Incentivo e avaliação de um modelo murino de miopia Experimental

Resumo

Neste protocolo, descrevemos o processo completo de miopia experimental incentivo nos ratos usando recém-projetado óculos e a técnica necessários para alcançar resultados estáveis e reprodutíveis em medições de parâmetro ocular.

Resumo

Modelo murino de miopia pode ser uma ferramenta poderosa para a investigação de miopia por causa da manipulação genética comparativamente fácil. Uma maneira de induzir a miopia em animais é colocar claro menos lentes na frente dos olhos por semanas (miopia induzida pela lente, LIM). No entanto, os protocolos existentes de incentivo e de avaliação variam de laboratório para laboratório. Aqui, descrevemos um método altamente prático e reprodutível para induzir óculos LIM em ratos usando recentemente projetado. As correções de método a lente estàvel na frente do olho de rato, enquanto permite que a lente a ser retirado para limpeza ou tópica de administração de drogas. O fenótipo é robusta e eficiente, e a variação é pequena. O método descrito aqui pode ser aplicado aos ratos logo após o desmame que se estende a duração possível para experimentos. Nós também demos técnico aconselha para alcançar resultados reprodutíveis em refração e medições de comprimento axial. Esperamos que o protocolo passo a passo descrito aqui e o artigo detalhado pode ajudar os pesquisadores a realizar experimentos de miopia com miopia mais suave e tornar os dados comparáveis entre laboratórios.

Introdução

A prevalência de miopia aumentou dramaticamente recentemente, enquanto o mecanismo de seu aparecimento e progressão são ainda em grande parte desconhecido¹. O fenótipo mais característico da miopia é o alongamento do comprimento axial (AL), que aumenta o risco de complicações na retina ou mesmo cegueira². Para melhor compreender a patogênese da miopia e desenvolver tratamentos eficazes, modelos animais míopes robustos e estável fenótipo avaliação são necessárias.

Brevemente, existem dois métodos para induzir Estados míopes em animais: formulário-privação miopia (FDM) e miopia induzida pela lente (LIM)³. O primeiro coloca os difusores na frente do olho ou sutura da pálpebra para obscurecer a imagem, o que influencia o desenvolvimento normal do globo ocular, resultando em um fenótipo de miopia. Os últimos lugares menos lentes na frente do olho para mover o ponto de foco atrás da retina. A retina detecta a mudança do foco e alonga o globo ocular para realinhar a retina e o ponto focal. Para FDM, depois que a pálpebra está fechada ou o difusor foi corrigido na frente do olho, quase nenhuma manutenção adicional é necessária. Para LIM, a lente precisa ser retirado para limpeza a fim de mantê-lo transparente. Assim, o FDM é relativamente fácil de ser induzido tecnicamente. No entanto, os mecanismos de FDM e LIM são diferentes, e qual método imita a miopia em humanos é melhor ainda em debate³. Um dos pontos fortes de LIM é o fenótipo mais forte comparado com FDM, pelo menos no caso de ratos⁴.

Animais que foram usados para indução de miopia incluem filhotes⁵macacos⁶, árvore shrews⁷, cobaias⁸e ratos⁴. Considerando a possibilidade de manipulação genética, anticorpos disponíveis abundantes e baixo custo para reprodução, ratos poderiam ter sido a primeira escolha como o modelo animal de miopia. No entanto, em comparação com outros animais maiores, fixação lentes ou difusores na frente do olho do rato é relativamente difícil, especialmente para jovens ratos como direito após o desmame. Para os experimentos que precisam de administração tópica da droga ou várias medições provisórias de olho, também é necessário o quadro a ser removível. Outro desafio é a pequena alteração morfológica do globo ocular do mouse, que precisa de técnicas sofisticadas e dispositivos para avaliar. Até à data, induzindo diferentes e protocolos usados em equipas de investigação diferentes de medição tornam difícil comparar e repetir os resultados através de laboratórios. É necessário um protocolo padrão com detalhes.

Trabalhos anteriores descreveram vários métodos para corrigir as lentes ou difusores na frente do olho de rato, tais como a colagem de⁹,¹⁰ e capacetes goggle quadro^11,12de costura. Nós combinamos a exist capacetes goggle técnicas^11,12,13 com nosso quadro recentemente projetado para desenvolver um protocolo melhorou para induzir robusta e eficiente de miopia experimental em ratos. O protocolo pode ser aplicado aos ratos jovens logo após o desmame no pós-Natal dia 21 (p21). Nós também Aperfeiçoamos os processos de avaliação estável e precisa de fenótipos incluindo a refração e AL. Esperamos que este protocolo padronizado pode ajudar a tornar ratos míopes um modelo mais facilmente acessível para a pesquisa de miopia.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética em pesquisa Animal de Keio University School of Medicine aderiu à instrução ARVO para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research, as orientações institucionais sobre experimentação Animal na Keio Universidade e a pesquisa Animal: relatórios no Vivo experimentos (chegada) orientações para o uso de animais na investigação.

1. montar os óculos para ratos

1. Prepare peças para montagem de óculos (Figura 1a). Para cada rato, preparar todos os followings: nylon capacetes um stick, um superior e um titânio inferior do quadro, duas lentes com poderes adequados, de acordo com a finalidade do experimento, um parafuso de tamanho M1.4 com o comprimento de 10 mm, uma porca de parafuso de tamanho M1.4, uma planície arruela para parafuso de tamanho M1.4 com a espessura de 0,3 mm e duas pontas de unha artificial (Tabela de materiais).
   Nota: Os dois tipos de quadros existem com diferentes alturas. Para um mouse, um quadro superior e um inferior do quadro são usados como um conjunto. Quadros superiores devem ser colocados acima inferiores para tornar os campos de visão simétrica. Armações e lentes são especialmente desenvolvidas e fabricadas pelo grupo de pesquisa dos autores. Estes estão disponíveis em contato com os autores correspondentes do presente artigo. Outras partes podem ser encontrados em lojas de varejo de ferramenta.
2. Monte o quadro para o olho direito e esquerdo separadamente.
   1. Organize a ponta da unha para enfrentar a direção exterior para obter o melhor efeito protetor. Ajuste o ângulo entre a ponta da unha e o quadro a ser cerca de 130° para evitar o mascaramento do campo de visão do rato (Figura 1b). Aderir as dicas de unha artificial para o quadro com cola de cianoacrilato.
      Nota: Dicas de unha podem ajudar a proteger a lente de ser arranhado pelo mouse. A direção das dicas de unha deve ser oposta como quadro superior e parte inferior do quadro são usadas para o olho direito e olho esquerdo, respectivamente.
   2. Espere pelo menos 12 h deixar a cola secar completamente, em seguida, use um cortador de unhas para ajustar a forma da ponta da unha dicas para ser cerca de 1 cm × 1 cm cortando e aparando.
   3. Aderir a lente para o quadro com cola de cianoacrilato. Coloque a lente sobre a armação com a mão e segurar o quadro horizontalmente. Injetar o adesivo de cianoacrilato da borda da lente e deixe a adesiva propagação por tensão superficial.
      Nota: O adesivo vai corroer a lente e influenciar a sua transparência, então certifique-se que o adesivo só toca a parte periférica da lente. Use lente de plano 0 dioptria (D) como controle e menos lente para induzir a miopia. O efeito das diferentes potências de menos lentes (–10 D a –50 D) tem sido descrito em outra parte⁴. Para maximizar o estímulo de miopia, lente – 30 D é recomendado para a indução de miopia. FDM pode também ser induzida com o mesmo dispositivo simplesmente alterando a lente na tampa do microtubo de 1,5 mL como o difusor.
3. Aperte o parafuso para a vara de nylon junto com a máquina de lavar do lado liso da vara. Prepare os óculos e varas antes do experimento respectivamente e o estoque para a nova utilização (Figura 1C).
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. medições da refração e da linha de base do AL.

