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Resumo

São protocolos detalhados para ambos in vitro e na célula seletiva 2'-hidroxila acilação analisados por experiências de extensão (forma) da primeira demão para determinar a estrutura secundária das sequências pre-mRNA de interesse na presença de uma pequena molécula de RNA-direcionamento apresentada neste artigo.

Resumo

No processo de desenvolvimento de drogas de RNA-direcionamento de pequenas moléculas, elucidar as mudanças estruturais em suas interações com sequências de RNA alvo é desejado. Aqui oferecemos uma detalhada em vitro e na célula seletiva 2'-hidroxila acilação analisados pela extensão da primeira demão protocolo (forma) para estudar a mudança estrutural de RNA na presença de uma droga experimental para a atrofia muscular espinhal (SMA), sobrevivência de motor neuron (SMN)-C2 e no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2. Em forma in vitro, uma sequência de RNA de 140 nucleotídeos contendo SMN2 exon 7 é transcrito por T7 RNA polimerase, dobrada na presença de SMN-C2 e posteriormente modificada por um reagente de acilação leve 2'-OH, imidazolide de ácido 2-methylnicotinic (NAI). Este aduto de 2'-OH-NAI é mais sondado por um 32extensão da primeira demão P-etiquetadas e resolvido por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Por outro lado, 2'-OH acilação em forma na célula ocorre in situ com RNA celular SMN-C2 vinculado em pilhas vivas. A sequência de pre-mRNA do exon 7 no gene SMN2, juntamente com mutações induzida por forma a extensão da primeira demão, então foi amplificada por PCR e sujeitos a próxima geração sequenciamento. Comparando as duas metodologias, forma in vitro é um método mais econômico e não exige poder computacional para visualizar os resultados. No entanto, o modelo de SHAPE-derivado de RNA in vitro às vezes difere da estrutura secundária em um contexto de celular, provavelmente devido à perda de todas as interações com proteínas RNA-obrigatórias. Na célula forma não precisa de um material radioativo no local de trabalho e produz uma estrutura secundária mais precisa de RNA no contexto celular. Além disso, a forma na célula é geralmente aplicável para uma maior sequências de gama de RNA (~ 1.000 nucleotídeos) utilizando o sequenciamento de próxima geração, em comparação com in vitro da forma (~ 200 nucleotídeos) que geralmente se baseia na análise de página. No caso do exon 7 em SMN2 pre-mRNA, a in vitro e na célula forma derivada modelos de RNA são semelhantes entre si.

Introdução

Seletiva 2'-hidroxila acilação analisada pela extensão da primeira demão (SHAPE) é um método de medir a cinética de cada nucleotídeo em uma sequência de RNA de interesse e elucidação da estrutura secundária em single-nucleotide resolução1. Metodologias de forma, tanto em condições in vitro2,3,4 (RNA purificado em um sistema de buffer definido) e em5,de células de mamíferos vivos6, foram desenvolvidos para investigar o secundário estrutura de sequências de comprimento médio do RNA (tipicamente < 1.000 nucleotídeos para a forma na célula e < 200 nucleotídeos para a forma in vitro). É particularmente útil para avaliar alterações estruturais no receptor RNA mediante ligação a RNA-interagindo pequena molécula metabolitos2,4,7,8 e estudar ações mecanicistas de moléculas de RNA-direcionamento durante o desenvolvimento de drogas9,10.

RNA-direcionamento de fármacos recentemente chamou a atenção nos laboratórios acadêmicos e a indústria farmacêutica11,12 através de diferentes abordagens e estratégias de14,13,15 ,16. Exemplos recentes de pequenas moléculas de RNA-direcionamento para uso clínico incluem duas drogas experimentais estruturalmente distintas, LMI-07017 e18,RG-791619, para a atrofia muscular espinhal (SMA), que mostrou-se promissora resultados na fase de ensaios clínicos II20. Ambas as moléculas foram demonstrou à sobrevivência de alvo de motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA e regular o processo de emenda do SMN2 gene6,17,21. Temos demonstrado anteriormente a aplicação da in vitro e na célula forma um exame das mudanças estruturais na presença de um análogo de RG-7916 conhecido como SMN-C26alvo do RNA.

