Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Resumo

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 10¹³ vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Resumo

Ferramentas de entrega de gene com base no vírus adeno-associado (AAVs) são uma escolha popular para a entrega de transgenes para o sistema nervoso central (CNS), incluindo aplicações da terapia de gene. Vetores AAV são não se replicam, capaz de infectar células de divisão e não dividindo e fornecer a longo prazo expressão do transgene. Importante, alguns serotipos, tais como o PHP recém descrito. B, pode cruzar a sangue-cérebro-barreira (BBB) em modelos animais, após o parto sistêmico. Vetores de vírus adeno-associados podem ser eficientemente produzidos em laboratório. No entanto, robustos e reprodutíveis protocolos são necessários para obter vetores AAV com níveis suficientes de pureza e valores de concentração altas o suficiente para aplicações em vivo . Este protocolo descreve uma estratégia eficiente e reprodutível para produção de vetor AAV, baseada numa estratégia iodixanol gradiente de purificação. O método de purificação iodixanol é adequado para a obtenção de lotes de vetores AAV alta-título de alta pureza, quando comparado a outros métodos de purificação. Além disso, o protocolo é geralmente mais rápido que outros métodos descritos atualmente. Além disso, um quantitativo polymerase chain reação (qPCR)-estratégia baseada é descrito por uma determinação rápida e precisa do título o vetor, bem como uma método de coloração de prata determinar a pureza do lote vector. Finalmente, resultados representativos da entrega do gene ao SNC, seguindo a administração sistémica de AAV-PHP. B, são apresentados. Tais resultados devem ser possíveis em todos os laboratórios usando os protocolos descritos neste artigo.

Introdução

Nos últimos 30 anos, selvagem-tipo AAVs tem sido projetados para criar vetores AAV recombinantes, que provaram para ser excepcionalmente úteis ferramentas para a transferência de genes para o CNS^{1,2,3,4, 5,6} e gene terapia aproxima-se a doença (incluindo aprovado pela FDA e EMA terapias)^4,7. Sua adequação para uso no SNC em grande parte deriva de sua capacidade de infectar células não-dividindo, pós mitóticas, tipicamente encontrados no CNS⁸. No entanto, vectores baseados em vírus adeno-associados também têm a vantagem de permitir uma expressão a longo prazo de qualquer dado transgene terapêutica^4,9 , suscitar uma resposta imune mais ameno, em comparação com outros vetores virais^{7, 8,10,11,12}.

Os principais elementos de qualquer vetor de vírus adeno-associados são o genoma e o capsídeo. Selvagem-tipo AAVs são single-stranded (ss), vírus de DNA com um genoma de aproximadamente 5 kilobases (kb)¹³. Para a produção de vetores AAV recombinantes, os genes rep e cap (necessários para a replicação do genoma e a montagem do capsídeo viral) são excluídos do genoma do vírus adeno-associados do selvagem-tipo e fornecidos em trans, deixando espaço para uma gaveta de expressão contendo o transgene^14,15. As invertido terminais repetir sequências (ITRs) do genoma viral original são os únicos elementos retidos em um vetor de vírus adeno-associados, como estas são essenciais para a replicação e empacotamento de^10,3,14. Vetores AAV podem ser projetados para realçar a expressão do transgene; uma mutação em um dos ITRs leva à formação de um loop de grampo de cabelo que efetivamente permite a geração de uma vertente DNA complementar^3,7,15. A principal vantagem desta configuração, denominado um genoma de autocomplementares (sc), é que ele ignora a necessidade de síntese do segundo-costa típico do ciclo de vida convencional de AAVs, aumentando consideravelmente a velocidade e os níveis de expressão do transgene ¹., no entanto, usar um genoma scAAV reduz a capacidade de carga do vetor de aproximadamente 2,4 kb. Isso inclui sequências de transgene, bem como qualquer sequências reguladoras tais como promotores ou sites de microRNA-ligação, para limitar a expressão de tipos de célula específica¹⁶.

O capsídeo do vírus adeno-associados determina interação vetor-hospedeiro celular e confere um grau de tropismo de tipo ou tecido celular por um sorotipo de vírus adeno-associados, que também pode ser explorado para limitar a expressão do transgene para locais específicos. Vários sorotipos de vírus adeno-associados são encontrados na natureza, Considerando que os outros tenham sido produzidos em laboratórios através de abordagens recombinantes (i.e., PHP. B). Além disso, alguns capsids também conferem outras características úteis, tais como a capacidade de atravessar o BBB, resultando na entrega de transgenes em todo o SNC após administração sistémica. Isto foi mostrado para AAV9, bem como para o PHP recentemente descrita. B capsídeo¹⁷. Como consequência, estes sorotipos estão provando para ser particularmente relevante para novas abordagens de terapia do gene para^1817,1,do doenças neurodegenerativas.

O objectivo do presente protocolo é descrever um método de baixo custo para a produção em pequena escala de vetores AAV com alta concentração e pureza. Embora os resultados apresentados aqui use o PHP. Capsídeo B e uma gaveta de expressão scAAV, o protocolo é apropriado para a produção de vários serótipos de vetor de vírus adeno-associados e configurações de genoma, permitindo a máxima flexibilidade experimental. No entanto, o rendimento de vetor e pureza final podem variar dependendo do serótipo escolhido.

O protocolo em si é uma variante do método de produção viral vector tri-transfecção clássica e incorpora o uso de um gradiente de iodixanol para vector limpar, que, em comparação com o clássico uso de gradientes (CsCl) de cloreto de césio, tem sido relatado para produzir vetores AAV de maior pureza em um tempo mais eficiente forma^19,20,21.

As etapas de transfeccao, purificação e concentração destinam-se a ser realizada de acordo com boas práticas de laboratório (BPL) em um laboratório de cultura de tecido avaliado para trabalho de vetor viral. Cada tarefa deve ser executada em conformidade com a legislação pertinente de local e nacional relativas à produção de vetor viral e usar. Trabalho deve ser realizado sob uma capa de fluxo laminar e em condições estéreis. Dentro das instalações do vector, é aconselhável usar um avental de laboratório, além do jaleco de cultura de tecido normal. Além disso, um duplo par de luvas, bem como as galochas de plástico, deve ser usado em todos os momentos.

Antes de iniciar a produção de vetor, certifique-se de todos os equipamentos necessários e plasmídeos estão disponíveis. 1) pCapsid plasmídeo contém o rep o gene que codifica a quatro proteínas não estruturais necessárias para a replicação, nomeadamente Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 e o cap gene que codifica a três proteínas estruturais do capsídeo, nomeadamente VP1, VP2 e VP3. 2) plasmídeo pHelper contém os genes E4 E2Ae VA de adenovírus, que facilitam a produção de AAV nas células HEK293T. 3) plasmídeo pTransgene contém a fita de expressão do transgene, ladeada por dois ITRs. Estes plasmídeos podem ser sintetizados de novo no laboratório usando sequências disponíveis on-line²². Para plasmídeos feitos de novo, especialmente aqueles que contêm transgenes romance, sequenciamento é necessário, para certificar-se de que o transgene e ITRs estão corretas. Como alternativa, do premade plasmídeos podem ser adquiridos directamente através de repositórios on-line do plasmídeo. Quando necessário, plasmídeos podem ser amplificados e purificada usando kits de padrão, de acordo com instruções^{23 as indicações do fabricante}.

