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Method Article
Este protocolo destina-se a avaliar a citotoxicidade de células T (células T carro) imunoterapia redirecionada contra células cancerosas estruturadas 3D (esferoides) em tempo real.
Imunoterapia tornou-se um campo de crescente interesse na luta contra o câncer caso contrário intratável. Entre todos os métodos de imunoterapia, receptor de antígeno Quimérico (carro) Redirecionado células T obtidas os resultados mais espetaculares, em particular com leucemia linfoblástica aguda-B Pediátrica (B-ALL). Métodos de validação clássica de células T do carro dependem o uso de especificidade e de ensaios de funcionalidade das células T de carro contra células alvo em suspensão e em modelos de enxerto. Infelizmente, as observações feitas in vitro são muitas vezes dissociadas do resultados obtidos na vivo e um monte de esforço e animais poderia ser poupado, adicionando mais um passo: o uso da cultura 3D. A produção de esferoides de potencial nas células-alvo que imitam a estrutura 3D das células do tumor, quando eles são incorporados no modelo animal representa uma alternativa ideal. Aqui, nós relatamos um método acessível, confiável e fácil de produzir esferoides de uma linha celular colorretal transduzidas como uma ferramenta de validação para a terapia celular adotiva (exemplificada aqui por pilhas de T de carro CD19). Este método é acoplado com um avançado sistema de geração de imagens ao vivo que pode acompanhar o crescimento de esferoide, efetoras células citotoxicidade e tumor apoptosis da pilha.
Transferência de células adotivos (ACT) representa o tratamento de câncer na próxima geração. Ele conta com a injeção de células efetoras (células T ou NK) em um paciente. Estas células podem ser geneticamente modificadas com um receptor que irá guiá-los até seu alvo, o tumor e destruí-lo. Recentemente, esta abordagem foi mostrada para ser viável quando um Receptor de antígeno Quimérico (carro) dirigido contra o marcador de célula B CD19 foi introduzido nas células do paciente T matar seu câncer1. No caso do carro, que é um receptor artificial, o projeto consiste em fragmentos de anticorpos específicos, o antigénio vinculativa domínio reduzido a um fragmento de variável entidade designada de cadeia única (scFv), ligada aos domínios de sinalização de células T. Embora haja vários designs, as versões mais comumente usadas referidos como segunda geração desenhos dos carros, consistem de CD3z para sinalização de TCR e um domínio co-estimulatória (CD28, 4-1BB, OX40, etc.) 1 , 2. o campo da imunoterapia dirigido a maioria de sua atenção para esta nova forma do acto quando células CD19 carro-T eficazmente trataram numerosos pacientes com neoplasias malignas de células B3,4. Após este sucesso, os pesquisadores tentaram explorar os projetos similares ao direcionamento outros resumos para tumores sólidos com sucesso limitado. Infelizmente, a escassez de antígenos específicos do tumor e o microambiente que tumor mais duras processado carro T células menos eficaz para tumores sólidos5.
Atualmente, as estratégias mais comumente usados em vitro validação dependem bidimensionais (2D) sistemas que abordam apenas um fragmento dos desafios já mencionado tumor sólido. Classicamente, 2D em vitro sistemas envolvem uma mistura de células T de carro e linhas de células de câncer de alvo como monocamadas para avaliar a funcionalidade e a especificidade dessas células efetoras. Embora estas estratégias são peças importantes e vitais dos estudos, eles não levam em consideração a morfologia complexa e os estrutura tridimensional (3D) do câncer células6. As células cancerosas, cultivadas em sistemas 3D, conhecido como esferoides, adquirem novas características fenotípicas através de alterações no gene expressão perfil7, que possam influenciar o reconhecimento pelas células efetoras redirecionada. Birgersdotter e colegas demonstraram que uma linhagem de células Hodgkin Linfoma (HL) quando só cresceu em um modelo 3D da cultura adquire um perfil de expressão do gene que é semelhante ao tumor primário amostras8. Portanto, esferoides ou 3D semelhante cultura oferta de metodologias mais relevante em modelos de vitro em oposição aos sistemas 2D padrão. Tais sistemas são também semelhantes aos estudos in vivo, que são vistos como a etapa final no processo de validação de um determinado carro. Considerando que os sistemas 2D não imitar a morfologia de clusters de câncer, esferoides oferecem formações similares para avaliar a funcionalidade das células T de carro antes de modelos in vivo. Em um estudo, Pickl et al identificaram que um modelo de esferoide do receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) superexpressão células cancerosas demonstrado perfis de sinalização semelhantes a modelos in vivo9. Isto suporta mais que esferoides oferecem mais relevantes e close-para-na avaliação de vivo das células T de carro. Além disso, validação de células T carro contra esferoides pode ajudar a avaliar sua eficácia mais criticamente e impedir que alguns dos projetos movendo-se prematuramente para estudos in vivo10; contribuindo assim, para pesquisas eticamente preocupada sacrificando menos animais. Além disso, protocolos utilizando esferoides não são mais caros do que os sistemas 2D clássicos e muito mais rápido em comparação com estudos clássicos na vivo . Tomados em conjunto, pode-se prever que a inclusão de estudos esferoide em breve se tornará uma prática padrão para vincular estudos in vitro e in vivo.
Aqui, apresentamos a preparação de esferoides da linhagem de células de câncer de cólon HCT 116. Esta linha de celular foi modificada para expressar a molécula CD19 humana para torná-lo sensível às células CD19 carro T e para fornecer uma avaliação clara da matança usando uma construção de carro clinicamente validada.
1. geração de esferoides de linhagem de células de câncer colorretal
2. geração de células T de carro CD19
3. 3D Tumor Spheroid matar ensaio
4. análise de imagem automatizado
Como pode ser visto na Figura 1, é fundamental verificar por citometria de fluxo, o nível de expressão de CD19 carro em células T (figura 1A) e o nível de CD19 em linhas de células de tumor HCT116 (figura 1B). A Figura 2 exemplifica o resultado de um experimento típico esferoide. Automatizada de imagem aparelho tira fotos em quatro diferentes canais: campo claro, ...
O uso de esferoides como uma ferramenta inovadora para validar o tratamento do câncer futuro tornou-se um campo de interesse crescente nos últimos anos. Esferoides representam uma etapa intermediária entre o clássico 2D análise in vitro e in vivo-avaliação. O método ainda detém muita promessa em relação a sua potência em termos de tumor micro-ambiente imitando assim como gene de perfil7. O protocolo apresentado nesta publicação foi adaptado de Saheen et al....
Os autores não têm nada para divulgar.
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa norueguês sob concessões #244388, #254817 e #284983; a sociedade de câncer norueguês (#6829007); A região de saúde norueguês sudeste sob Grant #17/00264-6 e #2016006.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |
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