Em princípio, a forma mede a taxa de acilação de 2'-OH de cada nucleotídeo de uma sequência de RNA na presença de quantidades em excesso de um reagente de acilação Self têmpera de forma imparcial. O reagente de acilação não é estável em água, com uma meia-vida curta de (por exemplo, T1/2 = 17 s para anidrido de 1-metil-7-nitroisatoic; ou 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide de ácido 2-methylnicotinic, ou NAI)22 e insensibilidade à identidade da as bases de23. Isso resulta em uma acilação mais favorável dos grupos de bases flexíveis, que podem ser transformados em uma avaliação correcta da dinâmica de cada nucleotídeo 2'-OH. Especificamente, um nucleotídeo em um par de base é geralmente menos reativo do que um não pareado com um reagente modificando 2'-OH, tais como NAI e 1 M 7.

Olhando para a fonte do modelo de RNA e onde ocorre a acilação de 2'-OH, forma geralmente pode ser categorizada em forma in vitro e na célula. Em usos de vitro forma purificada T7 transcrito de RNA e não possui um contexto celular em projetos experimentais. Em forma na célula, a transcrição de modelo de RNA e a acilação de 2'-OH ocorrerem dentro de células vivas; Portanto, os resultados podem recapitular o modelo estrutural de RNA em um contexto celular. Na célula forma tem sido referida como vivo de forma para forma transportada em células vivas, na literatura24. Desde que esta experiência não é executada em um animal, nós denominado esta experiência como forma na célula para a exatidão.

As estratégias para a fase de extensão da primeira demão de forma in vitro e na célula também são diferentes. Em forma in vitro, a transcrição reversa para na posição 2'-OH acilação, na presença de Mg2 +. Uma extensão da primeira demão de 32P-rotulados, portanto, aparece como uma banda em eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a intensidade da banda é proporcional à taxa de acilação1. Em forma na célula, a transcrição reversa gera mutações aleatórias para o 2'-OH aduto posição na presença de Mn2 +. A taxa mutacional de cada nucleotídeo pode ser capturada no sequenciamento de próxima geração de profundidade, e a reatividade de forma em single-nucleotide resolução pode então ser calculada.

Um problema potencial para a forma na célula é a baixa relação sinal-ruído (isto é, a maioria dos grupos 2'-OH é inalterada, enquanto as sequências não modificadas ocupam a maioria da leitura na próxima geração sequenciamento). Recentemente, um método para enriquecer o 2'-OH modificado do RNA, referidos como vivo clique em forma (icSHAPE), foi desenvolvido pelo laboratório Chang25. Este método de enriquecimento pode ser vantajoso no estudo fracas moléculas pequenas tais como interações RNA, especialmente em um interrogatório de transcriptoma-largo.

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Protocolo

1. em forma de Vitro

Nota: O protocolo é modificado no protocolo publicado1.