Título de vetor e pureza podem afectar negativamente a capacidade de transdução do vetor. Protocolos adicionais são fornecidos para avaliar a qualidade do vetor produzido. Os vetores finais serão úteis para estudos da função de célula CNS em aplicações tanto in vitro e in vivo .

Protocolo

Solução	Composição
Cultura celular e transfecção
DMEM1	DMEM 1 x
	1% FBS (v/v)
	1% (v/v) de GlutaMAX
DMEM10	DMEM 1 x
	10% (v/v) de FBS
	1% (v/v) de GlutaMAX
150 mM NaCl	4,380 g NaCl
	Até 500 mL de água ultrapura
AAV purificação e dessalinização
NaCl 5 M	146,1 g NaCl
	Até 500 mL de água ultrapura
1 M Tris HCl (pH 8,5)	base de Tris 12,11 g	CUIDADO
	Até 100 mL de água ultrapura
	Adicionar 1 M HCl, usando uma pipeta Pasteur para reduzir o pH para 8,5
Lise	15 mL de NaCl 5m
	25 mL de 1 M Tris HCl (pH 8,5)	CUIDADO
	Até 500 mL de água ultrapura
10 x tampão fosfato salino (PBS)	80 g de NaCl
	2 g de KCl	CUIDADO
	14,4 g Na2HPO4
	2,4 g KH2PO4
	Até 1 L de água dd
1 M MgCl2	g 20,33 MgCl2-6 H2O
	Até 100 mL de água ultrapura
KCl 1 M	7,45 g KCl	CUIDADO
	Até 100 mL de água ultrapura
5 x solução PBS magnésio-potássio (PBS-MK)	250 mL de PBS de x 10
	2,5 mL de 1m MgCl2
	6,25 mL de KCl 1 M	CUIDADO
	Acima de 500 mL Ultrapure água H2O
15% Iodixanol	12,5 mL de Optiprep médio gradiente de densidade	CUIDADO
	10 mL de NaCl 5m
	10 mL de 5 x PBS-MK
	17,5 mL de água ultrapura
25% Iodixanol	20,8 mL de Optiprep médio gradiente de densidade	CUIDADO
	10 mL de 5 x PBS-MK
	19,2 mL de água ultrapura
	100 µ l de vermelho de fenol
40% Iodixanol	33,3 mL de Optiprep médio gradiente de densidade	CUIDADO
	10 mL de 5 x PBS-MK
	6,7 mL de água ultrapura
60% Iodixanol	50 mL de Optiprep médio gradiente de densidade	CUIDADO
	100 µ l de vermelho de fenol	CUIDADO
Controle de pureza AAV
10 x de tampão Tris de Acetato EDTA (chá)	base de Tris 44,8 g	CUIDADO
	11,4 mL de ácido acético glacial (17.4M)
	3,7 g de EDTA
	Água ultrapura L até 1
Gel de agarose	Ultrapura agarose 0,8 g
	Até 100 mL de tampão 1 x chá
Amortecedor gel	base de Tris 181,7 g	CUIDADO
	1,5 g SDS	CUIDADO
	Ajustar o pH a 8,45 com 1 M de HCl	CUIDADO
	Até 500 mL de água ultrapura
Cátodo do buffer 10x	base de Tris 121,14 g	CUIDADO
	179,2 g Tricine	CUIDADO
	SDS 1% (w/w)	CUIDADO
	Água ultrapura L até 1
Ânodo de 10x buffer	base de Tris 242,3 g	CUIDADO
	Água ultrapura L até 1
	Ajustar o pH a 8,9 com 1 M de HCl	CUIDADO
Tampão de amostra 5x	Para 20 mL:
	base de Tris 605 mg	CUIDADO
	4 g SDS	CUIDADO
	10 mg Serva azul G
	12 g de glicerol
	Ajustar o pH para 6,8 com 1 M de HCl, alíquota e armazenar a-20 ° C	CUIDADO
Gel de empilhamento	Para 2 géis:
	Acrilamida 400 µ l	CUIDADO
	Amortecedor de gel 750 µ l
	1,85 mL água ultrapura
	4 Μ L TEMED	CUIDADO
	20% de 10 µ l APS (v/v)	CUIDADO
	Adicionar TEMED e 10% APS imediatamente antes de derramar o gel. Use ambos os produtos químicos sob uma capa de química.
Gel de resolução	Para 2 géis:
	acrilamida 3,32 mL	CUIDADO
	amortecedor de gel de 3,35 mL
	1,14 mL água ultrapura
	glicerol a 50 mL de 2,12
	6 Μ L TEMED	CUIDADO
	50% de 10 µ l APS (p/v)	CUIDADO
	Adicionar TEMED e 10% APS imediatamente antes de derramar o gel. Use ambos os produtos químicos sob uma capa de química.
Butanol saturado de água	10 mL de n-butanol	CUIDADO
	1 mL água ultrapura
Atenção: Consulte a tabela de materiais para orientações sobre a utilização de produtos químicos perigosos.

Tabela 1: Composição das soluções necessárias.

1. Tri-transfecção de células HEK293T

Nota: Por favor, consulte a tabela 1 para a composição dos amortecedores e soluções usadas no protocolo.
Nota: Desempenho desta seção do protocolo leva aproximadamente 4 dias.

