Processo de moldagem baseados em molhado-fiação de gelatina para regeneração de tecidos

Resumo

Desenvolvemos e descrever um protocolo baseado no conceito de fiação úmida, para a construção de biomateriais baseados em gelatina, usada para a aplicação da engenharia de tecidos.

Resumo

Este artigo apresenta um método de baixo custo para fabricar gelatina, como um polímero natural, em fibras monofilamento ou outras formas adequadas. Através da fiação método molhado, fibras de gelatina são fabricadas por extrusão suave em um meio adequado de coagulação. Para aumentar a superfície funcional destas fibras de gelatina e sua capacidade de imitar as características dos tecidos, a gelatina pode ser moldada em forma de tubo referindo-se a este conceito. Examinado por testes in vitro e in vivo, os tubos de gelatina demonstram um grande potencial para aplicação em engenharia de tecidos. Atuando como um material de enchimento adequado lacuna, gelatina de tubos podem ser usados para substituir o tecido na área danificada (por exemplo, no sistema nervoso ou cardiovascular), bem como a promover a revitalização, fornecendo uma substituição direta de células-tronco e circuitos neurais. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para a criação de um biomaterial, baseado em um polímero natural, e sua implementação deverá beneficiar muito o desenvolvimento de polímeros naturais correlativos, que ajudam a perceber as estratégias de regeneração do tecido.

Introdução

O mais recente desenvolvimento na regeneração de tecidos envolve a aplicação de engenharia de tecidos, o que representa um desafio para a melhoria de novas estratégias terapêuticas em tratamentos médicos. Por exemplo, o limitado potencial de regeneração do sistema nervoso, seguir lesão ou doença, coloca um problema de saúde significativo em todo o mundo. Devido à complexidade dos processos fisiopatológicos associados com o sistema nervoso, o uso de auto-enxerto tradicional ou a execução de cirurgia de estabilização tem sido mostrada para oferecer benefícios em termos de resultados funcionais, mas não há nenhuma evidência forte para os efeitos de fixação da coluna vertebral, cirurgia^1,2. O tecido na área danificada é perdido e substituído com astrócitos hypertrophically induzido³, eventualmente formando uma densa cicatriz glial^4,5. Esta matriz age como uma barreira que bloqueia a recuperação do nervo função^6,7 e é, assim, dificulta grandemente regeneração. Portanto, espera-se um material de abertura de enchimento adequado para evitar a perda de tecido e reduzir a formação de cicatriz-associado do tecido conjuntivo, mantendo a integridade da área danificada, bem como fornecendo a substituição direta de células neurais e circuitos para promover a regeneração do axônio.

Biomateriais poliméricos tem sido preferidos como andaimes para a terapia de regeneração de tecido, baseado na regulamentação da progressão de comportamento e o tecido celular ou axônio através de suporte natural da matriz extracelular (ECM). O formato da fibra é comumente considerado como um bloco de construção para vários materiais, devido à sua estrutura unidimensional⁸. As fibras geralmente podem ser obtidas por extrusão de derretimento ou molhado girando o método; no entanto, o grande tamanho e custo do equipamento e a dificuldade para realizar esses métodos são desafiadores. Além disso, a maioria dos trabalhos relacionados com fibras de polímero tem sido focada em materiais sintéticos ou compostos. Polímeros naturais como fonte de biomaterial oferecem melhor biocompatibilidade Propriedades, para o corpo humano. No entanto, para obter o alinhamento das fibras de polímero natural é relativamente mais difícil do que de polímero sintético fontes⁹. Portanto, a conversão de um polímero natural, como uma rica fonte de proteína em fibras biomaterial é uma importante estratégia — não somente as fibras do biomaterial podem ser diretamente isolado da matéria-prima, evitando assim uma transformação desnecessária de monômeros, mas o fibras de proteínas também têm uma boa aparência e características favoráveis¹⁰.

