Níveis de Giberelina celular visualização usando a energia de ressonância de Förster NlsGPS1 transferir Biosensor (FRET)

Resumo

Percepção de Giberelina Sensor 1 (GPS1) é o primeiro Förster ressonância energética baseada em transferência biosensor para medir os níveis celulares de fitohormônios Giberelina com uma alta resolução spatiotemporal. Este protocolo informa o método para visualizar e quantificar os níveis de Giberelina celular usando o biosensor nlsGPS1 geneticamente codificado em Arabidopsis hipocótilo e dicas de raiz.

Resumo

A Giberelina phytohormone (GA) é uma molécula de sinalização que desempenha um papel fundamental na germinação de sementes, alongamento celular e transições do desenvolvimento em plantas pequena, móvel. Percepção de Giberelina Sensor 1 (GPS1) é a primeira transferência de energia de ressonância Förster (FRET)-baseado biosensor que permite o monitoramento dos níveis de GA celulares in vivo. Medindo-se uma relação de emissão de fluorescência de nuclear localizada-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapeamento de gradientes de GA endogenamente e exogenamente fornecidos em tipos diferentes de tecido é viável em escala celular. Este protocolo irá descrever como rácios de emissão nlsGPS1 em três experimentos de exemplo de imagem: estado estacionário, tratamentos de₄ (GA₄) exógena A Giberelina antes e depois e durante um tempo-curso de tratamento. Nós também fornecemos métodos para analisar rácios de emissão de nlsGPS1 usando um software de visualização e análise comercial tridimensional (3D) Micrografia e Fiji e explicar as limitações e prováveis armadilhas de usar nlsGPS1 para quantificar os níveis de Giberelina.

Introdução

Hormonas vegetais desempenham um papel fundamental no desenvolvimento e crescimento das plantas. Estas moléculas sinalizadoras pequenas, móveis são normalmente reguladas em vários níveis, tais como transporte de curto e de longo curso^1,2,3,4, biossíntese e catabolismo. A compreensão das vias de sinalização de hormônio e a jusante respostas transcriptional aguçou-se ao longo dos anos. No entanto, para vincular as diversas respostas celulares das vias de sinalização do hormônio com as entradas regulamentares direcionando as distribuições de hormônio, exigimos uma spatiotemporal quantificação dos níveis de hormônio em escala celular. Biossensores baseados no traste que podem detectar fitohormônios podem avançar capacidade dos cientistas para quantificar os níveis hormonais em uma escala celular. Biossensores baseados em FRET consistem de um par FRET (doador e aceptor de proteínas fluorescentes) ligado a um domínio sensorial que vincula um ligante específico ou responde a um estímulo biológico. Para biossensores de pequenas moléculas, ligação ligante desencadeia uma mudança conformacional do domínio sensorial que resulta em uma mudança de distância e/ou orientação entre as duas proteínas fluorescentes do par FRET. Uma análise ratiometric de um biossensor FRET é realizada pela emocionante do doador e medem a proporção de emissão de fluorescência do aceitador mais doador^5,6. Ligação do ligante é detectável como uma mudança nesta relação de emissão⁷.

Recentemente desenvolvemos um biossensor baseado em FRET para o hormônio vegetal GA. gás são uma classe de hormônios que podem promover a germinação das sementes, alongamento celular e a transição do desenvolvimento de vegetativo para as fases de floração. O nlsGPS1 biosensor é nuclear localizada e fornece insights spatiotemporal sobre dinâmica de GA em tecidos vegetais diversos. Nas células de Arabidopsis , GA liga aos receptores solúveis, diferenciação de Giberelina anão (GID), e o complexo induz a degradação de proteínas DELLA que agem como reguladores negativos de GA sinalização². O domínio sensorial GA de nlsGPS1 é composto por receptor de Arabidopsis GA (AtGID1C), ligado a um truncamento 74-amino ácido de uma proteína DELLA (AtGAI) e um par FRET consistindo de reforçada variantes de dimerização de Cerulean como a proteína fluorescente do doador e Afrodite (uma codão diversificada Venus) como o aceitador proteína fluorescente⁸. O biosensor nlsGPS1 é um sensor de alta afinidade para o GA bioativos₄ (K_d = 24 nM para GA₄) e pode ser utilizada em diversos tipos de tecido para mapear e quantificar a gradientes de GA. Para evitar interpretações erradas dos níveis de Arabidopsis GA in vivo, também desenvolvemos uma variante não responde de nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) para usar como um controle negativo. A proteína nlsGPS1-NR carrega mutações no bolso GA-ligação que interrompem a ligação do GA e mutações na proteína DELLA que interrompem a interação com o GID do receptor proteínas^7,9. Padrões de relação de emissão ou alterações observadas em ambos os nlsGPS1 e nlsGPS1-NR linhas podem ser consideradas artefatos não directamente relacionados com eventos de ligação de GA. Também é importante notar que nlsGPS1 ligação para GA₄ não é rapidamente reversível, e portanto, taxas de emissão nlsGPS1 celular devem ser interpretadas como representando a maior concentração de recente de GA em um determinado núcleo ao invés de em tempo real níveis de estado estacionário. Como consequência, uma análise da queda dos níveis de GA não é possível com nlsGPS1.