1. Aplique uma gota de agente midriático contendo 5 mg/mL tropicamida e cloridrato de fenilefrina 5 mg/mL em cada lado do globo ocular para dilatar a pupila. Espere pelo menos 5 minutos antes da anestesia geral.
   Nota: Dilatar a pupila em geral anestesia irá causar catarata reversível que influencia a medição depois. Sempre dilatar a pupila antes de anestesia geral e espere pelo menos 5 min. Uma gota (cerca de 0,05 mL) do agente midriático é suficiente para dilatar a pupila do olho do rato, enquanto agente mais fará nenhum mal para as etapas seguintes.
2. Colocar o rato sob anestesia geral. Segure a pele traseira do mouse suavemente para impedir que o mouse batendo seu olho até que ele é completamente anestesiado. Julga a profundidade da anestesia geral será suficiente se o mouse não se move em torno de quando ela é colocada na mesa livremente.
   Nota: Uma combinação de midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartarato de butorfanol (50 μg/100 μL) é usada aqui para anestesia geral para ratos com um volume de injeção intraperitoneal de 0,01 mL/g. Geralmente, menos de 5 min são necessários para os ratos de cair no sono. Tempo de anestesia geral faz com que a baixa temperatura corporal e batimento cardíaco lento. É recomendado evitar a potencial influência da anestesia geral para a medição, terminando todas as medições dentro de 10 min após a injeção do anestésico. O butorfanol fornecido no coquetel de anestésicos fornecem cerca de 4 horas de analgesia. Receita adequada para anestesia geral pode diferentes pelas instituições.
3. Medir a refração do olho do rato usando um infravermelho photorefractor^4,9,14. Ajuste a direção de um dos olhos para manter a primeira imagem de Purkinje no centro da pupila e medir a refração ao longo do eixo óptico do mouse. Após a medição, medir o olho oposto com os mesmos procedimentos (Figura 2a).
   Nota: O valor medido para a refração é fortemente influenciado pela posição do olho do rato ao longo do eixo óptico. Certifique-se que a primeira imagem de Purkinje é alinhada dentro de ± 3 graus no centro da pupila. A bancada de trabalho do sistema de tomografia computadorizada (SD-OCT) domínio espectral coerência óptica pode ser utilizada para o ajuste fino da direção da pupila em refração medidas⁴.
4. Medir o AL do olho do rato usando um SD-OCT sistema^4,15,16. Defina o AL como a distância entre o vértice da córnea para o limite mais brilhante perto do nervo óptico (Figura 2b).
   Nota: Similar com a medição de refração, o AL é fortemente influenciado pela direção do olho do rato. O vértice da córnea pode ser confirmado pela reflexão como um ponto na superfície da córnea. A fronteira do lado da retina será muito nebulosa no ponto do nervo óptico. Ajuste a direção um pouco para deixar o limite a ser suficientemente claro para medir, mas não muito longe do nervo óptico.

3. fixação do quadro para o crânio do Mouse.

1. Aplique uma gota de 0.1% purificada de sódio hyaluronate colírio para evitar ressecamento em cada olho.
   Nota: Colírio na superfície do olho irá influenciar os valores de refração e medições de comprimento axial. Não use o colírio após a anestesia, até que todas as medições são feitas.
2. Coloque o queixo do mouse anestesiado em uma inclinação feita de barro ou alguma coisa pode ser usada como uma almofada para fazer o avião adiantado do crânio ser horizontal.
3. Esterilizar o cabelo e couro cabeludo entre as orelhas e olhos usando cotonete com etanol a 70%.
4. Corte a pele entre as orelhas e olhos para expor o crânio para cerca de 0,8 cm² usando uma pinça e tesoura cirúrgica. Uso odontológico gravura líquido e algodão cotonete para remover o periósteo. Esterilize a tesoura cirúrgica e pinças com etanol a 70% antes da cirurgia de cada rato.
   Nota: Corte o cabelo e usar luvas estéreis podem ser necessárias.  Verifique se as disposições da Comissão de cuidados com animais relevantes antes deste procedimento. Na maioria dos casos, o líquido de gravura dental pode ser encontrado como um dos acessórios do sistema adesivo dental de auto-cura. Se o líquido de gravura dental não estiver disponível, use etanol a 70%.
5. Monte um conjunto de quadros sem lente para ajudar a corrigir a vara na posição certa. Coloque a cabeça de rato, os quadros. Ajuste cuidadosamente a posição dos quadros para certificar-se de que ambos os olhos estão no meio do quadro vazio.
6. Use um sistema adesivo dental de auto-cura para anexar a vara sobre a cabeça de rato. Tenha cuidado para não deixar o líquido do fluxo de sistema de aderência aos olhos do rato.
   Nota: O método para usar o sistema adesivo dental de auto-cura é diferente entre produtos. Consulte as instruções cuidadosamente.
   Atenção: Alguns dos reagentes no sistema adesivo dental podem ser tóxicos.
7. Esperar por cerca de 5 min e tire o quadro e a porca cuidadosamente sem alterar a posição da vara (Figura 3a).
8. Injete 0,75 mg/kg de cloridrato de atipamezole intraperitonealmente para ajudar o rato a recuperação da anestesia mais rapidamente. Coloque o mouse em uma gaiola individual até totalmente recuperado. Não deixe o mouse sem vigilância até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. O protocolo pode ser pausado aqui.

4. início da indução de miopia e manutenção depois

1. Aguardar pelo menos 24 h após a cirurgia para deixar o mouse recuperar totalmente da anestesia. Segure a vara e colocar os quadros com as lentes. O incentivo começa neste ponto do tempo (Figura 3b).
   Nota: Para minimizar o desconforto durante a recuperação da anestesia e dar tempo suficiente para que o sistema adesivo dental coagular, é altamente recomendável para colocar no quadro, depois que os ratos totalmente recuperaram da anestesia. O cimento de resina do sistema adesivo cobrirá totalmente o corte do couro cabeludo. Portanto, nenhum tratamento pós-cirúrgico específico é necessária para prevenir a infecção e atenuar a dor pós-cirúrgica. Logo após a primeira vez de colocar no quadro, os ratos serão mais consciente da existência da lente e riscá-lo muito. O comportamento bruto vai voltar ao normal depois de algumas horas. Os ratos com lentes podem ser mantidos com a mesma densidade que os ratos normais.
2. Retire a armação e limpe as lentes e dicas de unha com cotonetes de algodão pelo menos duas vezes por semana para manter a transparência da lente.
   Nota: Não é necessário colocar o rato sob anestesia para retirar e colocar no quadro. Fornece um apoio para os ratos para se sentar, ao invés de tê-los Andes enquanto trabalhando com eles poderia reduzir a angústia.
   1. Se uma medida provisória, é necessária colocar o rato sob anestesia e medir o mouse conforme descrito anteriormente. O incentivo pode ser continuado depois o mouse se recuperando da anestesia.
3. Limpe a gaiola pelo menos duas vezes por semana.
   Nota: Esta ajuda a manter a claridade da lente. Colocar uma rede entre o rato e o fundo da gaiola para filtrar os restos de comida também pode ser útil.
4. Monitore o peso corporal e o comportamento bruto. Compare-os com a mesma idade ratos intocados durante o processo inteiro experimental.
   Nota: Com exceção de alguns comportamentos de risco, nenhuma mudança significativa, incluindo o peso do corpo é encontrada entre os ratos do experimento com ratos não tratados.

Resultados

Pelo primeiro, verifique se todas as peças necessárias são preparadas (Figura 1a). Um exemplo de uma peça de óculos montados é mostrado na Figura 1b. Exceto para o corpo principal dos quadros e a porca, todas as outras partes são descartáveis para cada rato. Um conjunto de óculos completados é mostrado na Figura 1 c. Altere o ângulo entre os dois quadros para caber o mouse com diferentes i...

Discussão

Para garantir que o óculos a fixar estàvel na cabeça do rato, várias etapas neste protocolo precisam ser prestado grande atenção. O periósteo deve ser removido completamente antes de usar o sistema adesivo dental. O sangue no crânio também precisa ser limpo com cuidado. Enquanto um pequeno ajuste fino é aceitável, logo após a aplicação do adesivo, não mova o stick frequentemente antes que o sistema adesivo secar. Siga as instruções do sistema adesivo com cuidado, especialmente a proporção de cada compo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan