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Resumo

Este protocolo detalha as etapas, custos e equipamentos necessários para gerar Escherichia coli-com base em extratos de células e implementar em vitro reações de síntese de proteínas dentro de 4 dias ou menos. Para aproveitar a natureza flexível desta plataforma para aplicações de amplas, podemos discutir as condições de reação que podem ser adaptadas e otimizadas.

Resumo

Nos últimos 50 anos, a síntese de proteína sem célula (CFPS) emergiu como uma poderosa tecnologia para aproveitar a capacidade transcricional e translacional de células dentro de um tubo de ensaio. Por obviating a necessidade de manter a viabilidade da célula e eliminando a barreira celular, CFPS tem sido fundamental para aplicações emergentes em biomanufacturing de proteínas tradicionalmente desafiadores, bem como aplicações em prototipagem rápida para engenharia metabólica e genômica funcional. Nossos métodos para implementar um Escherichia coli-baseado em plataforma CFPS permitir que novos usuários acessar muitos desses aplicativos. Aqui, descrevemos os métodos para preparar o extrato com o uso de meios enriquecidos, frascos perplexos e um método reprodutível de lise celular baseado em sonication ajustáveis. Este extrato pode ser usado na expressão de proteínas capaz de produzir 900 µ g/mL ou mais de proteína fluorescente verde super pasta (sfGFP) em apenas 5 h de instalação experimental para análise de dados, dado que os estoques de reagentes apropriados foram preparados antecipadamente. O custo estimado de inicialização de obtenção de reagentes é $4.500 que sustentarão milhares de reações em um custo estimado de US $0,021 por µ g de proteína produzida ou $0,019 por µ l de reação. Além disso, os métodos de expressão de proteínas espelham a facilidade da instalação do reação vista em sistemas comercialmente disponíveis devido à otimização de misturas prévias de reagente, em uma fração do custo. A fim de habilitar o usuário alavancar a natureza flexível da plataforma para aplicações de amplas CFPS, nós identificamos uma variedade de aspectos da plataforma que pode ser ajustado e otimizado dependendo dos recursos disponíveis e os resultados da expressão da proteína desejado.

Introdução

Síntese de proteína sem célula (CFPS) surgiu como uma tecnologia que desbloqueou uma série de novas oportunidades para a produção de proteína, genómica funcional, engenharia metabólica e muito mais no âmbito do último 50 anos1,2. Comparado ao padrão na vivo plataformas de expressão de proteínas, CFPS fornece três vantagens principais: 1) a natureza sem célula da plataforma permite a produção de proteínas que seriam potencialmente tóxicos ou estrangeiros para a célula3,4 ,5,6; 2) inativação do DNA genômico e a introdução de um modelo de DNA os genes de interesse de codificação canalizar toda a energia sistêmica dentro da reação para a produção das somáticas de interesse; e 3) a natureza aberta da plataforma permite ao usuário modificar e monitorar as condições da reação e a composição em tempo real7,8. Esse acesso direto para a reação suporta o aumento dos sistemas biológicos com químicos expandidos e redox as condições para a produção de novas proteínas e a otimização de processos metabólicos2,9, 10. direto acesso também permite ao usuário combinar a reação CFPS com ensaios de atividade em um sistema de single-pote para teste de compilação de projeto mais rápido ciclos de11. A capacidade de realizar a reação de CFPS em gotas de pequeno volume ou em dispositivos baseados em papel mais suporta os esforços de descoberta do elevado-throughput e prototipagem rápida12,13,14,15 ,16. Como resultado destas vantagens e da natureza de plug and play do sistema, CFPS excepcionalmente permitiu uma variedade de aplicações da biotecnologia tais como a produção de proteínas que são difíceis de solubly expresso na vivo17, 18,19,20, detecção de22,doença21,23, na demanda biomanufacturing18,24 ,25,26,27e educação28,29, os quais mostram a flexibilidade e a utilidade da plataforma livre de célula.

Sistemas CFPS podem ser gerados a partir de uma variedade de bruto lysates de ambas as linhas de células procariotas e eucariotas. Isto permite diversas opções no sistema de escolha, cada uma delas tem vantagens e desvantagens, dependendo da aplicação de juros. Sistemas CFPS também variam muito em produtividade, custo e tempo de preparação. Os mais comumente utilizaram célula extratos são produzidos a partir de células de Escherichia coli , sendo o último mais cost-effective para data ao produzir no mais alto rendimento volumétrico da proteína30, Reticulócito coelho, células de inseto e germe de trigo . Enquanto outros sistemas CFPS podem ser vantajosos para suas máquinas de modificação pós-traducional inata, emergentes aplicações usando o Escherichia coli-baseado em máquinas são capazes de preencher a lacuna, gerando site-specifically fosforilada e glicosilados proteínas na demanda31,32,33,34,35.