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a utilização de um biossensor de nlsGPS1 nas células da planta modelo Arabidopsis, usando abordagens baseadas em imagem latente confocal em uma alta resolução. O protocolo fornece informações sobre as raízes das plantas de imagem e hipocótilo em estado estacionário e ao longo do tempo-cursos. O sensor de nlsGPS1 potencialmente poderia ser utilizado em diversos tipos de tecido, bem como nas espécies de plantas, para mapear e quantificar as distribuições de GA.

Protocolo

1. preparações

1. Prepare ½ Murashige e Skoog agar pH 5.7 com sem sacarose (1 L).
   1. Dissolva a 2,2 g de meio basal de Murashige e Skoog (MS) em 950 mL de água ultrapura. Ajuste o pH a 5.7 com 5 M de KOH.
   2. Compõem a solução até um volume final de 1 L com água ultrapura. Divida-o em duas garrafas de 500 mL, cada contendo ágar de planta de 1%. Autoclave a 121 ° C por 20 min.
2. Prepare o líquido MS ¼ em pH 5,7 com sem sacarose (1 L).
   1. Dissolva 1,1 g de MS em 950 mL de água ultrapura. Ajuste o pH a 5.7 com 5 M de KOH. Compõem a solução até um volume final de 1 L com água ultrapura. Divida-o em duas garrafas de 500 mL. Autoclave a 121 ° C por 20 min.
3. Prepare GA₄.
   1. Dissolva o GA₄ em etanol 70% tornar-se uma concentração final de estoque de₄ 100 mM GA.
   2. Para preparar a solução de trabalho, diluir o estoque de₄ GA de 0,1 a 1 µM em MS ¼ líquido pH 5,7.

2. planta de crescimento

1. Esterilize as sementes de Arabidopsis .
   1. Trabalha usando um capuz químico. Alíquota sementes (aproximadamente 200) para tubos de microcentrifuga de 2 mL. Use um marcador com tinta resistente ao cloro e coloque os tubos com tampas abertas no interior da embarcação de esterilização (uma caixa grande que pode ser selada).
   2. Coloque um copo de 250 mL contendo 50 mL de água ultrapura e 50 mL de solução de hipoclorito de sódio no interior da embarcação de esterilização.
   3. Adicione 3 mL de ácido clorídrico concentrado (HCl) para o copo. Imediatamente selar o recipiente e permitir a esterilização por gás cloro para 6 – 16 h.
   4. Após a retirada do selo do navio, feche as tampas de todos os tubos de microcentrifuga o rack de semente. Sementes esterilizadas podem ser armazenadas secos até a hora do chapeamento.
2. Semear aproximadamente 20 esterilizado Arabidopsis em placas com agar ½ MS quadrados. Selar as placas com esparadrapo poroso e embrulhe com papel alumínio. Incube-os a 4 ° C 1 – 3 dias de estratificação.
3. Para a imagem latente de raiz, transferir as placas para a câmara de crescimento na posição vertical durante 3 dias, com as seguintes condições de crescimento: condições de longo-dia (LD, 16 h de luz/8 h de escuro); µmol⋅m 120^-2s^-1 intensidade de luz; temperatura de 22 ° C (durante o ciclo de luz) ou 18 ° C (durante o ciclo escuro), 65% de umidade relativa (RH).
4. Para hypocotyl escuro-crescido: transferir as placas para a câmara de crescimento para um pulso de luz de 1 a 4 h para sincronizar a germinação. Embrulhe as placas com papel alumínio e colocá-los na câmara de crescimento na posição vertical durante 3 dias.

3. preparação da amostra

1. Medições de estado estacionário (figura 1A)
   1. Em uma corrediça do microscópio limpa, adicione 50 µ l de líquido MS ¼ (doravante denominado como solução de simulação). Gentilmente transferi mudas expressando nlsGPS1 da placa para o slide.
   2. Pegue uma lamínula limpa e detectar uma gota de gordura vácuo em cada canto da lamela. Coloque delicadamente a lamela sobre as mudas e cuidadosamente adicionar extra simulada solução para remover quaisquer bolhas de ar.
2. Tratamento de GA₄ : experiência de troca de químicos (figura 1B).
   1. Antes do tratamento de₄ GA, use uma seringa de 20 mL cheia de graxa vácuo (anexada a uma ponta da pipeta) para desenhar um retângulo (comprimento: 3,5 cm, altura: 2,5 cm) com uma camada uniforme de gordura vácuo em uma lâmina de vidro limpa (figura 1B). Para permitir uma linha fina de graxa de vácuo, a ponta da pipeta deve ser cortada para ter uma abertura de 1 mm de diâmetro.
   2. Adicione 50 µ l de solução de simulação para a lâmina de vidro. Com a pinça limpa, escolher as mudas de nlsGPS1 e gentilmente colocá-los sobre a solução de simulação. Para evitar qualquer dano, transferi as mudas, apoiando a parte inferior das cotilédones sem agarrar o seedling com a pinça.
   3. Pegue uma lamínula limpa e detectar uma gota de gordura vácuo em cada canto da lamela. Usando a pinça, coloque lamela no centro do retângulo de vácuo graxa. Agora a lamela é selada nos dois lados correspondentes às bordas do retângulo de vácuo graxa longas.
   4. Adicione cuidadosamente extra simulada solução para encher o reservatório e remover quaisquer bolhas de ar dentro do reservatório sem perturbar o seedling(s) lá dentro.
   5. Adquira as imagens antes do tratamento de₄ GA usando um microscópio confocal. Siga as instruções conforme descrito na seção 4 do presente protocolo.
   6. Para o tratamento de₄ GA, remova a lâmina de microscópio confocal palco. Defina um temporizador para 20 min.
   7. Depois de iniciar o temporizador, troca a solução-tampão com MS ¼ líquido contendo 1 µM GA₄. Adicionar a solução de₄ GA (aproximadamente 50 µ l) do lado esquerdo da lamela e remover a solução anterior (simulação) do lado direito. Manter em trocar a solução para substituir a simulado solução completamente, o que leva cerca de 10 min (figura 1B).
   8. Coloque a lâmina de vidro de volta ao palco microscópio. Espere mais 10 minutos antes de adquirir a imagem após-GA.
3. Inicia-se a um curso de tempo para o tecido de interesse
   Nota: O tecido de interesse pode ser, por exemplo, hipocótilo ou raízes. Rotineiramente realizamos cursos de tempo para nlsGPS1 biosensor usando um sistema de perfusão comercial de imagem (Figura 1, ver Tabela de materiais) ou um RootChip^7,10,11.
   1. Adicionar 200 µ l de solução de simulação para o centro do canal do pegajoso-slide de perfusão (ver Tabela de materiais). Delicadamente, escolher nlsGPS1 mudas e colocá-los sobre a solução de simulação no pegajoso-slide.
   2. Usando fórceps, gentilmente colocar a lamela de vidro e, usando a parte de trás da pinça, pressione suavemente as bordas externas da lamela para que formam uma forte ligação com o material pegajoso na periferia do pegajoso-slide.
   3. Usando dois cotovelo Luer conectores (com um diâmetro interno [ID] de 0,8 mm) e o tubo de silicone (com uma identificação de 0,8 mm), conecte o pegajoso-slide para uma seringa de 20 mL e um recipiente de saída coletando a solução de saída. Use o conector de bloqueio de Luer (com uma identificação de 0,8 mm) para conectar a seringa para o tubo do silicone.
   4. Pressione suavemente a seringa contendo a solução simulada manualmente para permitir suficiente solução passa através da câmara para que não haja nenhuma bolha de ar na câmara. Coloque e segure a seringa da bomba de seringa programável.
   5. Defina os parâmetros de bomba específica para a seringa usada (i.., diâmetro e volume) juntamente com a taxa de fluxo de acordo com o manual fornecido com a bomba.
      Nota: Neste protocolo, utilizou-se um caudal de 1 – 3 mL/h, e isso pode ser alterado de acordo com as exigências experimentais. Inicie o curso do tempo, iniciando a bomba.
   6. Para o tratamento de₄ GA durante um curso de tempo (Figura 1), passar a perfusão pausando a bomba e mudar a seringa com um líquido de ¼ MS um novo contendo suplementado com GA₄. Proceda com imagem latente confocal, conforme mostrado na próxima seção.

4. microscopia

Nota: Realizamos microscopia confocal do laser.

1. Adquira imagens usando um microscópio confocal equipado com lasers para realizar imagens de traste.
   Nota: Para nlsGPS1, são imagens de variantes da proteína fluorescente ciana (PCP) e proteína fluorescente amarela (YFP). Neste protocolo, microscópios comerciais (ver Tabela de materiais, listado como microscópio 1 e 2) são usados com x 10 ou 20 x seco 0,70 harmónico composto APO plano de objectivos.
2. Para microscópio 1, uso 448 nm e lasers de comprimento de onda 514 nm para excitar o PCP e YFP, respectivamente. Adquira exames sequenciais. Conjunto de detectores (e.g., HyD SMD) para detectar 460-500 nm para PCP (emissão de doador) e 525 – 560 nm para YFP (emissão de FRET) após a excitação do PCP. Usando uma segunda sequência, defina um detector para detectar 525 – 560 nm YFP (emissão YFP) após a excitação do YFP.
   Nota: Esta fluorescência YFP é usada como um controle de expressão, bem como em núcleos, a segmentação para gerar superfícies utilizando um comercial Micrografia 3D visualização e análise de software.
3. Para microscópio 2, uso 440 nm e 514 nm de comprimento de onda do laser as linhas para excitar o PCP e YFP, respectivamente. Adquira duas faixas. Para faixa 1, conjunto detectores (ex.., ChS) para detectar 464-500 nm para PCP (emissão de doador) e 526 – 562 nm para YFP (emissão de FRET) após a excitação do PCP. Para a faixa 2, defina um detector para detectar 526 – 562 nm YFP (emissão YFP) após a excitação do YFP.
   Nota: Esta fluorescência YFP é usada como um controle de expressão, bem como em núcleos, a segmentação para gerar superfícies do software de visualização e análise 3D.
4. Adquira imagens usando um formato de 512 x 512 pixels e uma resolução de 12 bits.
5. O ganho deve ser ajustado para um valor determinado empiricamente que permite um bom sinal enquanto não saturar pixéis. O ganho não deve ser alterado entre PCP e FRET emissão sobre o experimento. Defina o pinhole para 1 unidade arejada (AU). Coloque o IBIDI pegajoso-slide na fase do microscópio confocal e proceder com imagens como anteriormente indicada.
6. No software microscópio 1, enquanto em um scan ao vivo ativo, utilizam brilham sobre/sob localizado na parte superior esquerda da tela de imagem para determinar a subexposição e saturação da região de interesse. No software microscópio 2, utilizam Gama indicador localizado no lado inferior da tela de imagem para determinar a subexposição e saturação da região de interesse. Para qualquer análise quantitativa de imagem, não deve haver nenhuma saturação de pixel.
7. Defina os z-pilhas com um tamanho de passo de 1 μm. O tamanho do passo pode ser reduzido para uma z-Resolução aumentada ou aumentado para uma maior velocidade de aquisição ou para aumentar o número de posições/amostras que pode ser fotografada. Para o curso de tempo automatizado, defina o tempo junto com os z-pilhas (xyzt modo de guia de modo de aquisição) para adquirir as imagens em intervalos de tempo definido.

5. imagem análise usando Fiji

Nota: Usando o ImageJ (Fiji) é possível processar dados de imagens e produzir bidimensionais (2D) imagens da relação de emissão de nlsGPS1 em plântulas de Arabidopsis . Para obter exemplos de imagens, ver Fig. 2A, 2C, 2E, 2Ge 3A. No ImageJ, é possível encontrar cada comando do presente protocolo, usando a função de pesquisa. Pressione a barra de espaço e L sobre o teclado do computador. Uma nova janela abrirá; Digite o comando exigido no campo de busca.

1. Arraste o ficheiro (ou .lif ou .lsm) para Fiji (Image J) e abrir as imagens como hiperpilha.
2. No menu principal, selecione imagem > pilha > Z projeto e selecionar fatias de soma para capturar todos os pixels ao invés de apenas os pixels mais brilhantes como na projeção de Max.
3. No menu principal, selecione o processo > fundo Subtract e definir o raio de bola rolando para 50 pixels. Cancelar a seleção de outras opções e processar todas as três imagens. Nesta etapa remove o plano de fundo usando o algoritmo "rolando a bola".
   Nota: 50 pixels foi determinada empiricamente a incluem núcleos como primeiro plano.
4. No menu principal, selecione imagem > cor > canais de Split. Três novas janelas serão aberto: C1-soma (canal do PCP); C2-soma (Canal do FRET) e C3-soma (canal YFP).
5. Selecione a janela C3-soma e, no menu principal, selecione o processo > filtros > Gaussian Blur e aplique um Gaussian Blur de 1 para reduzir o ruído de imagem.
6. No menu principal, selecione imagem > ajustar > Brilho/contraste e selecione auto.
7. No menu principal, selecione o processo > Melhorar o contrastee conjunto saturada = 0,35.
8. No menu principal, selecione imagem > tipo > 8 bits e converter as pilhas em uma imagem de 8 bits.
9. No menu principal, selecione Image > Adjust > Limiar Auto-Local. No Limiar da Auto-Local, selecione os seguintes parâmetros: método Phansalkar, raio = 15, os parâmetros 1 = 0, 2 = 0e branca pilha. Nesta etapa, pilhas YFP são usadas para fazer uma máscara binária.
10. Selecione a janela C2-soma e, no menu principal, selecione o processo > filtros > Gaussian Blur e aplique um Gaussian Blur de 1.
11. Selecione a janela C1-soma e, no menu principal, selecione o processo > filtros > Gaussian Blur e aplique um Gaussian Blur de 1.
12. Para criar a pilha de taxa de emissão de dois canais, no menu principal, selecione o processo > Calculadora de imagem. Na nova janela que irá aparecer, selecione C2-soma como imagem 1, selecione dividir como operador e selecione soma C1 como imagem 2.
13. Certifique-se de selecionar criar uma nova janela e o formato de 32 bits. Uma nova janela aparecerá chamado Resultado de C2-soma.
14. No menu principal, selecione imagem > tabela de pesquisa > LUT 16_colors.
15. No menu principal, selecione o processo > Calculadora de imagem. Na nova janela que irá aparecer, selecione Resultado de C2-soma como imagem 1, selecione multiplicar como operador e selecione C3-soma como imagem 2. Nesta etapa, a máscara binária YFP é multiplicada com pilha para mostrar somente pixels presentes no canal de controle YFP YFP/PCP.
16. No menu principal, selecione o processo > matemática > dividir e definir o valor para 255. Na nova janela que se abre, selecione Sim para analisar todas as imagens na pilha. Uma nova imagem aparecerá chamado Resultado de resultado de C2-soma.
17. No menu principal, selecione imagem > ajustar > Brilho/contraste e selecione Auto.
18. No menu principal, selecione o processo > Melhorar o contrastee selecione tipo saturado = 0.35.
19. No menu principal, selecione imagem > ajustar > Brilho/contrastee definir valores mínimos e máximos para capturar a distribuição de GA. Passo opcional: no menu principal, selecione analisar > ferramentas > Barra de calibração e LUT-calibração de Show bare salvar o Resultado de resultado de C2-soma como um arquivo. TIFF.
20. Para obter valores de emissões de rácios, no menu principal, selecione analisar > conjunto de medição e selecione significa valor cinza e desvio-padrão.
21. Selecione a forma de retângulo na barra de ferramentas e desenhar uma região de interesse (ROI). No menu principal, selecione analisar > medida. Uma nova janela irá relatar o valor médio de ROI o selecionado.
22. Copie e cole os valores obtidos no software de planilha (por exemplo, Excel ou OriginPro) e faça um histograma para um tratamento de₄ de GA antes e depois de experimentar ou um gráfico de linhas para um curso de tempo experimentar.

6. imagem análise usando Software de análise e visualização em 3D

Nota: A vantagem de usar o software selecionado (ver Tabela de materiais) é segmentar objetos (por exemplo, núcleos) e criar imagens em 3D de uma z-pilha confocal. Para obter exemplos de imagens, consulte Figura 2B, 2D, 2F, 2 He 3B.

1. Abra o software e importar o ficheiro (ou .lif ou .lsm).
2. Núcleos do segmento com base no controle canal de emissão YFP usando o Assistente de superfícies. Os objetos segmentados são denominados "superfícies". Esta etapa de segmentação permite a análise de todos os voxels em um núcleo como um objeto ao eliminar o fundo de voxels fora do núcleo.
3. No Assistente de superfícies, defina a subtração de fundo (contraste local) de 3 µm e o limiar para o padrão. O PCP de emissão (doador excitação doador de emissão [DxDm]) e canais de emissão (doador excitação aceitador de emissão [DxAm]) FRET com base nas superfícies criadas usando o YFP emissão (aceitador excitação aceitador de emissão [yttaurana]) canal da máscara.
4. Use a extensão XT significa a relação de intensidade para calcular uma relação de doador excitação aceitador de emissão dividido pelo doador excitação doador de emissão (DxAm/DxDm) entre os valores de intensidade média das superfícies individuais em dois canais.
   Nota: Esta extensão está disponível online para download.
5. Para as superfícies individuais com a relação de emissão de nlsGPS1 de cor, selecione cor de codificação com estatísticas, que é representado como um ícone de roda de cor. Selecione a relação da intensidade como tipo de estatísticas.
6. Exporte as relações entre os valores individuais da tabela, que é encontrada sob o ícone de estatísticas .
7. Copie e cole os valores em uma planilha e faça um histograma para antes e depois GA₄ tratamento experiências ou um gráfico linear para tempo curso de experiências.

7. análise estatística

Nota: Ver Figura 3D para um lote de beeswarm e caixa de taxas de emissão de nlsGPS1.

1. Abra o software e colar a relação de emissão das superfícies núcleos como colunas de Y.
2. Selecione as colunas de interesse e estatísticas > Estatísticas Descrição > normalidade teste para saber se as amostras são normalmente distribuídas. Executar o teste de normalidade e uma nova janela abrirá e relatar os resultados.
3. Se as amostras são normalmente distribuídas, usar o t-teste como teste estatístico. Selecione estatísticas > testes de hipóteses > teste t de duas amostras em linhas e executar o t-teste.
4. Se as amostras não são normalmente distribuídas, selecione estatísticas > testes de hipóteses estatísticas > duas amostras teste de variância para saber se a variação entre as amostras não é significativamente diferente.
5. Se a variância não é significativamente diferente, use o teste de Mann-Whitney U como teste estatístico. Selecione estatísticas > Teste não paramétrico > teste de Mann-Whitney e executar o teste.
6. Se a variância é significativamente diferente, use teste Kruskal Wallis ANOVA como teste estatístico. Selecione estatísticas > Teste não paramétrico > teste de Kruskal Wallis ANOVA e executar o teste.

Resultados

Usando nlsGPS1, é possível medir celular GA₄ níveis em tecidos passíveis de geração de imagens de fluorescência, incluindo dicas de raiz e escuro-crescido hipocótilo (Figura 2). Na raiz de Arabidopsis , o gradiente de proporção de emissão de nlsGPS1 é indicativo de níveis baixos de GA nas zonas meristemáticas e divisão e altos níveis de GA na zona de alongamento final (Figura 2A e 2B). Em contraste, um gradiente de proporção de emissão não foi observado nas raízes nlsGPS1-NR, sugerindo que o gradiente de GA endógeno não é um artefato (Figura 2 e 2D). Um gradiente de proporção de emissão de nlsGPS1 também foi formado em hipocótilo escuro-crescido, com níveis baixos nos cotilédones e o gancho apical e níveis elevados na região basal rapidamente alongando do hypocotyl (Figura 2E e 2F). Em contraste, um gradiente de proporção de emissão não foi observado no hipocótilo nlsGPS1-NR (Figura 2 e H 2). Em raízes de Arabidopsis e pilhas hypocotyl escuro-crescido, acúmulo de GA endógeno correlacionados com taxa do alongamento celular.

Além disso, fornecido exogenamente GA₄ acumula-se preferencialmente na zona de alongamento em comparação com a zona de divisão da Arabidopsis raiz (Figura 3), indicando que nlsGPS1 pode ser usado para estudar GA endógeno e exógeno padronização.

Durante as experiências de curso do tempo, nlsGPS1 mudas foram colocadas em câmaras pegajoso-slide e pintadas com MS ¼ líquido, seguido de um tratamento com 0.1 µM GA₄ por 30 min. O vídeo mostra uma mais rápida acumulação de exógenos GA₄ na zona de alongamento raiz em comparação com a zona de divisão (vídeo 1).

Figura 1: exemplo de preparação para a imagem latente confocal. Estes painéis mostram uma representação esquemática da preparação da amostra (A), um experimento de estado estacionário, (B) antes e depois exógena GA₄ tratamentos e a utilização (C), uma experiência de curso do tempo de tratamento pegajoso-slides (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O gradiente de GA em raízes de Arabidopsis e escuro-crescido hipocótilo. Bidimensional de imagens do (A) nlsGPS1 e (C) nlsGPS1-NR raízes foram analisadas utilizando o software ImageJ e imagens tridimensionais de nlsGPS1 (B) e (D) nlsGPS1-NR foram analisadas usando um comercial tridimensional software de análise de imagem. Ambas as análises mostraram uma endógena GA₄ gradiente em raízes de Arabidopsis . Imagens bidimensionais de nlsGPS1 (E) e hypocotyl de escuro-crescido nlsGPS1-NR (G) foram analisadas utilizando o software ImageJ e imagens tridimensionais de nlsGPS1 (F) e (H) nlsGPS1-NR foram analisadas usando o software de análise de imagem tridimensional comercial. Ambas as análises mostraram uma endógena GA₄ gradiente no escuro-crescido hipocótilo. A barra LUT exibe a falsa coloração de taxas de emissão de nlsGPS1. Imagens YFP são relatadas como controles de expressão. Hypocotyl imagens foram adquiridas utilizando duas posições de estágio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O gradiente de GA exógeno em raízes. O primeiro show de dois painéis (A) bidimensional e (B) imagens tridimensionais de uma raiz de nlsGPS1 antes e 20 min após o tratamento de exógenos GA₄ (1 µM). Imagens YFP são relatadas como controles de expressão. A mostrar dois últimos painéis (C) a média e desvio-padrão e (D) enredo beeswarm e caixa de rácios de emissão nlsGPS1 para núcleos da zona de alongamento (a região que é definida com um quadro branco). Na zona de alongamento, a taxa de emissão de nlsGPS1 foi significativamente maior após o tratamento de₄ GA (teste de Mann-Whitney U, * * * P-valor < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video 1: experimento de perfusão de nlsGPS1 raiz usando pegajoso-slide. Este vídeo mostra imagens tridimensionais do nlsGPS1 perfundidos com MS ¼ líquido e tratados com 0.1 µM GA₄ por 30 min. No curso do tempo, imagem foi adquirida a cada 10 min para 3h com os seguintes intervalos: 30 min de solução simulada (frame t = 1, t = 2, t = 3), 30 min de tratamento de₄ GA (frame t = 4, t = 5, t = 6), 2 h de mock para lução (frame t = 7 para t = 18) solução. Antes da aquisição, a amostra foi perfundida com solução simulada por 2 h. por favor, clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Discussão

O nlsGPS1 de biosensor GA FRET-baseado fornece um método quantitativo para relatar e medir gradientes de hormônio de GA em plantas multicelulares. Biossensores baseados em FRET podem quantificar dinâmica com uma melhor resolução spatiotemporal sobre Deteção direta por espectrometria de massa e avaliação indirecta por repórteres transcricionais ou sinalização da proteína-degradação-métodos baseados em^{12, 13}. Imagem celular de alta resolução em diversos tipos de tecido pode produzir insights significativos sobre GA biologia e faísca novas hipóteses sobre a regulação e a função de acumulações de GA em um contexto multicelular. Por exemplo, monitoramento de alterações no biosensor nlsGPS1 em GA específico biossintética, catabólico e mutantes de transporte, bem como durante perturbações spatiotemporally induzidas, pode ser muito informativo para testar especificamente como gradientes GA são estabelecidos em a raiz e a raiz de endereço de célula respostas para gradientes de GA. O sensor pode ser usado em outras espécies de modelo e colheita para testar a conservação dos mecanismos que controlam o controle GA-mediada de germinação de sementes, alongamento celular e floração.