  1. Preparar o modelo de RNA
    Nota: O modelo para a transcrição de T7 foi ordenado como sintético double-stranded DNA (dsDNA) e amplificado por qualquer inserção em um vetor de Escherichia coli que carrega um único par de sites de endonuclease de restrição EcoRI/BamHI, tais como pET28a, ou pelo PCR. O protocolo para amplificação por PCR é ilustrado abaixo.
    1. Misture o seguinte material: 50 μL de mestre PCR mix (ver Tabela de materiais), 2 μL para cada primeira demão em 10 μM (ver tabela 1 para sequências), 200 ng de dsDNA modelo em 2 μL e 3 μL de Dimetilsulfóxido (DMSO) e 41 μL de H2O. alíquota em dois PCR tubos (cada tubo contém 50 μL de mistura de reação).
    2. Configurar o termociclador da seguinte forma: fase 1) 95 ° C por 30 s; fase 2) 95 ° C por 20 s; fase 3) 56 ° C durante 20 s; fase 4) 72 ° C por 20 s; loop de fase 5) volta para a etapa 2 para 30 ciclos; fase 6) 72 ° C por 3 min; e a fase 7) infinita segurando a 4 ° C até o passo seguinte.
    3. Purificar o amplicon PCR por extracção de fatias do gel (veja Tabela de materiais e usar o protocolo do fabricante). Eluir o produto DNA com 35 μL de tampão Tris-EDTA (TE), contendo 10 mM Tris (pH 8.0) e 1 mM EDTA, para produzir um 0.1-0.5 μg/μL modelo. Normalize o modelo de DNA purificado em 0,10 μg/μL.
      Nota: Opcionalmente, a qualidade do modelo pode ser analisada em uma eletroforese em gel de agarose 1,8% com 0,10 μg de DNA. Espera-se uma única banda de DNA template desejado no gel.
    4. Configurar a reação de transcrição de T7 (volume total 40 μL) adicionando-se os seguintes materiais em um tubo PCR: 4 μL de 10 x 4 μL de ATP, 4 μL de CTP, 4 μL de GTP, 4 μL de UTP, 4 μL da enzima T7, amortecedor da reação (ver Tabela de materiais) , 4 μL de purificado PCR amplicons da etapa 1.1.3 (0,4 μg) e 12 μL de dietilo pyrocarbonate (DEPC)-água tratada. Misture por pipetagem e descer 4 x. Incube a 37 ° C para 4 – 16 h em um termociclador ou numa incubadora 37 ° C.
      Nota: Começa a configurar a etapa 1.1.6 enquanto a reação na etapa 1.1.4 está em curso.
    5. Adicionar 2 μL de DNase, misturar pipetando e descer de 4 x e incubar a 37 ° C durante 15 min. Mix com igual volume de 2 x Tris-borato-EDTA (TBE)-amortecedor da amostra de ureia (ver Tabela de materiais). Aquecer a 70 ° C por 3 min inactivar.
    6. Em um frasco livre de RNase, misturar 75 mL de solução de acrilamida/bisacrylamide 40% (29:1, consulte Tabela de materiais), 180,2 g de ureia e 50 mL de tampão de x TBE 10 (RNase-livres, consulte Tabela de materiais). Coloque a garrafa em um agitador orbital (250 rpm) até que todos os cristais de ureia são dissolvidos (pode levar até 2 h). Ajuste o volume para 500 mL com água tratada DEPC. Filtrar a solução com uma membrana de 0,2 μm (ver Tabela de materiais).
      Nota: Neste processo, evitar usando especulares e agitar-bar para evitar a contaminação de RNase. A solução pode ser armazenada a 4 ° C por até 1 ano.
    7. Limpe duas placas de vidro de electroforese de um tamanho adequado (16,5 x 24 cm) com água desionizada e 70% EtOH, usando um pedaço de papel a limpar. Alinhar as placas com um par de espaçadores de 2,0 mm (a placa com uma superfície siliconizada está enfrentando para dentro) e selar a borda das placas com fita adesiva. Dupla-fita o canto da placa para evitar fugas.
    8. Num copo, misture 200 mL de solução de acrilamida da etapa 1.1.6, 2,0 mL de solução de persulfato de amónio de 10% e 100 μL de tempted (TEMED) com uma ponta da pipeta RNase-livre por agitação rapidamente por 30 s. Tilt as placas em um pedaço de tampa de bancada e despeje a solução da gap das placas. Bata a placa para levantar as bolhas e colocar a placa plana na capa de bancada. Imediatamente inserir o pente e deixe o gel polimerizar pelo menos 1 h.
      Nota: Se o gel é para ser usado dentro no dia seguinte, encobri o topo do gel com um pedaço de papel-toalha e envoltório com uma parte maior de plástico. Coloque-o deitado horizontalmente a 4 ° C.