A este respeito, nós descrevemos um método de baixo custo de processamento para a fabricação de fibras de polímero natural através do conceito básico de fiação úmida, que pode ser implementada na escala de laboratório para a engenharia de tecidos. Fiação úmida é executada pela extrusão e coagulação de uma solução de polímero em um nonsolvent de polímero apropriado. Uma solução adequada, viscous dopada em meio de coagulação faz com que as moléculas de polímero dissolver. Durante a transição de fase, os filamentos então perdem sua solubilidade e são precipitados sob a forma de um polímero sólido fase¹¹. Referindo-se a este conceito, então ampliamos o desenvolvimento de gelatina para a forma de tubo por um processo de moldagem, que é considerado adequado para a aplicação de regeneração do tecido. Além disso, intrinsecamente, podemos também desenvolver qualquer forma de material de fibras de gelatina (por exemplo, canalização de gelatina enrolado de várias fibras de gelatina), para outro desejado aplicações.

Gelatina, um polímero natural e biodegradável, é formada por colágeno hidrolisado e desnaturado, incluindo qualquer estado helicoidal semicrystalline, amorfo ou triplo de colágeno¹². É sabido que o colágeno é a proteína estrutural essencial em todos os tecidos conjuntivos de vertebrados e invertebrados^13,14, que é semelhante à estrutura da proteína do ECM principal que induz o crescimento do nervo e, simultaneamente, substitui uma grande quantidade de glicosaminoglicano secretada durante lesões na medula espinhal. Portanto, o uso da gelatina como uma fonte seria uma ótima escolha para qualquer veículo a médica. Além de ser uma fonte de baixo custo, a gelatina também é biodegradável e cytocompatible e clinicamente provado ser um temporário defeito de enchimento¹⁵. Desenvolvido em forma de tubo,, testes in vitro e in vivo, descritos aqui demonstram que a gelatina tem um excelente biocompatibilidade e adequação do tecido futura aplicações de engenharia. Cultivadas com células-tronco adiposas humanas, tubos de gelatina melhoram a diferenciação de célula em células progenitoras neurais usando positivo nestin coloração como um marcador de células nervosas. Além disso, gelatina como enchimento material de lacuna, como produzido pelo método estabelecido neste estudo, é esperada para ser seguro e gerenciável e beneficiar muito engenheiros de tecido que estão actualmente a desenvolver polímeros naturais correlativos ao reforço de tecido estratégias de regeneração.

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Protocolo

Os tecidos gordos foram obtidos em cirurgias ortopédicas como certificada pelo institucional Review Board do Tri-serviço geral Hospital, Taipei, Taiwan, R.O.C. procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal nacional Centro médico de defesa, Taiwan (R.O.C).

1. Umedeça girando o processo

1. Preparação da solução
   1. Dissolva 5 g de gelatina em pó em 100 mL de água bidestilada para obter a concentração da solução de 5% (p/v).
   2. Agite a mistura lentamente a 60-70 ° C durante a noite para conseguir uma dispersão homogênea completamente sem quaisquer bolhas.
2. Molhar a fiação
   1. Formação das fibras
      Nota: Um esquema do método é mostrado na Figura 1A. A instalação da fiação está equipada com uma máquina de bomba peristáltica (ver Tabela de materiais) que fornece alta precisão velocidade e controla a entrega Lisa do fluxo.
      1. Conecte uma seringa de 26 x 1/2 polegada (0,45 x 12 mm) como o injetor de solução tubo de vinil clara.
      2. Prepare 100 mL de solução de acetona 99,5% em um copo de béquer deve ser usado como banho de coagulação.
      3. Executar a máquina de bomba peristáltica em 21 rpm (3,25 mL/min) e deixe a solução de gelatina descansar por alguns segundos numa solução de acetona antes de enrolar.
      4. Retire as fibras de gelatina a partir da solução de acetona e mergulhe-os em 2,5% (p/v) de solução de diclorometano/policaprolactona (PCL/DCM) com 01:20 (w/w).
      5. Deixe a gelatina de fibras na solução PCL/DCM seca durante a noite, sob o capô à temperatura ambiente.
   2. Formação do tubo
      Nota: Um esquema do método é mostrado na Figura 1B.
      1. Use um cateter venoso periférico de 24 x 3/4 de polegada (0,7 x 19 mm) como molde do tubo.
      2. Carregar o cateter para a solução de gelatina e segurá-la lá por 3 s.
      3. Carregar o cateter para a solução de acetona e segure por 1 min.
      4. Carregar o cateter novamente para a solução de gelatina e segurá-la lá por 3 s.
      5. Repita este procedimento alternativo de 20x.
      6. Retire o cateter a partir da solução de acetona e deixe o tubo moldado secar à temperatura ambiente por 5 min.
      7. Suavemente retire o tubo de gelatina do cateter, usando uma pinça hemostática e transferir cuidadosamente o tubo de gelatina em um copo de pipetas com a imersão de 2,5% (p/v) da solução de PCL/DCM.
      8. Deixe a pipeta Pasteur contendo que o tubo de gelatina e solução PCL/DCM seca durante a noite, sob o capô à temperatura ambiente.

2. morfologia do tubo gelatina

1. Monte o pedaço de tubo de gelatina secas em um esboço de carbono.
2. Colocar a amostra na máquina íon sputter coater (ver Tabela de materiais) e revestir a amostra com ouro por 60 s; em seguida, observar sua morfologia por microscopia eletrônica (ver Tabela de materiais).

3. cultura de células-tronco adiposas humana

1. Coloque os tecidos gordos (obtidos de tecido adiposo oral por cirurgia clínica) em uma placa de Petri contendo 10 mL de solução de transferência consiste em 0.1 M tampão fosfato salino (PBS), 1% penicilina/estreptomicina e 0,1% de glicose.
2. Corte os tecidos em pedaços pequenos (menos de 1 mm²) com uma lâmina de bisturi.
3. Transferi os tecidos em um tubo plástico de 15 mL e centrifugar 500 x g por 5 min.
4. Remover o sobrenadante e incubar o sedimento em um tubo de plástico contendo 10 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM, consistindo de 4 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e vermelho de fenol de 15 mg/L) com colagenase de 0,1% a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% CO₂, por 1 dia.
5. Centrifugar o tubo plástico a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante cuidadosamente (não toque o sedimento) e então, suspender o sedimento suavemente pela adição de 10 mL de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e deixe 1 dia a 37 ° C , em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO₂.
6. Centrifugar o tubo plástico a 500 x g por 5 min e descartar o sobrenadante cuidadosamente; em seguida, adicione 1 mL de meio de células-tronco (composto de queratinócitos soro livre médio (K-SFM), 5% de FBS, N-acetil-L-cisteína, ácido ascórbico-2-fosfato, estreptomicina e anfotericina) para suspender o sedimento, transferi-lo para um balão de cultura T25 contendo 4 mL de meio de célula-tronco e deixá-lo ficar por 3 dias a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO₂.
7. Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL de ácido de 0,25% do trypsin-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-incubar a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo ar de 95% e 5% de CO₂ para 3,5 min, para separar as células da parte inferior do recipiente de cultura.
8. Adicionar 1 mL de FBS, suspender a mistura e transfira para um tubo de microcentrifugadora.
9. Centrifugar a suspensão de 500 x g durante 3,5 minutos, suspender o sedimento com 1 mL de meio de células-tronco e transferi-lo para o frasco de cultura contendo 5 mL de meio de células-tronco; em seguida, mantê-lo a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 95% ar e 5% de CO₂.
10. Manter a subcultura, alterando o meio de células-tronco em 3 dias.

4. cultivo de células do tubo de gelatina

1. Esterilizar o tubo de gelatina com luz UV para 2h; em seguida, mergulhe-a em 75% (v/v) de etanol e lavá-lo 2 x com média de células-tronco para remover o etanol residual.
2. Colete as células-tronco adiposas humanas (hASCs) do frasco de cultura.
   1. Retire o meio do frasco de cultura.
   2. Adicione 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 95% ar e 5% CO₂ para 3,5 min, para desanexar o hASCs do fundo do balão de cultura.
   3. Adicionar 1 mL de FBS, suspender a mistura e transfira para um tubo de microcentrifugadora.
   4. Centrifugar o tubo microcentrifuga a 500 x g durante 3,5 min; em seguida, descartar o sobrenadante, cuidadosamente e suspender o sedimento com 1 mL de meio de células-tronco.
3. Coloque o tubo de gelatina em uma placa de 6 contendo 3 mL do meio de células-tronco e semente 4 x 10⁴ de hASCs para o tubo; Incube-os por 2 semanas a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO₂.
4. Altere o meio de células-tronco em 3 dias para fornecer a nutrição suficiente para crescimento celular.

5. imunocitoquímica

1. Retire o meio de células-tronco e lave o poço com PBS.
2. Fixe o tubo com células com 0,1% de ácido acético glacial por 30 min à temperatura ambiente.
3. Lave bem 2 x com PBS.
4. Adicionar um surfactante (NP-40, 0.05%) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
5. Lave-o bem 3x com PBS.
6. Adicionar 2% de soro de cabra normal e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
7. Decantar a solução, adicionar o anticorpo primário nestin (marcador de células progenitoras neurais) e incubar durante a noite a 4 ° C.
8. Lave-o bem 3x com PBS.
9. Adicione o anticorpo secundário burro isotiocianato de anti-mouse-fluoresceína (FITC) e manter a amostra no escuro por 2 h.
10. Lave-o bem 3x com PBS.
11. Adicione 1 mL de Hoechst 33342 para manchar os núcleos e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
12. Lave o bem suavemente e observá-lo sob um microscópio de fluorescência.

6. no ensaio de biocompatibilidade In Vivo

Nota: Ratos com peso entre 201-225 g tem testados com êxito usando este protocolo.

1. Anestesia
   1. Induzir e manter a anestesia; de preferência, anestesiar um rato (ratos Sprague Dawley de 8 semanas de idade, fêmea) através de uma injeção intramuscular de tiletamina e eficiente (25 mg / kg + 25 mg / kg, respectivamente) e xilazina (5 mg/kg). Execute um teste de estímulo de dor, pressionando os dedos do rato para confirmar a anesthetization.
2. Esterilização do local cirúrgico
   1. Raspar e limpar a pele da área do trapézio do rato (sobre a parte traseira do pescoço) e limpe-a com loção de iodo-povidona para preparar a condição asséptica da pele (100 mg/mL).
   2. Cobrir o rato com cortinas cirúrgicos estéril para reduzir transferência bacteriana e subsequente contaminação do local cirúrgico.
3. Implantação de tubo de gelatina
   1. Delicadamente, corte a pele da área do trapézio do rato com uma tesoura cirúrgica.
   2. Criar uma ferida de 2 cm e coloque o tubo de gelatina diretamente na camada entre a fáscia e o músculo.
4. Cirurgia postimplantation
   1. Feche a ferida com sutura de nylon e limpe-a com solução de iodo-povidona (100mg/mL).
   2. Induzi o rato através de uma injeção intramuscular de cetoprofeno (2,5 mg/kg) e cefazolina (15 mg/kg).
   3. Mantenha o rato em condições assépticas, por 7 dias.
5. Eutanásia
   1. Rato é eutanásia através de asfixia de CO₂ em conformidade com diretrizes de AVMA para eutanásia. Confirme a morte do rato pela pitada de dedo do pé e cauda, seguida tocando no peito para garantir os batimentos cardíacos.
   2. Cortar o rato delicadamente com uma lâmina de bisturi, remover o tecido implantado e tirar fotos para observação.

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Resultados

Neste estudo, temos desenvolvido com sucesso a gelatina em fibras(Figura 2)e tubos (Figura 2B, C), através do conceito de fiação úmida user-friendly. Estes materiais à base de gelatina podem ser utilizados como qualquer ferramenta médica, dependendo de suas formas. Considerando que a superfície funcional e quadro de tais materiais são mais apropriados para a regeneração dos tecidos, exa...

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Discussão

Apresentamos o desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina usando um simples molhado girando a técnica que pode ser aplicada no estudo de polímeros naturais para a regeneração de tecidos. Este trabalho demonstrou a possibilidade de fabricação de gelatina como fonte de proteína excelente, sem adição de outras fontes, com o objetivo de otimizar as propriedades da gelatina em si. O desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina foi inteiramente realizado em temperatura ambiente (22-26 ° C). Uma prep...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-