1. Descongelar um frasco de células de rim humano embrionário (HEK) 293T em banho-maria a 37 ° C.
   Nota: Use somente as células que têm sido passadas a menos do que 20 x para garantir eficiência optimal do transfection.
2. Pratos de cultura de células de células HEK293T de sementes em uma densidade de 2 x 10³ a 6 x 10³ células/cm² em DMEM10 15 cm de diâmetro.
3. Crescem as células a confluência de 70 a 80% em uma incubadora padrão definido a 37 ° C, com 95% de umidade e 5% de CO₂.
   Nota: A produção de um lote de vetores AAV usando este protocolo requer 18 pratos de cultura celular (15 cm de diâmetro). Uma confluência de célula de 70-80% corresponde a 6 x 10³ a 7 x 10³ células/cm², mantidos em 17 – 20 mL do meio de cultura de DMEM10.
4. Preparar o polyethylenimine (PEI) / DNA mix na proporção de 1/3.5 (w/w) de concentração.
   1. Prepare a mistura de ADN para 18 pratos de cultura de células em um tubo cónico de 50 mL pela mistura de 360 µ g de pΔF6, 180 µ g de pCapsid e 180 µ g de pTransgene em 18 mL de 150 mM de NaCl.
   2. Distribua a mistura de DNA através de três tubos de 50ml cónico (6 mL de ADN misturar por tubo cônico).
   3. Prepare a mistura de PEI para seis pratos de cultura em um novo tubo cónico de 50 mL de células misturando 840 µ g de PEI (1 µ g / µ l) em 6 mL de 150 mM de NaCl.
   4. Preparar a mistura de PEI/DNA adicionando 6 mL da mistura PEI (preparada na etapa 1.4.3), gota a gota, para um dos tubos cónicos contendo a mistura de DNA (preparada na etapa 1.4.2) e incube por 20 min em temperatura ambiente.
      Nota: Depois de 20 min. de incubação, a mistura de PEI/DNA vai se tornar ligeiramente turva.
5. Tomar seis pratos de cultura de células fora da incubadora e aspirar completamente o meio de cada prato de cultura em uma capa de fluxo laminar. Remova os vestígios do meio lavando os pratos com 5 mL de fosfato salino de escaldadas Dulbecco (DPBS).
6. Assegurar a distribuição de DPBS sobre toda a superfície delicadamente inclinando o prato.
7. Delicadamente, Aspire o DPBS e adicionar 12 mL de DMEM1 para cada prato.
   Nota: Evite retirar as células adicionando lentamente, o meio de uma pipeta, colocada na borda do prato.
8. Misture o PEI/DNA pipetando subindo e descendo 3X - 5X. Adicione 2 mL da mistura PEI/DNA de cada um dos pratos de cultura a seis células em forma de gota-a-gota, cuidadosamente, distribuindo-o sobre toda a superfície. Depois que a mistura é adicionada para cada prato, coloque os pratos de volta na incubadora. Repita as etapas 1.4.3– 1.8 para os restantes pratos de cultura.
9. Incube as celulas transfectadas para 5 h a 37 ° C, com umidade de 95% e 5% CO_2.
10. Adicionar um adicional 12 mL de DMEM10 para cada prato de cultura sem remover o meio pré-existentes (total volume médio = 25 mL).
11. Incube as celulas transfectadas acima para pós-transfeccao de 72 h a 37 ° C, com 95% de umidade e 5% de CO₂.

Complementar Figura 1: morfologia de células HEK 293T visualizada por microscópio de contraste de fase (à esquerda) com a confirmação da expressão de GFP visualizado por fluorescência de imagem (direita). (A) bem sucedido transfeccao de HEK293T células com uma codificação de GFP pTransgene é confirmado pela imagem latente de fluorescência. (B) HEK293T tratadas exclusivamente com reagentes de transfecção de células não mostram nenhuma expressão de GFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

12. Colha a médio e o pós-transfeccao 72 h de células. Use uma espátula de célula para separar cuidadosamente as células do prato cultura. Recolha o meio e as células em um tubo cônico de 50 mL, mantidos no gelo.
    Nota: O conteúdo de dois pratos de cultura de células pode ser coletado em um tubo cônico único 50 mL. No final dessa etapa, cada um dos nove tubos irá conter cerca de 50 mL do meio.
13. Centrifuga os tubos cônicos em 420 x g durante 10 minutos a 4 ° C, com a aceleração e desaceleração do centrifugador definido para máximo.
14. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante de cada tubo. Não utilize pipetas para evitar a perda de material. Em vez disso, gentilmente transferir o sobrenadante para um recipiente de eliminação de resíduos e coloque os tubos contendo as pelotas de célula volta no gelo.
15. Resuspenda o pellet cada célula em 2 mL de tampão de Lise diretamente no tubo cónico de 50 mL por pipetagem e descer de 5 – 10 x. Fazer não o vórtice. Agrupe todos os lysates de três tubos juntos.
    Nota: Neste ponto, haverá três tubos cónicos 50ml, cada um contendo 6 mL das células ressuspensão em tampão de Lise.

2. AAV Vector purificação

Nota: Desempenho desta seção protocolo leva aproximadamente 1 dia. Execute as seguintes etapas simultaneamente em cada um dos três tubos cónicos 50 mL contendo as células resuspended em tampão de lise (ver Nota anterior).

1. Congelar e descongelar as células ressuspensa 3 x lyse-los e liberar as partículas AAV. Execute a etapa de congelamento, colocando os tubos em um balde que contém gelo seco misturado com etanol. Executar a descongelar colocando imediatamente as células em um banho de água a 37 ° C.
2. Após a terceira etapa de descongelamento, centrifugar a 1.167 x g durante 15 min a 4 ° C.
   Nota: Será formada uma pelota perceptível composta de restos de células. Ao manusear os tubos, evite movimentos bruscos, como estes podem causar o desprendimento da pelota para o sobrenadante, que irá comprometer a pureza do vetor final.
3. Transferir com cuidado os sobrenadantes para limpar tubos Erlenmeyer de 50 mL e adicione nuclease para cada tubo, a uma concentração final de 50 U/mL de sobrenadante.
4. Incubar durante 30 min a 37 ° C. Agite os tubos de 50ml cónico à mão cada 10 min para garantir que a nuclease é bem misturada com o sobrenadante.
5. Clarificar o sobrenadante por centrifugação a 13.490 x g por 20 min a 4 ° C.
6. Anexar um filtro de 0,45 µm para uma seringa de 10 mL e coloque-o em cima de um tubo cónico de 50ml limpo. Cuidadosamente, remover o êmbolo e encha a seringa com o sobrenadante da etapa 2.5.
7. Utilize o êmbolo para forçar o lisado através do filtro. Use um filtro novo e seringa para cada tubo de sobrenadante obtido na etapa 2.5.
   Nota: A fração obtida é conhecida como 'bruto lisado'.
8. Cada uma das frações iodixanol 15%, 25%, 40% e 60% em quatro tubos de 50ml separado cónico, prepare de acordo com as instruções na tabela 1.
9. Preparar do iodixanol em três tubos de ultracentrifugação, usando a seguinte ordem de iodixanol frações: 8mL de iodixanol 15%, 5,5 mL de iodixanol 25%, 5 mL de iodixanol 40% e 4,5 mL de iodixanol 60%.
   Atenção: Iodixanol pode causar irritação aos olhos, pele e o trato gastrointestinal e respiratório. Quando o tratamento do iodixanol, usar luvas e sob uma capa de fluxo laminar.
   1. Pipete 8 mL do iodixanol 15% em cada tubo de ultracentrifugação.
   2. Pipete 5,5 mL de solução de iodixanol de 25% para um tubo cônico de 50ml limpo (figura 1A).
   3. Use uma pipeta Pasteur não-licenciado (como o pescoço do tubo ultracentrifugação é muito estreito para Pipetas graduadas convencionais) a camada cuidadosamente 5,5 mL da solução iodixanol 25% inferior a 15% iodixanol solução (figura 1B).
      Nota: Isto pode ser conseguido com êxito, adicionando o iodixanol em três etapas, já que a pipeta Pasteur só pode conter cerca de 2 mL.
   4. Adicione as soluções iodixanol 40% e 60% conforme descrito na etapa 2.9.3. Não perturbe os iodixanol diferentes interfaces durante a estratificação.
      Nota: A preparação apropriada das frações iodixanol diferentes pode ser assegurada pela confirmação visual graças ao vermelho de fenol adicionado para as frações iodixanol (consulte as instruções na tabela 1). Desde que cada fração tem uma densidade específica, eles não irão misturar durante a etapa de estratificação, se é realizada corretamente (ver Figura 1).
10. Camada do crude lisado em cima do gradiente iodixanol 15% com uma pipeta Pasteur. Gota a gota para evitar perturbar a interface entre o lisado petróleo bruto e a solução de iodixanol de prosseguir.
11. Encha o tubo de ultracentrifugação com Lise até o menisco atinja a base do pescoço do tubo para assegurar que o tubo não desmorone sob as forças muito elevadas geradas durante a ultracentrifugação (Figura 1).
12. Feche os tubos de ultracentrifugação usando tampas adequadas. Use uma escala digital para certificar-se de que todos os três tubos de ultracentrifugação tem o mesmo peso. Ajuste o peso, se necessário, adicionando mais lise em cima o lisado 'bruto'.
    Nota: A diferença de peso entre os tubos de ultracentrifugação deve ser inferior a 0,1 g garantir a operação segura da se. Ultracentrifuges são equipamentos potencialmente perigoso e só devem ser utilizados por pessoal devidamente treinado.
13. Centrifuga os tubos no 301.580 x g, utilizando um rotor de ângulo fixo titânio, durante 1 h e 40 min a 12 ° C, usando a velocidade máxima de aceleração e desaceleração.
14. Insira cuidadosamente uma agulha em aço inoxidável para a interface de iodixanol de 60% e 40%.
    1. Conecte a agulha de uma seringa de 5 mL (Figura 1E).
    2. Aspire somente a fração clara, contendo as partículas de vetor.
       Nota: O volume total coletado é aproximadamente 2,5 – 3 mL. Evite a coleta de material através da interface de 25-40%, já que isto irá aumentar o nível de contaminação no lote final vetor, devido à presença de proteínas não-desejáveis.
    3. Processar a fração coletada (dessalinização e concentração) ou armazená-lo durante a noite a 4 ° C.

Figura 1: instalação iodixanol gradiente purificação e coleção de vetor subsequentes. (A) antes de pipetar o diferente do iodixanol no tubo de ultracentrifugação, Pipetar um volume adequado de cada solução iodixanol para um tubo cônico separado. (B) em seguida use um Pasteur pipeta para transferir sequencialmente cada solução iodixanol para o tubo de ultracentrifugação: camadas de uma concentração cada vez mais alta iodixanol devem ser adicionadas na parte inferior do tubo sob a camada anterior. (C) camada o vetor bruto lisado na parte superior uma vez que o gradiente foi preparada. Este sistema de coleção de vetor não usa agulhas afiadas, que representam um risco de lesões de 'picada'. (D) A agulha de seringa-316 aço inoxidável é inserida através do gradiente iodixanol até a interface de iodixanol 40/60%. (E) vetor partículas encontram-se na fase de iodixanol 40% e são coletados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. dessalinização e concentração do vetor AAV

Nota: Desempenho desta seção do protocolo leva aproximadamente 2 h.

1. Prerinse da membrana do filtro do filtro centrífugo pela adição de 5 mL de 1X PBS-MK e centrifugue por 5 min a 4.000 x g.
2. Adicionar 5 mL de 1X PBS-MK para a fração de vetor AAV coletada, misture e adicione o volume total ao filtro. Após adição de 1X PBS-MK, turbidez é observada. Centrifugar a 4.000 x g até o volume presente no filtro cónico foi reduzido para 1 mL. Descarte o escoamento acumulado no tubo de coleta externa.
3. Adicionar 13 mL de 1X PBS-MK para o filtro cónico e repetir a centrifugação passo quantas vezes forem necessárias (mínimo 3 x), até lá é não mais turbidez observado quando fresco 1X PBS-MK é adicionado.
4. Na final lavar passo, adicionar 13 mL de PBS + 0,01% (v/v) tensoativo não-iônico e centrifugar a 4.000 x g , até que o volume é reduzido a 300 – 350 µ l.
5. Colete a fração restante presente no filtro pipetando todo o volume para um tubo estéril microcentrifuga contornados.
   Nota: Esta fração contém o vetor de vírus adeno-associados demolhado e concentrado. Nas etapas seguintes do presente protocolo, esta fração é referida como a fração 'primary'. Certifique-se de lidar com o tubo sob o capô e armazená-lo em 4 ° C.
6. Lave o filtro com 200 µ l de 1 x PBS-MK para coletar as vetor residual partículas retidas no filtro. Colete em um tubo estéril microcentrifuga.
   Nota: Este é um estoque de vetor diluído, que pode ser adequado para algumas aplicações que requeiram baixa concentração de vetor. Em etapas futuras, esta fração é referida como a fração 'secundária'.
7. Para o armazenamento a curto prazo, armazene o vetor fraction(s) a 4 ° C (menos de 2 semanas). Alíquota e loja do vetor ‑20 ° C quando o armazenamento a longo prazo é necessário.
8. Execute o controle de qualidade conforme descrito na seção 4.

4. titulação do vetor por reação em cadeia da polimerase quantitativa

Nota: Desempenho desta seção do protocolo leva aproximadamente 3 h.

1. Curva padrão
   1. Linearizar o plasmídeo transgene-expressando (pTransgene) usado para a transfecção de células HEK-293T na secção 1.
   2. Preparar a mistura de digerir de restrição em um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL (consulte a tabela 2 para a composição da mistura de digerir a restrição).
      Nota: Ajuste a composição da mistura de digerir a restrição de acordo com a enzima utilizada e as orientações relacionadas do fabricante.
   3. Incubar a mistura de digerir restrição para 1 h a 37 ° C.
   4. Verifica a eficiência da digestão restrição executando o plasmídeo linear em um gel de agarose 0,8% (p/v) em 100 V para a digestão completa de 1 h. do plasmídeo deve produzir um único fragmento de tamanho definido.
   5. Purificar o plasmídeo linear de DNA usando um kit de purificação de PCR, seguindo as instruções do fabricante²⁴e medir a concentração de DNA com um espectrofotômetro, medindo-se a absorção em 260 nm. Após a titulação, armazene a restante alíquota do plasmídeo linear ‑20 ° C, de continuar a utilizar.
   6. Calcule as moléculas (ou seja, cópias de DNA), do estoque do plasmídeo por microlitro como segue.
      1. Em primeiro lugar, calcule o peso molecular do plasmídeo. Supondo que o peso médio de um par de base de DNA (bp) 650 Daltons (Da) e que uma mole de um bp pesa 650g, o peso molecular de qualquer modelo de DNA dupla-hélice pode ser estimado por tomar o produto do seu comprimento (em PA) e peso por par de base.
         Peso molecular de plasmídeo [g/mol] = tamanho do plasmídeo [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Em seguida, calcule o número de moles de plasmídeo por microlitro.
         Moles de plasmídeo por microlitro = concentração do plasmídeo [g / µ l] / peso molecular de plasmídeo [g/mol]
         Nota: O inverso do peso molecular é o número de moles de plasmídeo presente em 1 g do material.
      3. Em seguida, calcule o número de moléculas de plasmídeo por microlitro, usando do número de Avogadro (6.022 x 10²³ moléculas/mole).
         Moléculas de plasmídeo por microlitro = moles de plasmídeo por microlitro [moles / µ l] x número de Avogadro [moléculas/mole]
      4. Finalmente, dilua o estoque de plasmídeo (moléculas / µ l) para obter uma solução de 100 µ l com a concentração desejada de 1 x 10⁹ moléculas (vetor genomas (vg) por microlitro).
         Estoque do plasmídeo (100 µ l) = (concentração desejada [moléculas / µ l] x 100 µ l) / moléculas plasmídeo [moléculas / µ l]
   7. Faça diluições de série da unidade populacional de plasmídeo (1 x 10⁹ vg / µ l) em triplica:
      10 µ l de caldo de plasmídeo de vg / µ l 1 x 10⁹ + 90 µ l de H₂O = 1 x 10⁸ vg / µ l solução
      10 µ l da diluição de vg / µ l 1 x 10⁸ + 90 µ l de H₂O = 1 x 10⁷ solução de vg / µ l
      10 µ l da diluição de vg / µ l 1 x 10⁷ + 90 µ l de H₂O = 1 x 10⁶ vg / µ l solução
      10 µ l da diluição de vg / µ l 1 x 10⁶ + 90 µ l de H₂O = 1 x 10⁵ vg / µ l solução
      Continue a obter uma solução de vg / µ l¹ 1 x 10.
   8. Manter as diluições de série da unidade populacional de plasmídeo padrão no gelo até carregá-los na placa qPCR (seção 4.3).

Componente de	Quantidade
10x buffer de enzima de restrição	5 Μ l
Enzima de restrição	2,5 Μ l
Plasmídeo	5 µ g
H2O	até 50 µ l

Tabela 2: Composição de mistura de digerir restrição.

Tabela 3: calculadora de volume de plasmídeo Stock. Clique aqui para baixar esta tabela.

2. Extração de DNA do vetor AAV
   1. Misture 2 µ l da AAV vector stock (a principal fração da etapa 3.5) com 198 µ l de DNase eu buffer (1x) em tubos de strip-tease (polimerase) e adicionar 2 µ l de DNase eu.
      Nota: DNase que eu irá degradar qualquer material genético não está contida no interior de um capsídeo de vetor (que iria distorcer os resultados de qPCR). Esta solução é referida como diluição 'dil1 x 10^-2'.
   2. Incubar durante 30 min a 37 ° C, seguido por 10 min a 95 ° C.
      Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e o material pode ser armazenado por tempo indeterminado a 4 ° C, para evitar a deterioração do produto.
   3. Adicionar 2 µ l de proteinase K para a solução de dil1 x 10^-2 (passo 4.2.1) e incube por 60 min a 50 ° C, seguido por 20 min a 95 ° C.
      Nota: Esta etapa irá desmontar o capsídeo do vetor de vírus adeno-associados e libertação do genoma de vetor de vírus adeno-associados a solução. Adicione proteinase K em excesso, como o teor da amostra de proteínas (capsídeo) não é conhecido. Note que é essencial para garantir a remoção de toda a atividade da protease K por desnaturação, antes qPCR, para evitar problemas com a degradação do polymerase (parcial) influenciar o resultado final.
   4. 01:10 Prepare diluições em série da proteinase K Tratado dil1 x 10^-2 solução (etapa 4.2.3) em tubos de 1,5 mL microcentrifuga como segue:
      10 µ l de dil1 x 10^-2 + 90 µ l de H₂O = dil1 x 10^-3 diluição
      10 µ l de dil1 x 10^-3 + 90 µ l de H₂O = dil1 x 10^-4diluição
      10 µ l of dil1 x 10^-4 + 90 µ l de H₂O = dil1 x 10^-5 diluição
   5. Manter as diluições em série do DNA extraído do vetor no gelo até carregá-los na placa qPCR (seção 4.3).
3. Titulação por SYBR Green qPCR de detecção-baseado
   1. Prepare a mistura de mestre qPCR em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, para a amostra e os padrões. Use 10 µ l de SYBR Green Master Mix, 1 µ l de primer para a frente (estoque de 10 µM), 1 µ l de primer reverso (estoque de 10 µM) e 3 µ l de H₂O por reação. Veja o protocolo na tabela 4 para sequências da primeira demão.
   2. Pipetar qPCR mestre mistura acima e para baixo, mas fazer não vórtice.
   3. Adicione 15 µ l do mix mestre qPCR, seguido por qualquer 5 µ l da curva padrão preparada no ponto 4.1 ou o DNA extraído o vetor de vírus adeno-associados na seção 4.2, para cada poço. Incluem três poços contendo apenas o qPCR mestre mix, como controlo negativo. Consulte a Figura 2 para o layout da placa.
   4. A placa com uma película de vedação do selo e brevemente centrifugar a placa qPCR a 1.500 x g por 30 s a 4 ° C.
   5. Execute a reação de qPCR em uma placa em tempo real do PCR amplificação e deteção instrumento, usando as condições sugeridas na tabela 5.

Nome da primeira demão	Sequência de
Cartilha para a frente	5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3'
Primeira demão reversa	5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3'

Tabela 4: Sequências de Primer projetadas contra o promotor do CBA.

Figura 2: layout de placa de titulação baseada em qPCR vetor. As amostras são codificados por cores: verde = curva padrão; azul = H₂O controle; cinza = fração primária; laranja = fração secundária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Passo	Tempo	Temperatura	Ciclos de	Objetivo
Pré-incubação	5 min	95 ° C	X1	Desnaturação e polymerase de activação do ADN (quente-iniciar reação).
Amplificação	10 min	95 ° C	X1	Amplificação do DNA. Configurações podem ser otimizadas se alternativa cartilhas com temperatura do recozimento diferente são usadas.
	10 s	95 ° C	X40
	40 s	60 ° C
	1 s	72 ° C
De resfriamento	10 s	40 ° C	X1	Placa de resfriamento. Final do PCR.

Tabela 5: Termal protocolo ciclismo para titulação de SYBR qPCR baseada em verde.

4. Análise de dados para determinar o título de vetor de vírus adeno-associados
   1. Preencha as células de planilha de dados (tabela 6A) com os valores de Ct obtidos para as diferentes diluições da amostra-padrão preparado na seção 4.1 para gerar uma curva padrão.
      Nota: A equação da curva padrão será mostrada (y = um ln (x) + b) juntamente com a eficiência de² R(tabela 6B). Um qPCR deve ter uma eficiência próxima de 100% e R² perto de 1.0 (≥ 0,96).
   2. Use os valores calculados de um e b para preencher as células de dados correspondentes na planilha (tabela 6).
   3. Complete a planilha com os valores de Ct obtidos para as diferentes diluições da amostra AAV preparado na seção 4.2.
   4. Calcule o título de vetor AAV médio nos genomas de vetor por microlitro de fração' primário', usando a seguinte fórmula:
      
      Nota: O fator 400 é usado para única genomas ociosos, enquanto genomas sc usam um fator de multiplicação de 200²⁵. De fato, como as quantidades de DNA duplas durante cada ciclo de qPCR, sc que DNA é detectada 2 x em comparação com um genoma de ss. O objetivo da titulação é calcular a concentração em termos de genomas de vetor por microlitro. Uma correção é necessária para executar o qPCR quando usando 2 µ l de material (passo 4.2.1) começar. Dil representa os fatores de diluição da etapa 4.2.4. O título da fração de vetor AAV 'secundários' (passo 3.6) pode ser calculado simultaneamente.

Tabela 6: modelo para análise de dados de qPCR. Clique aqui para baixar este arquivo.

5. pureza controle por SDS-PAGE e coloração prata

Nota: Desempenho desta seção do protocolo leva aproximadamente 5 h.

1. Use etanol a 70% (v/v) para limpe as placas de vidro usadas para converter os géis.
2. Monte o sistema de fundição do gel. Certifique-se de que as partes inferiores das placas de vidro não estão lascadas, para evitar o vazamento da mistura do acrilamido quando a projeção do gel.
3. Prepare o empilhamento e as soluções de gel de resolução em dois tubos de 50ml separado cónico. Omita o tempted (TEMED) e persulfato de amónio a 10% (p/v) (APS), como eles são responsáveis pela polimerização do gel. Adicione-os imediatamente antes de lançar o gel.
   Nota: A percentagem final de acrilamida no gel influencia o perfil de separação das proteínas: normalmente, uma concentração final de 10% (v/v) de acrilamida serão suficiente para testar a pureza de uma preparação de vetor de vírus adeno-associados.
4. Misture delicadamente e agitando o tubo que contém os componentes do gel. Fazer não o vórtice, desde que a oxigenação excessiva pode prejudicar a polimerização.
5. Adicione TEMED e 10% (p/v) APS para a solução de gel de resolução. Misture e em seguida despeje o gel de titular até atingir 1-2cm abaixo do topo da placa de vidro pequeno.
6. Coloque uma camada de butanol saturado de água no topo da mistura de acrilamida. Isso garantirá a formação de uma superfície plana durante a polimerização. Não deixe o gel álcool por mais de 30 min pois isso irá desidratar o gel e prejudicar a sua função.
   Atenção: O Butanol é perigoso em caso de contacto com a pele. Também apresenta um risco de incêndio. Manuseie com cuidado.
7. Espere o gel para polimerizar e em seguida despeje o butanol. Dica: Verifique se a mistura de gel em excesso no tubo tem solidificado. Polimerização ocorre em menos de 20 min. Lave a superfície do gel com H₂O e depois seque-o com toalhas de papel, tomando cuidado para não perturbar a superfície do gel.
8. Adicionar TEMED e 10% (p/v) APS para o gel de empilhamento e despeje o gel no suporte do gel em cima do gel de separação.
9. Coloque o pente fornecido no gel. Execute esta ação com um movimento constante para evitar a formação de bolhas de ar no interior dos poços.
10. Aguarde pelo menos 20 min. para o gel a polimerizar. Dica: Verifique se o excesso de gel misture o tubo cônico tem solidificado.
11. Prepare as duas misturas (tabela 7) para tanto o primário e o secundário AAV vector fracções (etapas 3.5 e 3.6, respectivamente).

	Quantidade elevada	Baixa quantidade
Estoque de vetor de vírus adeno-associados	5 Μ l	1 Μ l
5 x tampão de amostra	3 Μ l	3 Μ l
H2O	7 Μ l	11 Μ l

Tabela 7: Composição das misturas amostra necessária para a coloração de prata.

12. Totalmente desnaturar as misturas de amostra por aquecimento durante 5 min à 95 ° C. Monte o tanque de electroforese, prestando atenção à orientação do eletrodo.
13. Encha o depósito com tampão de cátodo no interior do conjunto do elétrodo 1x e 1 x buffer de ânodo do lado de fora.
    Nota: Ânodo buffer pode ser reciclado a partir de execução para execução. Buffer de cátodo fresca sempre deve ser usado.
14. Remover o pente do gel e limpar os poços do gel com buffer de cátodo de 1x.
15. Carrega de 1 µ l de escada de proteína em um poço. Carrega as misturas de amostra em poços diferentes no mesmo gel (Figura 3). Funcione o gel em 50 V até as amostras inserir o gel de resolução. Em seguida aumente a tensão de 100 V até a frente do corante atinge o limite inferior do gel.
16. Extrair o gel cuidadosamente as chapas de vidro e usar a prata coloração kit (de acordo com instruções²⁶) as indicações do fabricante para visualizar as virais proteínas (VP1, VP2 e VP3 subunidades) que compõem o capsídeo do vírus adeno-associados, bem como para verificar se há possíveis contaminação de proteína (Figura 3).

Figura 3: avaliação da pureza de vetor usando SDS-PAGE e coloração prata. Usando um gel de SDS-Tricine, 5 µ l de várias preparações de vetor foram separados. As proteínas foram detectadas posteriormente pela coloração prata. Vetores são considerados puro quando VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa) e VP3 (60 kDa) são visíveis em um 1:1:10 proporção (faixa 1), sem fundo excessivo (pista 2) ou bandas inespecíficas (faixa 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

AAV9 foi considerada, até recentemente, para ser o mais eficaz sorotipo de vetor AAV no cruzando o BBB e transducing células do SNC, após a administração periférica. Foi conseguido um avanço significativo no projeto de capsídeo quando Deverman et al. relataram o uso de um método de seleção de capsídeo chamado Cre evolução de AAV-alvo baseados na recombinação (criar)¹⁷. Usando este método, eles identificaram um novo capsídeo, chamado PHP. B, que relataram como capaz de transduce a maioria dos astrócitos e neurônios em várias regiões do CNS, após a injeção sistêmica de¹⁷. Neste ponto, deve ser observou que mesmo que PHP. B fornece resultados positivos em camundongos C57/Bl6 (que era a tensão utilizada nas experiências de isolamento inicial), relatórios preliminares sugerem que sua eficácia pode variar de forma dependente da tensão. Mais experimentos verterá, sem dúvida, mais luz sobre esta questão³¹.

No entanto, apesar desses problemas, PHP. B oferece possibilidades excitantes para manipulação de gene não-invasiva no SNC de camundongos, incluindo experiências de terapia do gene de prova de conceito em modelos de doenças. Como tal, escolhemos avaliar a eficiência da expressão do transgene utilizando PHP. B contra o AAV9, que tem sido o vetor 'padrão ouro' para a transdução de CNS administração periférica desde 2009²a seguir. Para realizar uma comparação direta entre os dois serótipos, sob condições ideais para a expressão do transgene, usamos um genoma de sc configuração³². Ambos os vetores carregava o transgene para a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle do promotor frango onipresente β-actina (CBA). Camundongos C57/Bl6 fêmeas no dia pós-natal 42 (cerca de 20 g de peso) receberam uma dose de 1 x 10¹² vg por rato de qualquer scAAV2/PHP. B-CBA-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP. Vector administração foi realizada através de injeção de veia de cauda. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética do KU Leuven.

Postinjection de três semanas, os ratos foram submetidos a perfusão transcardial com PBS gelado, seguido de 4% (p/v) gelada paraformaldeído (PFA). Seus cérebros foram colhidos e submeteu-se ainda mais postfixation por uma incubação durante a noite no fixador mesmo, antes de transferir para 0,01% (p/v) at-azida/PBS para armazenamento até posterior análise. Depois, os cérebros foram seccionados usando um micrótomo vibratório e imuno-histoquímica foi realizada em 50 µm de seções espessas.

Para avaliar os níveis de expressão do transgene, seções foram coradas com anticorpos primários contra GFP (coelho anti-GFP), com deteção usando anticorpos secundarios conjugados a um corante fluorescente (anticoelho Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Medições de intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias [au]) confirmaram um aumento significativo na expressão de GFP quando um sc genoma e o PHP. Capsídeo B foram usados em relação ao AAV9. Foram observados aumentos na GFP no cérebro (2105 que 161 de ± vs 1441 ± 99 au; p = 0,0032), o cerebelo (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0,0032) e o tronco cerebral (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 UA; p = 0.0038) (Figura 4).

Figura 4: entrega sistêmica de scAAV2/PHP. B-CBA-GFP leva a uma alta expressão de GFP no SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 10¹² vg/mouse) foi administrado a camundongos C57/Bl6 de 6 semanas de idade através da injeção de veia de cauda. GFP foi detectado usando imuno-histoquímica na postinjection de 3 semanas de secções coronais do cérebro. (A) o encéfalo e (B) o cerebelo e tronco encefálico são mostrados. Barras de escala = 1 mm. (C) a quantificação das intensidades de fluorescência relativa foi realizada para determinar os níveis de sinal GFP alcançado com cada vetor (10 seções por rato; três ratos por grupo de vetor). Foi realizado um teste ANOVA One-Way, seguido de um Student bicaudal t-teste; os dados são expressos como média ± desvio-padrão; p < 0,01; au. unidades arbitrárias. pCapsid, usado para a produção de vetor de vírus adeno-associados, contém o gene rep do sorotipo 2 e o gene cap do sorotipo PHP. B ou AAV9, em conformidade. Esta figura foi modificada em Rincon et al.³². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A produção de vetores AAV recombinantes descrito aqui usa materiais e equipamentos comuns à maioria dos laboratórios de biologia molecular e instalações de cultura de células. Permite ao usuário obter vetores AAV puro, pré-clínicos da classe que podem ser usados para vários tipos de células e tecidos-alvo através de uma gama de aplicações in vitro e in vivo . Uma das maiores vantagens do presente protocolo, em relação aos outros (ou seja, com base em CsCl purificação), é o mais curto tempo de trabalho necessário. Vetores AAV Ready-to-use são obtidos em um máximo de 6 dias úteis após a inicial transfecção de células HEK293T.

Vários fatores podem influenciar negativamente o rendimento final ou a qualidade do vetor AAV. Pobre do transfection eficiência é uma das principais razões para um baixo rendimento viral³³. Uma recomendação importante é a utilização de células HEK293T isso não ter sido passado mais de 20 vezes e não têm uma confluência de célula superior a 90% no momento da transfecção²¹. Além disso, o método de transfeccao selecionado tem um grande impacto sobre os resultados. Este protocolo baseia-se na utilização de PEI. PEI é um polímero catiônico, com a capacidade para entregar o DNA exógeno para o núcleo da célula através da geração de complexos de polímero e de ácidos nucleicos, conhecido como polyplexes, que são aceites pelo celular e traficadas através de endossomos³⁴. PEI-baseado transfection é fácil e rápido de executar, em contraste com outros métodos amplamente utilizados, tais como a co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio³⁵. Também, o PEI-baseado transfection é muito mais barato quando comparado a outros métodos recentemente introduzidos, tais como o uso de lipídios catiônicos e mediada por ímã transfeccao³⁶.

A estratégia de purificação desempenha um papel fundamental no protocolo. Em comparação com outros métodos, baseados em iodixanol purificações tendem a conter uma percentagem mais elevada de partículas virais vazio (20%)²⁰. Isso é compensado, até certo ponto, pelo fato de que a purificação baseada em iodixanol rotineiramente resulta em preparações de vetor de vírus adeno-associados com um rácio de partícula-para-infectividade de menos de 100. Isto representa uma melhoria significativa em comparação com procedimentos convencionais baseados em CsCl, substancial perda de infecciosidade partícula for relatado³⁷. Outro método alternativo comum para purificar vetores AAV é baseado em cromatografia de purificação. No entanto, este método tem a grande desvantagem que uma coluna específica é necessária para cada capsídeo de vetor usado: por exemplo, enquanto AAV2 é classicamente isolado usando colunas de heparina, esta metodologia não funciona com AAV4 e AAV5, que não possuem ligação de heparina sites sobre seus capsids³⁸. Considerando que a purificação de cromatografia também é cara, baseada em iodixanol purificação é geralmente mais apropriada para laboratórios que desejam produzir lotes de alta qualidade de vetores AAV em uma pequena escala^{33,39, 40}. no entanto, para maximizar o rendimento final e a pureza do vetor, extremo cuidado é necessário quando fazendo do iodixanol. As várias fracções iodixanol devem ser transferidas para o tubo de ultracentrifugação usando uma pipeta Pasteur estéril, cuja ponta é tocar a parede do tubo: iodixanol devia ser expulso da pipeta lentamente e continuamente. Como as partículas do vetor se acumulam na camada de iodixanol 40%, cuidado deve ser tomado para garantir que não se misturam as interfaces gradientes²⁰. Finalmente, a fração que contém o vetor deve ser recuperada através da inserção de uma agulha em aço inoxidável com um calibre não superior a 20 G. Para maximizar a recuperação de vetor, a fração clara deve ser recuperada na sua totalidade. Durante esta etapa, o tempo é crítico. Para evitar comprometer a pureza da preparação, é essencial para parar a coleção antes de outras fases (contaminantes) do gradiente são coletados.

Diferenças do título obtidos vetor podem ser atribuídas também à capacidade intrínseca do vector para produzir partículas embaladas. Uma comparação entre diferentes sorotipos de vírus adeno-associados mostrou que alguns vetores AAV são mais difíceis de produzir em um título mais elevado do que outros (por exemplo, AAV2)⁴¹. Precipitação do vetor, durante a etapa do desalting, pode ser uma razão possível para um título inferior e facilmente prevenida evitando mais³³. Além disso, também é possível que a eficiência da purificação de baseados em gradiente iodixanol difere ligeiramente entre sorotipos e, portanto, discrepâncias do título obtido com sorotipos diferentes podem ser observadas⁴¹.

Finalmente, ele precisa ser salientado que, apesar de qPCR é um método muito preciso para quantificação de DNA alguns variabilidade inerente a esta técnica pode ser observada. Precisão na titulação depende, principalmente, a pipetagem precisa e adequada utilização do Vortex de todas as soluções. Para garantir o título mais preciso ler, o qPCR pode ser repetido independentemente, e a média dos valores obtidos. A escolha das primeiras demão apresentado neste protocolo baseia-se na sequência do promotor CBA localizado no plasmídeo pTransgene usado em nosso laboratório. O promotor do CBA é um forte promotor sintético que é amplamente utilizado no campo vetor para expressão de carro em vários tipos de célula. Ele incorpora vários elementos, incluindo o elemento inicial do realçador citomegalovírus (CMV); o promotor, primeiro exon e o primeiro intron do gene da CBA; e o aceitador da tala do gene de β-globina do coelho. No entanto, as primeiras demão podem ser projetadas para praticamente qualquer elemento localizado dentro da gaveta de expressão (incluindo o promotor, transgene e dos elementos reguladores). A comparação do título através de lotes também é possível, desde que as primeiras demão são usadas contra regiões comuns para os vetores em questão.

Em conclusão, este protocolo pode ser usado para produzir vetores de vírus adeno-associados com uma variedade de capsids, configurações de genoma, tipos de promotor e cargas do transgene. Isto permitirá que os usuários facilmente adaptar as características finais de seus vetores para melhor atender as necessidades de experimentais. No exemplo apresentado nos resultados da representante, o uso do PHP. Capsídeo B, que eficientemente atravessa o BBB, deu expressão gênica altamente eficiente no SNC, seguir cauda veia injeção³². A administração sistémica de vetores penetrante CNS tem vantagens consideráveis em termos de possíveis efeitos colaterais de^17,2,32. Uma possível alternativa à injeção periférica, evitando as advertências de técnicas invasivas, é entrega intratecal, que consiste em entrega do vetor AAV no fluido cerebrospinal. Esta rota de entrega é provada para ser eficaz, mostrando generalizada expressão do transgene através do CNS, menos efeitos fora do alvo em órgãos periféricos e baixos níveis de resposta imune⁴². No entanto, injeções intratecal são muito mais desafiador, que requerem habilidades técnicas mais elevadas do que a injeção de veia de cauda.

Desenvolvimento do capsídeo para refinar esta tecnologia será conduzido pelas oportunidades para o uso de vetor AAV em aplicações da terapia de gene. Tais abordagens oferecem possibilidades atraentes para tratar doenças do SNC atualmente incuráveis, tais como a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth, a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer¹⁸.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pCapsid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pHelper	Agilent	240071
Plasmid Plus maxi kit	Qiagen	12963
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104
AAV Helper-Free System	Agilent	240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Life technologies	11960-044	Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10500-064
GlutaMAX supplement	GIBCO	35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium	GIBCO	14190094
HEK293T cells	American Tissue Culture Collection	CRL3216	Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes	Greiner Cellstar	639160	15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers	VWR	10062-904
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966-2	PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution	Fisher Scientific	NC9821357	Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons	Fisher Scientific	11735423	Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes	Fisher Scientific	15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette	Sigma-Aldrich	Z627992	Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes	Beckman	361625
Benzonase (250 U/µL)	Sigma-Aldrich	E1014	Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter	Pall corporation	4614
Omnifix syringe (5 mL)	Braun	4617053V
Blunt syringe needle	Sigma Aldrich	Z261378	Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer	B. Braun	0082479E	Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Millipore	UFC910024	These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x)	Thermo Fisher	24040032	Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-374	Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL)	Promega	R6421
DNAse I (1 U/µL)	Fisher Scientific	EN0521
Proteinase K	Sigma-Aldrich	3115852001	Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)	Fisher Scientific	AB2000
Eppendorf microtube 3810x	Sigma-Aldrich	Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells	Roche	4729692001	White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film	Bio-Rad	msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678	Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade	Merck	648311	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose	Thermo Fisher	16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.3	Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G	Sigma-Aldrich	6104-58-1
Precision Plus prestained marker	Bio-Rad	1610374edu
1-Butanol	Sigma-Aldrich	B7906	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP	Synaptic Systems	132002	1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:1,000 dilution
Equipment	Company	Catalog number	Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge *	Hettich	1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge *	Beckmann Coulter	A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *	Beckmann Coulter	337901
Entris digital scale *	Sartorius	2202-1S
Warm water bath *			Set at 37 °C
Ice bucket *	VWR	10146-290	Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro *	Integra	156,400
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	606180	Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	607180	Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	760180	Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 *	Binder	9040-0038	Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E *	Labexchange	31324	Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler *	Bio-Rad	1861096
LightCycler 480 Instrument II *	Roche	5015278001
ThermoMixer *	Eppendorf	C 5382000015
Nanodrop *	ThermoFisher Scientific	ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell*	Bio-Rad	1658001FC	For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit	Sigma-Aldrich	PROTSIL1	High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R *	Eppendorf	B1_022628045	High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	606180	5 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	607180	25 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	760180	25 mL
Filter tips *	Greiner bio-one	750257	1250 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	738257	300 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	771257	10 µL
Ice bucket with lid *	VWR	10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *	VWR	181-0065
Pipetman P2	Gilson	F144801
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P1000	Gilson	F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.