    9. Remova a fita e prenda a placa em um stand de electroforese. Retirar o pente e adicionar 1 adequada x TBE reserva no topo e no fundo do reservatório. Pre-funcione o gel por 30 min a 20 w.
      Nota: Opcionalmente, se o conteúdo do RNA desejado ~ 90% ou mais, um mini gel pode ser usado em substituição de um gel preparativa.
    10. Cada um dos poços de carregamento lave pipetando para cima e para baixo duas vezes com o líquido no reservatório. Adicione o RNA bruto da etapa 1.1.5 nos poços. Funcione o gel a 20 W até corante xileno cianol FF (luz azul) passa cerca de dois terços do comprimento do gel (~ 60 min).
      Nota: Certifique-se para carregar a não mais de um terço da altura do poço (se necessário, usar vários poços).
    11. Imergir o gel em 1 buffer de x TBE com 1:10,000 de diluição do cofre tingir (ver Tabela de materiais) em um recipiente grande o suficiente para o gel. Colocar o recipiente em um agitador orbital por 5 min a 80 rpm.
    12. Sob a luz UV, identificar a banda desejada do RNA e rapidamente cortar uma faixa fina do gel usando uma lâmina limpa. Coloque fatias de gel de 1 – 2 em um tubo de 1,7 mL.
    13. Recupere o RNA da fatia gel por eluição passiva. Adicione a mistura de eluição/precipitação adequada (~0.3 mL por fatia) para cada tubo: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS) na água tratada DEPC. Gire o tubo que contém o gel de splice(s) a 4 ° C, durante 16 h.
      Nota: Uma taxa de recuperação típica é ~ 75% nesta etapa. Para aumentar o rendimento, remover e recolher o eluente e adicionar o mesmo volume de tampão de eluição, Então repita este passo.
    14. Combine o eluente em um novo tubo de 1,7 mL. Adicionar 2,5 x gelada EtOH, inverter os tubos seis vezes para misturar o líquido e coloque os tubos a-80 ° C durante pelo menos 1 h.
    15. Centrifugar durante 10 minutos a 10.000 x g e 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem. Lave a pelota do RNA adicionando 80% EtOH (1 mL por tubo), vórtice durante 15 s e centrifugar durante 10 minutos a 10.000 x g e 4 ° C.
    16. Remover o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota do RNA por 5 min. Adicione 50 μL de água livre de RNase e misture pipetando acima e para baixo 10 vezes. Normalize a concentração de RNA para 0,10 μg/μL. Armazenar o RNA purificado a-80 ° C.
      Nota: Não seque em demasiado a pelota do RNA.
    17. Opcionalmente, para analisar a qualidade do RNA, diluir 1 μL (100 ng) do RNA de passo 1.1.16 em 5 μL de água e misturar com 5 μL de tampão, amostra 2 x TBE-ureia. Então, o calor a 70 ° C por 3 min e carga em um gel mini TBE-ureia de 6%.
      1. Funcione o gel em 180 V para h. 1 executar a coloração como feito na etapa 1.1.11. Visualize o gel com UV em um sistema da imagem latente. Uma única banda é esperada para o comprimento desejado.
  2. Preparando a 32cartilha P-etiquetado
    1. Configurar a reação misturando os seguintes materiais: 10 μL de γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, consulte Tabela de materiais), 2 μL de primer de transcrição reversa (RT) (100 μM, para ver de sequência tabela 1), 2 μL da quinase de polinucleotido 10 x T4 (PNK) amortecedor da reação, 1 μL de T4 PNK (ver Tabela de materiais) e 5 μL de água livre de RNase. Incube a 37 ° C, durante 1 h.
      Atenção: Proteção adequada é necessário passos 1,2-1,5 em um local de trabalho autorizado de materiais radioactivos.
    2. Calor-inativar por 20 min a 65 ° C. Adicione as amostras em uma coluna do desalting e centrifugar a 1.000 x g por 1 min. Misture o eluente com 25 μL de tampão de amostra 2x TBE-ureia. .
      Nota: Armazene o produto bruto rotulado a-20 º C se não deve imediatamente ser purificado.
    3. Execute um gel de acrilamida 10% a 20 W por 1h.
      Atenção: Carregar o 32cartilha P-rotulado de 1.2.1 pisar o gel e evitar sangramento a radioatividade no reservatório superior. Não foi possível carregar mais de um terço da altura do poço para garantir uma banda fina sobre o gel (usar vários poços, se necessário). O líquido do reservatório inferior pode ser altamente radioativo.
    4. Remover as placas de vidro da fita gel e colocar o gel em um pedaço de filme plástico. Dobre o envoltório plástico para cobrir o topo do gel para fazer um sanduíche estanque. Coloque o gel de sanduíche em uma tela de fósforo de tungstato de cálcio e expor com um instrumento de imagem. O gel novamente com luz regular para saber onde estão as bordas do gel da imagem.
    5. Use uma software de processamento de imagem para sobrepor as duas imagens. Alinhe o gel sobre a imagem impressa. Use uma lâmina de barbear fresca para cortar as bandas desejadas fora do gel. Coloque fatias de gel de 1 a 2 em um tubo de 1,7 mL.
      Nota: Certificar-se de que a imagem impressa tem o mesmo tamanho que o gel real. Verifique o alinhamento por imagem o gel sobra novamente após cortar a fatia de gel.
    6. Recupere o primer P-rotulado de 32seguindo as etapas 1.1.13 para 1.1.16. Leve 1,0 μL da solução num tubo de 0,4 mL e diluir a primeira demão com buffer de TE 1 x para obter a radioatividade de 1,0 μL em cpm de ~ 100.000. Armazene o purificado 32cartilha P-etiquetadas a-80 ° C até reação de modificação do RNA 2'-OH, mas por não mais que 4 semanas.
  3. Ligação de pequenas moléculas e modificação de 2'-OH do RNA
    1. Para preparar quatro amostras, adicione 8 pmol RNA em 32 μL de tampão, TE x 0,5 para um tubo de 1,7 mL, calor a 80 ° C por 2 min e snap-cool no gelo pelo menos 1 min.
      Nota: Use a seguinte equação para calcular o peso molecular aproximado de RNA: MW = (número de bases) x 340 Da.
    2. Adicione 8 μL de 5x dobradura mistura contendo 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM MgCl2e 500 mM de NaCl. Alíquota 9 μL da mistura em cada uma das quatro PCR RNA tubos e rotulá-las #1-#4. Adicionar 1 μL de 10% de DMSO no #1 tubo, 1 μL de solução concentrada de molécula pequena (10% de DMSO) em #2, 1 μL de solução diluída de molécula pequena (10% de DMSO) #3 e 1 μL de água em #4.
    3. Incube os tubos PCR a 37 ° C em um termociclador por 30 min.
    4. Bem antes da reação de modificação de 2'-OH, dilua 1 μL de solução NAI (2 M) com 3 μL de água tratada DEPC para produzir uma solução de trabalho de 0,5 M. Sem demora, adicione 1 μL de NAI trabalhando solução nos tubos de #1, #2 e #3 e 1 μL de 25% DMSO em #4. Incube a 37 ° C em um termociclador por 15 min.
    5. Adicione 100 μL de eluição/precipitação misturar (ver passo 1.1.13 para receita), 2 μL de glicogênio (15 mg/mL) e transferir todo o líquido em cada tubo PCR para um tubo de 1,7 mL. 0,34 ml de gelado 200-prova EtOH (volume de 3 x) em cada tubo. Mix vortexing para 5 s e lugar os tubos em um freezer-80 ° C durante pelo menos 1 h.
      Nota: Durante este período, inicie a criação do gel de sequenciamento deve ser usado na etapa 1.5.1.
    6. Centrifugar por 15 min em 14.000 x g e 4 ° C. Remova o sobrenadante sem perturbar a pelota do RNA. Lave a pelota do RNA adicionando 80% EtOH (0,5 mL por tubo), vórtice durante 15 s e centrifugar por 15 min em 20.000 x g e 4 ° C. Remova o sobrenadante novamente.
      Nota: Opcionalmente, use um contador Geiger para garantir a pelota radioativa no tubo de retenção.
    7. Secar ao ar livre a pelota do RNA por 5 min. Adicione 9 μL de água livre de RNase e misture pipetando acima e para baixo 10 vezes.
      Nota: Não seque em demasiado a pelota do RNA. Precipitação de todos é esperada para ser dissolvida no final desta etapa.
  4. Extensão de preparação e da primeira demão do marcador
    1. Transferir o RNA modificado em 4 novos tubos de PCR e a etiqueta #1-#4 como anteriormente. Adicionar 2 pmol controle RNA em 7 μL de água tratada DEPC para 4 tubos PCR adicionais e a etiqueta #5-#8. Adicione 2 μL de radiolabeled do primer (etapa 1.2.6) em todos os oito tubos. Calor para recozer a 65 ° C por 5 min e, em seguida, imediatamente esfriar até 4 ° C no termociclador.
    2. Adicionar 4 μL de 5 x tampão RT (ver Tabela de materiais), 1 μL de ditiotreitol (DTT, 0.1 M) e 1 μL dNTP Mix (10 mM cada) para cada um dos oito tubos PCR.