Reações de CFPS podem ser executadas em qualquer lote, troca contínua sem célula (CECF) ou fluxo contínuo sem célula (CFCF) formatos. O formato do lote é um sistema fechado, cujo tempo de vida de reação é limitado devido à diminuição de quantidades de reagentes e o acúmulo de subprodutos inibitórios da reação. CECF CFCF métodos aumentam o tempo de vida da reação e, assim, resultam em aumento volumétrico proteína rendimentos em comparação com a reação do lote. Isso é realizado, permitindo que os subprodutos da síntese de proteínas deve ser retirado da embarcação da reação, enquanto novos reagentes são fornecidos durante todo o curso da reação2. No caso de CFCF, a proteína de interesse também pode ser removida da câmara de reação, enquanto no CECF, a proteína de interesse permanece na câmara de reação, composto de uma membrana semi-permeável36,37. Esses métodos são especialmente valiosos na superação pobre rendimento volumétrico de difícil-para-expressam proteínas de interesse38,39,40,41,42, 43. Os desafios na implementação das abordagens CECF e CFCF são que 1) enquanto eles resultam em um uso mais eficiente da maquinaria bio responsável pela transcrição e tradução, necessitam de ser notavelmente maiores quantidades de reagentes que aumenta o custo geral e 2) Eles exigem mais complexa reação de configurações e equipamentos especializados em comparação com o formato de lote44. Para assegurar a acessibilidade para usuários novos, os protocolos descritos foco sobre o formato do lote em volumes de reação de 15 µ l com recomendações específicas para aumentar o volume de reação para a escala de mililitro.

Os métodos aqui apresentados permitem que não-especialistas com habilidades básicas de laboratório (tais como estudantes de graduação) para implementar o crescimento celular, extrair a preparação e instalação de reação de formato de lote para uma Escherichia coli-CFPS sistema baseado. Esta abordagem é rentável em comparação aos kits comercialmente disponíveis sem sacrificar a facilidade de instalação baseado no kit de reação. Além disso, essa abordagem permite que os aplicativos no laboratório e no campo. Ao decidir implementar CFPS, novos usuários devem avaliar cuidadosamente a eficácia dos sistemas de expressão da proteína convencional para investimento de inicialização, como CFPS não pode ser superior em todos os casos. Os métodos CFPS descritos aqui permitem ao usuário diretamente implementar uma variedade de aplicações, incluindo genômica funcional, alta produtividade, a produção de proteínas que são intratáveis por expressão em vivo , bem como campo de teste aplicações, incluindo biosensores e kits educativos para biologia sintética. Aplicações adicionais, tais como a engenharia metabólica, ajuste das condições de expressão de proteínas, doença detecção e aumentar usando métodos CECF ou CFCF ainda são possíveis, mas podem exigir a experiência com a plataforma CFPS de modificações adicionais de reação condições. Nossos métodos combinam crescimento em meios enriquecidos e frascos perplexos, com métodos relativamente rápidos e reprodutíveis de lise celular através de sonication, seguido de uma configuração simplificada de reação CFPS que utiliza premixes otimizado45. Enquanto os métodos de crescimento celular tem tornar-se um pouco padronizados dentro deste campo, métodos para lise celular variam amplamente. Além de sonication, métodos comuns de Lise incluem a utilização de uma imprensa francesa, um homogenizador, batedores do grânulo, ou lisozima e outras perturbações físicas e bioquímicas métodos46,,47,48, 49. usando nossos métodos, cerca de 2 mL de extrato bruto de celular são obtidos por 1 L de células. Esta quantidade de extrato celular pode oferecer suporte a quatrocentos 15 reações de CFPS µ l, cada produção ~ 900 µ g/mL de proteína de sfGFP repórter do modelo do plasmídeo pJL1-sfGFP. Esse método custa $0,021 / µ g de sfGFP produzido ($.019 / µ l de reação), excluindo o custo de mão de obra e equipamentos (Supplemental Figura 1). A partir do zero, este método pode ser implementado em 4 dias por uma única pessoa e repita as reações CFPS podem ser concluídas dentro de horas (Figura 1). Além disso, o protocolo pode ser escalado em volume para lotes maiores de preparação dos reagentes para atender às necessidades do usuário. Importante, o protocolo aqui apresentado pode ser implementado pelo laboratório treinado não-especialistas como alunos de graduação, pois só requer habilidades básicas de laboratório. Os procedimentos descritos abaixo e o de acompanhamento foram especificamente desenvolvidos para melhorar a acessibilidade da plataforma CFPS Escherichia coli para uso amplo.

Protocolo

1. meios preparação e crescimento celular

  1. Dia 1
    1. Células de Escherichia coli BL21*(DE3) raia de glicerol um estoque em uma placa de ágar LB e incubam durante pelo menos 18 h a 37 ° C.
    2. Prepara-se 50 mL de LB mídia e autoclave a solução em um ciclo de líquido por 30 min a 121 ° C. Armazenar em temperatura ambiente.
  2. Dia 2
    1. Prepare 750 mL de 2 x YTP mídia e 250 mL de solução de 0,4 M D-glicose como descrita na informação suplementar.
    2. Despeje a mídia x YTP 2 em um balão de perplexo autoclavado 2,5 L e a solução de D-glicose em um frasco de vidro 500ml autoclavados. Autoclave ambas as soluções em um ciclo de líquido por 30 min a 121 ° C.
    3. Certifique-se de que ambas as soluções estéreis são armazenadas a 37 ° C, se o crescimento celular está sendo executado no dia seguinte, para maximizar as taxas de crescimento após a inoculação. Não combine soluções até a inoculação.
      Nota: Soluções podem ser armazenadas a 4 ° C, durante 1-2 d, se necessário, embora a mídia x YTP 2 é altamente propenso à contaminação.
    4. Começa uma cultura durante a noite de BL21(DE3) por inocular 50 mL de LB mídia com uma única colônia de BL21(DE3) usando um loop esterilizada e técnica asséptica para evitar contaminação.
    5. Coloque a 50 mL de cultura BL21*(DE3) LB a 37 ° C 250 rpm tremendo incubadora e crescer durante a noite por 15-18 h.
    6. Preparar e esterilizar todos os materiais necessários para os dias 3 e 4, incluindo: duas garrafas de centrífuga de 1 L, 4 x frio cónico tubos de 50 mL (pesagem e registros massas de três) e muitos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Dia 3
    1. Remova a cultura da noite 50 mL de BL21*(DE3) de LB a incubadora tremendo e medir o OD600 em um espectrofotômetro usando um 01:10 diluição com LB mídia. Calcular o volume da noite cultura necessário adicionar a 1 L de mídia para uma partida de OD600 de 0.1 (por exemplo, se uma OD600 de um 01:10 diluição é lido como 0.4, inocular 25 mL de OD não diluído600 = 4.0 cultura durante a noite para 1 L de 2 x YTP G).
    2. Remova aquecido 2 x YTP meios de comunicação e soluções de D-Glucose a incubadora 37 ° C, juntamente com os 50 mL de cultura LB. Utilizando uma técnica estéril, com cuidado, despeje a solução de D-Glucose na mídia x YTP 2 (evitando os lados do balão perplexo).
      Nota: A adição de D-Glucose completa a receita para 1 L de 2 x YTPG.
    3. Mantendo uma técnica estéril, inocule a 1L de solução 2 de x YTPG com a quantidade adequada de cultura 50ml para iniciar a cultura de 1L em um 0.1 OD600. Coloca imediatamente a cultura 1L inoculados em um 37 ° C, agitando a incubadora a 200 rpm.
    4. Pegue o primeiro OD600 leitura após a primeira hora de crescimento (fase de retardo típico leva 1 h). Não dilua a cultura. Continue a tomar medidas de OD600 aproximadamente cada 20-30 min até OD600 atinge 0,6.
    5. Ao atingir OD600 = 0,6, adicionar 1 mL de 1 M IPTG (concentração final na cultura 1 L = 1 mM) para a cultura de x YTPG 2.
      Nota: Indução Ideal OD600 é 0,6; no entanto, uma gama de 0.6-0.8 é aceitável. Indução por IPTG é para a produção endógena de T7 RNA polimerase (T7RNAP).
    6. Após a indução, medir o OD600 aproximadamente a cada 20-30 minutos até que ele atinja o 3.0.
