Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Resumo

Este protocolo destina-se a avaliar a citotoxicidade de células T (células T carro) imunoterapia redirecionada contra células cancerosas estruturadas 3D (esferoides) em tempo real.

Resumo

Imunoterapia tornou-se um campo de crescente interesse na luta contra o câncer caso contrário intratável. Entre todos os métodos de imunoterapia, receptor de antígeno Quimérico (carro) Redirecionado células T obtidas os resultados mais espetaculares, em particular com leucemia linfoblástica aguda-B Pediátrica (B-ALL). Métodos de validação clássica de células T do carro dependem o uso de especificidade e de ensaios de funcionalidade das células T de carro contra células alvo em suspensão e em modelos de enxerto. Infelizmente, as observações feitas in vitro são muitas vezes dissociadas do resultados obtidos na vivo e um monte de esforço e animais poderia ser poupado, adicionando mais um passo: o uso da cultura 3D. A produção de esferoides de potencial nas células-alvo que imitam a estrutura 3D das células do tumor, quando eles são incorporados no modelo animal representa uma alternativa ideal. Aqui, nós relatamos um método acessível, confiável e fácil de produzir esferoides de uma linha celular colorretal transduzidas como uma ferramenta de validação para a terapia celular adotiva (exemplificada aqui por pilhas de T de carro CD19). Este método é acoplado com um avançado sistema de geração de imagens ao vivo que pode acompanhar o crescimento de esferoide, efetoras células citotoxicidade e tumor apoptosis da pilha.

Introdução

Transferência de células adotivos (ACT) representa o tratamento de câncer na próxima geração. Ele conta com a injeção de células efetoras (células T ou NK) em um paciente. Estas células podem ser geneticamente modificadas com um receptor que irá guiá-los até seu alvo, o tumor e destruí-lo. Recentemente, esta abordagem foi mostrada para ser viável quando um Receptor de antígeno Quimérico (carro) dirigido contra o marcador de célula B CD19 foi introduzido nas células do paciente T matar seu câncer¹. No caso do carro, que é um receptor artificial, o projeto consiste em fragmentos de anticorpos específicos, o antigénio vinculativa domínio reduzido a um fragmento de variável entidade designada de cadeia única (scFv), ligada aos domínios de sinalização de células T. Embora haja vários designs, as versões mais comumente usadas referidos como segunda geração desenhos dos carros, consistem de CD3z para sinalização de TCR e um domínio co-estimulatória (CD28, 4-1BB, OX40, etc.) ^{1 , 2}. o campo da imunoterapia dirigido a maioria de sua atenção para esta nova forma do acto quando células CD19 carro-T eficazmente trataram numerosos pacientes com neoplasias malignas de células B^3,4. Após este sucesso, os pesquisadores tentaram explorar os projetos similares ao direcionamento outros resumos para tumores sólidos com sucesso limitado. Infelizmente, a escassez de antígenos específicos do tumor e o microambiente que tumor mais duras processado carro T células menos eficaz para tumores sólidos⁵.

Atualmente, as estratégias mais comumente usados em vitro validação dependem bidimensionais (2D) sistemas que abordam apenas um fragmento dos desafios já mencionado tumor sólido. Classicamente, 2D em vitro sistemas envolvem uma mistura de células T de carro e linhas de células de câncer de alvo como monocamadas para avaliar a funcionalidade e a especificidade dessas células efetoras. Embora estas estratégias são peças importantes e vitais dos estudos, eles não levam em consideração a morfologia complexa e os estrutura tridimensional (3D) do câncer células⁶. As células cancerosas, cultivadas em sistemas 3D, conhecido como esferoides, adquirem novas características fenotípicas através de alterações no gene expressão perfil⁷, que possam influenciar o reconhecimento pelas células efetoras redirecionada. Birgersdotter e colegas demonstraram que uma linhagem de células Hodgkin Linfoma (HL) quando só cresceu em um modelo 3D da cultura adquire um perfil de expressão do gene que é semelhante ao tumor primário amostras⁸. Portanto, esferoides ou 3D semelhante cultura oferta de metodologias mais relevante em modelos de vitro em oposição aos sistemas 2D padrão. Tais sistemas são também semelhantes aos estudos in vivo, que são vistos como a etapa final no processo de validação de um determinado carro. Considerando que os sistemas 2D não imitar a morfologia de clusters de câncer, esferoides oferecem formações similares para avaliar a funcionalidade das células T de carro antes de modelos in vivo. Em um estudo, Pickl et al identificaram que um modelo de esferoide do receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) superexpressão células cancerosas demonstrado perfis de sinalização semelhantes a modelos in vivo⁹. Isto suporta mais que esferoides oferecem mais relevantes e close-para-na avaliação de vivo das células T de carro. Além disso, validação de células T carro contra esferoides pode ajudar a avaliar sua eficácia mais criticamente e impedir que alguns dos projetos movendo-se prematuramente para estudos in vivo¹⁰; contribuindo assim, para pesquisas eticamente preocupada sacrificando menos animais. Além disso, protocolos utilizando esferoides não são mais caros do que os sistemas 2D clássicos e muito mais rápido em comparação com estudos clássicos na vivo . Tomados em conjunto, pode-se prever que a inclusão de estudos esferoide em breve se tornará uma prática padrão para vincular estudos in vitro e in vivo.

Aqui, apresentamos a preparação de esferoides da linhagem de células de câncer de cólon HCT 116. Esta linha de celular foi modificada para expressar a molécula CD19 humana para torná-lo sensível às células CD19 carro T e para fornecer uma avaliação clara da matança usando uma construção de carro clinicamente validada.

Protocolo

1. geração de esferoides de linhagem de células de câncer colorretal

1. Monocamadas de células lavar HCT 116 (estàvel transfectadas para expressar o Cluster de diferenciação 19 (CD19) e proteína de fluorescência verde (GFP)) com fosfato tampão salino (PBS; 5 mL por uma de 25 cm² ou 10 mL para um balão de² de 75 cm). Adicionar a tripsina (0,5 mL por uma de 25 cm² ou 1 mL para um balão de² de 75 cm) e incube as células a 37 ° C por 5 min.
2. Verificar o desprendimento de células sob um microscópio e neutralizar a enzima de dissociação celular com meio de Roswell Park Memorial Institute 160 completo (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL por uma de 25 cm² ou 20 mL para um balão de² de 75 cm).
3. Suspensão de células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender pipetando para cima e para baixo várias vezes com 5 mL de meio de 1640 RPM1 completo.
4. Contar as células usando Trypan azul exclusão em um contador de célula compatível.
5. Suspensão de células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender em meio RPMI para obter 5 x 10³ células/mL.
6. A suspensão de células de transferência para um reservatório estéril e dispense a 200 µ l/poço em 96-poço redondo fundo placas usando uma pipeta multicanal.
7. Transfira a placa para o aparelho automatizado de imagens dentro de uma incubadora (37 ° C, 5% de CO₂, 95% de umidade).
8. Logar o software de aquisição, selecione Agenda para adquirir | Lançamento adicionar navio | Digitalização na programação | Criar o navio: nova.
9. Selecione tipo de digitalização: esferoide. Selecionar os canais de interesse: fase + Brightfield (para acompanhar o crescimento de esferoides), verde (para que siga o sinal de tumor, aquisição tempo 300 ms) e vermelho (para seguir a apoptose, aquisição tempo 400 ms).
   1. Selecione a desejada ampliação: 10x.
   2. Escolha o modelo da placa e a sua posição na gaveta. Selecione a posição dos poços para a imagem. Digite a descrição do experimento: nome, tipo de células, o número de células.
10. Para a instalação de análise, selecione Adiar análise até mais tarde. Clique com o botão direito na linha do tempo e selecione a opção Definir selecionado varredura intervalo do grupo e defina Adicionar varreduras cada a 4 h e para um total de 24 h. definir a data inicial desejada (pelo menos 1 h após a incubação no aparelho automatizado de imagens).
11. Verifique a cada 2 dias para o crescimento de esferoides fazendo o login no software da imagem latente.
    1. Escolher a opção View recentes Scans e clique duas vezes sobre a experiência desejada. Selecione Brightfield no painel de canais de imagem e em seguida, use a ferramenta de características imagem de medida para medir o diâmetro dos esferoides. Demora 6 dias para um esferoide atingir o tamanho desejado: 0,5 mm de diâmetro. Adicione 50 µ l de meio RPMI completo por alvéolo no dia 4 para limitar o efeito de evaporação média.

2. geração de células T de carro CD19

1. Expansão de células T de carro CD19
   Nota: Expressao de células CD19 carro T foi adquirido pela transdução de retroviral em massa do dador saudável PBMCs como descrito anteriormente,¹⁶. A codificação de construção retroviral para CD19 carro é um carro de segunda geração e consiste de fmc63 cadeia de scFv, dobradiça de CD8 e domínio transmembrana, um domínio co-estimulatória 4-1BB e, finalmente, um domínio CD3ζ.
   1. Para expandir, cultura a transduzidas T células na presença de grânulos magnéticos anti-CD3/28 com uma célula a relação do grânulo de 1:1 por 10 a 11 dias. Durante a expansão, as células são no meio completo (VIVO X 15, 5% reposição de soro e IL-2 humana recombinante de 100 U/mL).
      Nota: A densidade ideal para uma expansão eficiente é de 1 a 2 x 10⁶ células/mL. Dependendo do número inicial, as células podem ser expandidas em balões (balões de 25 cm² a 20 mL, frascos de 75 cm² a 40 mL de volume total) em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% de CO₂, 95% de umidade).
   2. Como um grupo de controle negativo para os seguintes ensaios, incluem não-transfectadas PBMCs (irá ser chamado Mock) do protocolo de expansão paralela às células CD19 carro T.
   3. No dia 3 em diante, adicionar meio fresco todos os dias e dividir as células em frascos de cultura mais se necessário.
   4. No dia 10-11, células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e combinar todas as células em um tubo de 50 mL e ressuspender as células em ~ 30 mL de mídia completa fresca.
   5. Coloca o tubo de 50 mL contendo as células ressuspensa num suporte magnético para separar as esferas magnéticas do meio de cultura.
   6. Espere 2-3 min para os grânulos coletar na lateral do tubo.
   7. Remova o meio de cultura com uma pipeta e transferência para um novo tubo sem tocar as zonas de coleção magnética do grânulo.
   8. Repita os passos sobre a remoção do grânulo (2.1.5–2.1.7) mais uma vez para limitar o número de grânulos em meio de cultura final.
   9. Resuspenda e contar as células, ajustar a densidade de 1 a 2 x 10⁶ células/mL em meio completo.
   10. Descanse as células pelo menos 4 h até durante a noite. Então diretamente congelá-los para baixo a-80 ° C e transferir os frascos para um tanque de nitrogênio líquido, no dia seguinte para armazenamento a longo prazo. Alternativamente, um pode prolongar o resto até durante a noite para uso imediato.
2. Controle de expressão de CD19 carro na primárias células T
   1. Conte o número de pilhas de T expandidos como os números podem variar ligeiramente depois de cultura durante a noite ou moderadamente congelamento/descongelamento.
   2. Transferência de 5 x 10⁵ células de ambos os carro CD19 e Mock as células T primárias para separar os tubos de citometria de fluxo.
   3. Lavar as células com 200 μL de tampão de fluxo (2% FBS em PBS) e centrifugar os tubos a 500 x g durante 5 min. Repita as etapas de lavagem para se livrar de qualquer artefatos causados por meio de cultura.
   4. Prepare o anticorpo primário (biotina cabra anti-Mouse IgG, F(ab') ₂ fragmento específico), realizando a diluição de 1: 200 em Buffer de fluxo.
   5. Ressuspender as células em 100 μL de mistura de anticorpos pelo tubo e incubar no gelo por 15 min. Repita a etapa anterior de lavar duas vezes para remover o excesso anticorpo.
   6. Prepare o anticorpo secundário (Streptavidin-PE) como a diluição de 1: 400 em Buffer de fluxo.
   7. Ressuspender as células em 100 μL de mistura de anticorpos pelo tubo e incubar no gelo por 15 min. Repita a etapa anterior de lavar duas vezes para se livrar de anticorpo em excesso.
   8. Ressuspender as células em 200 μL de tampão de fluxo por tubo e analisá-lo em um citômetro de fluxo.
   9. As pilhas de T zombar de uso para montar o portal positivo e negativo e analisar carro CD19 transfectadas células T em conformidade.

3. 3D Tumor Spheroid matar ensaio

1. Depois de 6 dias ou uma vez esferoides atingir o tamanho desejado, retirar a placa da incubadora. Usando uma pipeta multicanal, delicadamente retire 100 µ l/poço de meio completo RMPI 1640 as chapas de esferoide.
   1. Para esta etapa, as dicas para o interior do ângulo parede da placa de 96 poços, evitando o contato com o fundo do poço para minimizar a perturbação dos esferoides. Permanecendo o volume deve ser em torno de 100 µ l.
2. Prepare uma solução de 1: 200 de anexina V vermelho misturando-se 50 µ l de anexina V vermelho com 9,95 mL de meio RPMI 1640 completo.
3. Adicione 100 µ l/poço da 1: 200 solução anexina V vermelho.
4. Transfira a placa para uma incubadora (37° C, 5% de CO₂, 95% de umidade) por 15 min.
5. As células T de carro CD19 transduzidas em um tubo de 15 mL e centrífuga-los a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender pipetando para cima e para baixo várias vezes com 2 mL de meio de 1640 RPM1 completo da colheita.
6. Contar as células usando Trypan azul exclusão em um contador de célula compatível.
7. Suspensão de células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender em meio RPMI para obter 2 x 10⁵ células/mL.
8. A suspensão de células de transferência para um reservatório estéril e dispense 100 µ l/poço em 96-poço redondo placa de esferoide inferior usando uma pipeta multicanal.
9. Transferi a placa de volta para o aparelho automatizado de imagens dentro de uma incubadora (37 ° C, 5% de CO₂, 95% de umidade).
10. Logar o software de aquisição, selecione Agenda para adquirir.
    1. Botão direito do mouse na linha da tempo de varredura e selecione Editar linha do tempo. Botão direito do mouse sobre o grupo de verificação e excluí-lo. Botão direito do mouse na linha do tempo e selecione a opção Definir selecionado varredura intervalo do grupo e defina Adicionar varreduras cada de 1,5 h e para um total de 24 h.
    2. Defina o tempo de partida desejado (pelo menos 1 h após a incubação no aparelho automatizado de imagens). Selecione salvar agenda varreduras.

4. análise de imagem automatizado

1. Entrar em aquisição, escolha a opção View recentes Scans e selecione a opção Iniciar análise . Selecione criar nova definição de análise | Tipo de análise: Spheroid. Assinale os canais de imagem para analisar (fase + Brightfield, verde e vermelho).
2. Selecione pelo menos 10 imagens representativas: normalmente, 1 por Estado e pelo menos 3 pontos de tempo (início, meio e fim da aquisição).
3. Visualização padrão analisar procedimento na pilha toda a imagem.
4. Modifica os parâmetros para brightfield máscara. Parâmetros típicos são: sensibilidade 10, buraco preencher 1.000 µm², min área 1.000 µm². Pré-visualize na pilha toda a imagem e verifique que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.
5. Modifica os parâmetros para máscara verde (GFP). Parâmetros típicos são: segmentação de Cartola com raio 200 µm e limiar 3 tos, borda cindido, buraco preencher 5.000 µm², ajustar tamanho -2 pixels, área min 3.000 µm². Pré-visualize na pilha toda a imagem e verifique que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.
6. Modifica os parâmetros para máscara vermelha (anexina V). Parâmetros típicos são: segmentação de Cartola com raio 150 µm e limiar 2 CDU, borda cindido, buraco preencher 5.000 µm², ajustar tamanho 0 pixels, área min 1.000 µm². Pré-visualize na pilha toda a imagem e verifique que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.
7. Lançamento do analisador.
   1. Uma vez que a análise é feita, extrair a medição de interesse. Selecione o arquivo analisado e, em seguida, a opção Gráfico métricas . Selecione as métricas de interesse, a verificação e o poço. Normalmente, intensidade total de vermelha e verde dentro dos limites do brightfield dar as medições mais precisas, restringindo o sinal de fluorescência para os limites de esferoides determinado pela máscara brightfield (Figura 3). Extrair métricas selecionadas em vários formato de arquivo, clicando em "Export Data".
8. Proceder à extração das imagens e filmes, selecionando o arquivo analisado e em seguida, selecione a opção exportar imagens e filmes . Duas opções estão disponíveis, ou "conforme exibido" para recuperar imagens e filmes como visto sobre o software de imagem (imagens geralmente compostas), ou "como armazenado" para recuperar os dados brutos para análise externa através do software de terceira parte.

Resultados

Como pode ser visto na Figura 1, é fundamental verificar por citometria de fluxo, o nível de expressão de CD19 carro em células T (figura 1A) e o nível de CD19 em linhas de células de tumor HCT116 (figura 1B). A Figura 2 exemplifica o resultado de um experimento típico esferoide. Automatizada de imagem aparelho tira fotos em quatro diferentes canais: campo claro, ...

Discussão

O uso de esferoides como uma ferramenta inovadora para validar o tratamento do câncer futuro tornou-se um campo de interesse crescente nos últimos anos. Esferoides representam uma etapa intermediária entre o clássico 2D análise in vitro e in vivo-avaliação. O método ainda detém muita promessa em relação a sua potência em termos de tumor micro-ambiente imitando assim como gene de perfil⁷. O protocolo apresentado nesta publicação foi adaptado de Saheen et al.^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience