar a identidade do gerar peptídeos^10,15.

Resultados

O método UV-eluição foi testado com dois substratos de RNA sintetizados quimicamente ligados covalentemente na extremidade 5' para o agrupamento de pcB (configuraçãocis ): pcB-SL (Figura 1) e RNAs pcB-dH3/5 m (Figura 2). O pcB 31-nucleotide-SL RNA contém uma estrutura de Hairpin loop, seguida de uma 5-nucleotídeo única encalhada cauda e sua sequência é idêntica à extremidade 3' de histona madura mRNA (i. ...

Discussão

O método descrito aqui é simples e, além disso incorporando um foto-cleavable vinculador e o passo de UV-eluição não difere os métodos comumente usados que tiram proveito da extremamente forte interação entre biotina e estreptavidina. A etapa de eluição de UV é muito eficiente, normalmente, liberando mais de 75% do RNA imobilizado e associados a proteínas de estreptavidina missanga, deixando para trás um fundo elevado de proteínas que se ligam não específica para as contas. Eliminando este pano de fundo,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp	Cole-Parmer	UX-97600-00
Replacement bulb	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612