      Nota: Refrigerar para baixo o centrifugador a 4 ° C durante este tempo. Prepare o buffer a frio S30 conforme detalhado nas informações complementares. Se o buffer de S30 é preparado com antecedência, certifique-se de que a TDT não é adicionada até o dia de uso.
    7. Uma vez que o OD600 atinge 3.0 (Figura 2A), despeje a cultura em uma garrafa de centrífuga 1L frio num banho de água gelada. Prepare uma garrafa cheio de água centrífuga de 1 L de igual peso para ser usado como um equilíbrio na centrífuga.
      Nota: Os valores de absorvância variam de instrumento-à-instrumento. Enquanto o OD600 da colheita de BL21(DE3) não é uma variável sensível, é recomendável que o usuário avaliar e otimizar essa variável como uma medida de resolução de problemas. Espectrofotômetros maiores podem resultar em leituras de600 OD relativamente baixas em comparação com menores baseados na cubeta espectrofotômetros.
    8. Centrifugar as garrafas de 1 L para 10 min a 5.000 x g e 10 ° C a células de Pelotas.
    9. Lentamente, decantar o sobrenadante e elimine-os em conformidade com procedimentos de resíduos biológicos da instituição. Coloque a pelota no gelo.
    10. Usando uma espátula estéril, raspar o centrifugado da garrafa centrífuga e transferi-lo para um tubo cônico de frio 50 mL.
    11. Adicionar 30 mL de tampão de S30 frio ao tubo cónico e ressuspender as células vortexing com rajadas curtas (20-30 s) e períodos de repouso (1 min) no gelo até totalmente resuspended com nenhum pedaços.
    12. Uma vez que o sedimento é totalmente resuspended, use outro tubo cónico de 50 mL com água como um equilíbrio e centrifugar por 10 min em 5000 x g e 10 ° C (pre-resfriado a 4 ° C).
      Nota: Esta completa 1st de 3 lavagens necessárias ao colher as células.
    13. Despeje o líquido sobrenadante e elimine-os em conformidade com procedimentos de resíduos biológicos da instituição. Resuspenda o pellet com 20-25 mL de frio S30 buffer e centrifugação por 10min a 5000 x g e 10 ° C (pre-resfriado a 4 ° C).
      Nota: Isto completa a 2nd de 3 lavagens.
    14. Novamente, despeje o líquido sobrenadante e elimine-os em conformidade com procedimentos de resíduos biológicos da instituição. Adicione exatamente a 30 mL de tampão S30 e vórtice novamente para Ressuspender o precipitado.
    15. Usando os 3 tubos cónicos 50ml pré-pesados, frio e um enchedor de pipeta sorológica com uma pipeta esterilizada, alíquota 10 mL da mistura de tampão de ressuspensão de sedimento/S30 em cada um dos 3 tubos cónicos.
      Nota: Dividir as células em 3 tubos não é necessária, mas esta etapa resulta em menor célula Pelotas (~ 1 g) para maior conveniência em etapas posteriores.
    16. Todos os tubos de centrifuga, usando apropriado saldos conforme necessário, para 10 min a 5000 x g e 10 ° C (pre-resfriado a 4 ° C).
      Nota: Isto é concluída a etapa de lavagem final.
    17. Despeje o líquido sobrenadante e elimine-os em conformidade com procedimentos de resíduos biológicos da instituição. Remover o excesso S30 buffer limpando cuidadosamente o interior do tubo cônico e tampa com um tecido limpo; Evite tocar a pelota.
    18. Pesar de novo os tubos em uma balança analítica e anotar o peso final da pelota em cada tubo.
      Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto. Os pellets podem ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C por até um ano, até que seja necessário para a preparação do extrato.

2. preparação de extrato celular bruto - dia 4

  1. Para preparação do extrato, não deixar as células no gelo durante cada etapa. Adicione 1 mL de buffer a frio S30 1 g de massa celular da pelota. Certifique-se de que ditiotreitol (DTT) foi completado para o buffer de S30 para uma concentração final de 2 mM.
    Nota: Refrigerar para baixo a microcentrifuga a 4 ° C durante este tempo.
  2. Resuspenda o pellet celular vortexing com rajadas curtas (20-30 s) e períodos de repouso (1 min) no gelo até totalmente resuspended. Se ressuspensão é difícil, embora os pellets no gelo durante 30 minutos descongelar.
  3. Transferi 1,4 mL de ressuspensa células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  4. Coloque um tubo de 1,5 mL contendo 1,4 mL de ressuspensa células em um banho de água gelada num copo. Proceda à sonicação durante 45 s em seguida por 59 s fora por 3 ciclos totais, com amplitude fixada em 50%. Feche e inverter os tubos a misture suavemente durante os períodos de folga. No total, entrega 800-900 J de energia para cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1,4 mL de ressuspensa células (Figura 3A e 3B).
    Nota: Este passo é sensível ao tipo de sonicador e modelo usado e deve ser otimizado se o equipamento é diferente do listado para este procedimento. Duas abordagens complementares podem ser usadas para aumentar a quantidade de extrato preparado durante esta etapa: 1) vários tubos de microcentrífuga de 1,5 mL podem ser sonicated em paralelo e/ou volumes 2) maiores podem ser sonicated em tubos cónicos (até 15 mL de ressuspensão de célula por tubo) , dimensionar a quantidade de energia entregada conforme descrito anteriormente 29,,45.
  5. Imediatamente depois da sonication, adicionar 4,5 µ l de TDT (completando um adicional 2 mM DTT) de 1 M a 1,4 ml de lisado e inverter várias vezes para misturar. Coloca o tubo no gelo. Repita as etapas de 2.4 e 2.5 para tubos de adicionais de ressuspensão células antes de proceder a centrifugação.
  6. Microcentrifuga amostras em 18.000 x g e 4 ° C por 10 min (Figura 3).
  7. Pipete o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Não perturbe a pelota; é preferível deixar alguns sobrenadante para trás para manter a pureza do que to perturbar a pelota em esforços para maximizar o rendimento.
  8. Incube o sobrenadante da etapa anterior a 250 rpm e 37 ° C por 60 min gravando os tubos para a plataforma de agitação de incubadora (esta é a reação de escoamento).
  9. Microcentrifuga amostras em 10.000 x g e 4 ° C por 10 min.
  10. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e transferi-lo para um novo tubo. Crie muitos 100 alíquotas de µ l do extrato para o armazenamento.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e o extrato pode ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C por até um ano, até que seja necessário para reações de CFPS. Pelo menos 5 ciclos de gelo-degelo pode ser submetido sem detrimento para extrair produtividade (Figura 4).

3. célula livre proteína reações da síntese lote formato

  1. Degelo soluções A e B, DNA modelo, BL21(DE3) extrato (se congelado), T7RNAP e uma alíquota de água molecular da classe.
    Nota: Modelo de reação CFPS pode ser encontrado nas Informações complementares. Receitas de soluções A e B são fornecidas nas Informações complementares e correspondem às concentrações específicas para inúmeros reagentes apoiar o sistema de energia de PANOx-SP com base para CFPS. O papel de cada reagente e a variação aceitável nestas concentrações de reagente que possa suportar CFPS ter sido determinado50. Um protocolo de purificação de T7RNAP pode ser encontrado na informações complementares51. T7RNAP suplementar pode aumentar o rendimento volumétrico, mas não é necessário se T7RNAP é induzida durante o crescimento celular. Modelo de DNA de plasmídeo (pJL1-sfGFP) pode ser preparado usando um kit de maxiprep com duas lavagens usando o tampão de lavagem no kit, seguido de uma limpeza de pós-processamento de DNA usando um kit de purificação de PCR (Figura 2B). Modelos de DNA lineares também podem ser usados em reações de CFPS.
  2. Rotule a quantidade necessária de tubos de microcentrífuga necessário para reações de CFPS.
    Nota: Reações podem ser executadas em vários tamanhos de navio, mas uma nave menor pode diminuir o rendimento volumétrico da proteína (Figura 2). Ampliação de uma reação no mesmo vaso tamanho também pode reduzir o rendimento volumétrico, em função de diminuir a troca de oxigênio, devido a uma diminuição da área de superfície à relação do volume. Quando aumentar o volume de reação acima de 100 μL, recomenda-se usar o fundo plano bem placas 31,37,52.
  3. Adicionar 2,2 µ l da solução A, extrato de 2,1 µ l da solução B, 5 µ l de BL21*(DE3), 0,24 μg de T7RNAP (concentração final μg/mL 16), 0,24 ng de DNA modelo (concentração final de 16 ng/mL) e água para trazer o volume final de 15 µ l.
    Nota: Vortex soluções A e B com frequência durante a configuração de reação para evitar a sedimentação de componentes e garantir que cada reação recebe uma homogênea aliquota de cada solução. Evitar a utilização do Vortex do extracto, em vez disso, inverta o tubo para misturar.
  4. Depois que todos os reagentes foram adicionados para a reação, misture cada tubo pipetagem para cima e para baixo ou suavemente num Vortex, garantindo simultaneamente que a mistura de reação final é combinada em um único talão de 15 µ l no fundo do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  5. Coloque cada reação em incubadora a 37 ° C sem tremer por 4h, ou 30 ° C durante a noite.
    Nota: Reações bem sucedidas podem ser qualitativamente avaliadas visualmente com base na cor verde do produto sfGFP dentro a mistura de reação CFPS (Figura 3D). Expressão da proteína de interesse também pode ser confirmada por SDS-PAGE (Supplemental Figura 2).

4. quantificação da proteína repórter, [sfGFP]

  1. Carrega 48 µ l de 0,05 M HEPES, pH 8, para cada um bem necessário para quantificação (geralmente realizada em triplicata por tubo de reação).
  2. Retire as reações da incubadora. Pipetar para cima e para baixo para misturar cada reação e, em seguida, transferir 2 µ l de reação para o 48 µ l de 0,05 M HEPES, pH 8. Pipetar acima e para baixo outra vez no poço para misturar.
  3. Uma vez que todas as reações são carregadas e misturadas, coloque a placa bem 96 para os dados e medir a fluorescência de ponto de extremidade sfGFP.
    Nota: Comprimentos de onda de excitação e emissão para quantificação de fluorescência sfGFP são 485 nm e 510 nm, respectivamente.
  4. Utilizando uma curva padrão gerada anteriormente, determine a [sfGFP] desde as leituras de fluorescência obtidos.
    Nota: As instruções para gerar uma curva padrão de concentração de sfGFP contra a intensidade da fluorescência constam informações suplementares (complementar a Figura 3). Os usuários precisarão estabelecer uma curva padrão para seu instrumento, desde que a sensibilidade do instrumento pode variar.

Resultados

Apresentamos uma base sonication Escherichia coli extrato de protocolo de preparação que pode ser concluído em um período de quatro dias, com a Figura 1 , demonstrando o esgotamento processual ao longo de cada dia. Há maleabilidade para as etapas que podem ser concluídas em cada dia com vários pontos de pausando, mas encontrámos este fluxo de trabalho para ser o mais eficaz executar. Além disso, ambas as pelotas de célula (etapa 1.3.18) e t...

Discussão

Síntese de proteína sem célula tem emergido como uma tecnologia poderosa e propício para uma variedade de aplicações que vão desde biomanufacturing para prototipagem rápida de sistemas bioquímicos. A gama de aplicativos é compatível com a capacidade de monitorar, manipular e aumentar a maquinaria celular em tempo real. Apesar do impacto em expansão desta tecnologia de plataforma, manteve-se ampla adaptação lento devido a nuances técnicas na implementação dos métodos. Através desse esforço, pretendemos...

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Autores gostaria de reconhecer o Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher e Tony Turretto para suporte técnico, Wesley Kao, Layne Williams e Christopher Hight para debates úteis. Os autores reconhecem também apoio financeiro do Bill e fundo de Frost Linda, centro para aplicações em Chevron biotecnologia aplicada pesquisa Endowment Grant da biotecnologia, Cal Poly pesquisa, publicações e programa de concessão de actividades criativas (2017 RSCA), e a National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconhece a Califórnia estado Universidade pós-graduação Grant. MCJ reconhece o escritório da pesquisa da exército W911NF-16-1-0372, National Science Foundation concede MCB-1413563 e MCB-1716766, a força aérea pesquisa laboratório centro de excelência Grant FA8650-15-2-5518, a concessão de agência de redução de ameaça de defesa HDTRA1-15-10052/P00001, o David e Lucile Packard Foundation, o programa de professor erudito Camille Dreyfus, o departamento de energia BER Grant DE-SC0018249, o programa de ciência humana fronteiras (RGP0015/2017), a concessão ETOP DOE Joint Genome Institute, e o consórcio biomédica de Chicago com o apoio dos fundos Searle no Chicago comunidade Trust para apoio.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs

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