As etapas críticas a geração de imagens baseada em FRET do biosensor nlsGPS1 são que, 1) os pixels não devem ser saturados durante a análise quantitativa do FRET, 2) imagens parâmetros tais como "ganho de detector" devem ser mantidos constantes para a emissão do doador (DxDm) e aquisições de aceitador de emissão (DxAm), 3) linhas de nlsGPS1-NR de controle devem ser usadas para descartar artefatos e 4) as amostras devem estar preparadas para minimizar a deriva e focal-questões relacionadas. Além disso, as condições ambientais em que as amostras são cultivadas são importantes para controlar desde níveis GA são sensíveis às condições ambientais tais como luz de duração e intensidade da luz^{14,15,16 ,17}. Uma limitação fundamental deste tipo de análise é que uma alta relação sinal-ruído é necessária para a imagem latente devido ao aumento no ruído inerente ratiometric imagem. Assim, nlsGPS1 imagem não será útil para os tecidos e órgãos que não são passíveis de microscopia de fluorescência ratiometric usando proteínas fluorescentes ciana e amarelas — por exemplo, os tecidos mais profundos onde proteínas fluorescentes mal são detectadas. Por outro lado, ratiometric leituras são muitas vezes preferidas sobre leituras de intensiometric, porque um controle interno é útil para descartar artefatos decorrentes de alterações na expressão de biosensor, estabilidade, brilho ou detecção em uma determinada célula, tecido , ou condição. Por exemplo, FRET imagem biosensor e análises de imagem também têm sido usadas para estudar uma variedade de ligantes em uma variedade de tecidos^{5,6,18,19,20,}. Os experimentos de imagens e análises de imagem aqui relatadas podem ser modificadas para atender novos métodos de imagem, tais como a microscopia de folha de luz, que pode produzir novos insights em, por exemplo, mais profunda raiz-tipos de tecido.

O primeira geração nlsGPS1 biosensor é um sensor de alta afinidade que fornece um mapa de alta resolução de gradientes de GA que também pode relatar sobre aumentos intracelulares GA após tratamentos de GA exógenos. Uma das limitações atuais da nlsGPS1 é que o sensor não é rapidamente reversível e, assim, relatórios não em níveis de estado estacionário GA, mas, provavelmente, sobre a recente GA concentraçao na solução de interesse. A taxa de rotatividade precisos para o sensor é também não conhecido e isto, combinado com baixa reversibilidade, se opõe a deteção de depleções de GA endógenas que pode estar acontecendo dentro de um minutos para um pouco em alguns tipos de tecido. Também é importante observar que nlsGPS1 tem uma elevada afinidade para GA₄ (K_d = 24 nM) em comparação com outras formas de GA (GA₃ K_d= 240 nM, GA₁K_d = 110 nM) quando outro gás Bioativo ^{de imagem 7}. gerações de futuro de biosensores GA podem ser projetadas para aumentar a reversibilidade, mantendo alta afinidade ou apresentam especificidades diferentes para os diferentes precursor, Bioativo, ou catabolite gás. 

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107735
Gibberellin A4 (GA4)	Sigma	G7276	dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach)	Fisher S/5040	HSRA 064
Hydrogen cloride HCl	Sigma	31434
Micropore tape	3M	1530-1
ibidi sticky-slide	Ibidi	81128	Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide	Ibidi	80168	Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides	Ibidi	10812
Elbow Luer Connectors	Ibidi	10802
silicone tubing	Ibidi	108401
Luer Lock Connector	Ibidi	10826
programmable syringe pump	World Precision Instruments	AL-1000
Vacuum grease	Sigma	18405
Murashige and Skoog Basal Salts	Duchefa	M0221
Agar plant, 1 kg	Melford	P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick	Fisher Scientific	12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm	Fisher Scientific	12363138
Luer-slip Syringe 20 mL	Fisher Scientific	10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape	Fisher Scientific	12787597
Potassium Hydroxide, 500 g	Sigma Aldrich	221473-500G-D
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel	Scientific Laboratory Supplies	INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel	Fisher Scientific	12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6	Ibidi	10829
Leica SP8			Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780			Confocal laser microscope 2
Imaris	Bitplane		3D visualization and Analysis software
Fiji			image analysis software
OriginPro	Origin Lab		Statistical Analysis Software