    3. Adicione 2 μL de DEPC tratada H2O para tubos #1 – #4. Adicione 4 μL de ddATP (5 mM), 4 μL de ddTTP (5 mM) e 4 μL de ddCTP (5 mM) para tubos #5-#7, respectivamente. Adicione 1 μL de ddGTP (5 mM) e 3 μL de água tratada DEPC para tubo #8. Pipete quatro vezes para misturar.
    4. Aqueça a 52 ° C por 1 min no termociclador. Adicionar 1 μL de transcriptase reversa (ver Tabela de materiais), em seguida, misture pipetando e descer quatro vezes. Incube a reação a 52 ° C por 20 min.
    5. Adicione 1 μL de 5 M de NaOH em cada um dos tubos para hidrolisar o RNA. Aqueça os tubos a 95 ° C por 5 min.
    6. Adicionar 5 μL de 1 M de HCl e repita a precipitação do álcool etílico (etapas 1.3.5 e 1.3.6), exceto omitir o glicogênio e transferência de líquidos.
      Nota: Omitindo o passo 1.4.6 resultados em uma região de indefinição no meio do gel, conhecido como o"sal".
    7. Secar o sedimento de DNA por 5 min. Adicione 10 μL de H2O e 10 μL de 2x TBE-ureia amostra amortecedor do carregamento e pipeta acima e para baixo 10 vezes para redissolver. Calor a 70 ° C por 5 min. Coloque os tubos no gelo antes do carregamento para o gel.
  5. Análise de página
    1. Para preparar um gel de sequenciamento de poliacrilamida 8%, siga os passos 1.1.6 para 1.1.10 com as seguintes modificações: use 100 mL de solução de acrilamida/bisacrylamide de 40% (29:1) para preparar uma solução de acrilamida 8% e usar placas de vidro de gel de sequenciamento (por exemplo, 46 x 57 cm) com um espaçador de 0,4 mm.
    2. Carrega 10 μL da amostra da etapa 1.4.7. Funcione o gel em 65 W por 2 h ou até que o corante de fundo atinge 3/4 do gel.
      Nota: Guarde o resto das amostras a-80 ° C para repetir se necessário.
    3. Remova a placa de vidro siliconizado superior removendo o espaçador e inserir delicadamente uma espátula. Coloque um pedaço grande de papel de filtro para cobrir o gel e pressione suavemente para permitir que o gel cumprir o papel de filtro. A partir da extremidade inferior, levante o papel de filtro e retire o gel da placa de vidro juntos.
    4. Coloque o gel junto com o papel de filtro em um pedaço de plástico que é grande o suficiente para cobrir o gel todo (papel de filtro virado para cima). Transferi o sanduíche do envoltório de papel de filtro/gel/plástico para um gel seco com o lado do papel de filtro virado para baixo.
      Atenção: Para evitar a contaminação de material radioativa, use 3 a 4 mais pedaços grande de papel de filtro entre o sanduíche de gel e gel seco.
    5. Seca o gel a 70 ° C, durante 1 h com um vácuo. Transferi o sanduíche de gel em uma fita de tela de armazenamento de fósforo foto-branqueada. Expor a radioatividade do gel para a tela de 4-16 h.
    6. Coloque a tela de armazenamento de fósforo em um dispositivo de imagem e digitalização com resolução média (~ 30 min).
      Nota: Se um artefato de sorriso, como está presente na imagem de gel, use software corrigindo (por exemplo, SAFA) para processar a imagem para uma qualidade publicável. Tenha em mente que a lane de marcador padrão é mais do que as pistas de modificação de 2'-OH 1 nucleotídeo.

2. na célula forma

  1. Projeto da primeira demão
    Nota: Ao contrário de forma in vitro, na célula forma não precisa desenhar uma gaveta de expressão. No entanto, um conjunto ideal da primeira demão deve ser usado e deve ser avaliado antes de forma experimentar.
    1. Gere pelo menos três pares de cartilha original por uma ferramenta de design de primeira demão BLAST-based (por exemplo, Primer-BLAST). Para estudar pre-mRNA em células humanas, selecione o genoma humano (não transcriptome) como um banco de dados de referência em Primer par especificidade verificando parâmetros. Escolha o tamanho do amplicon na faixa de 200-1.000-pares de base (PB).
    2. Extrair o DNA genômico de ~ 106 células de interesse com um método baseado em coluna de rotação com o tratamento do RNase A e protease K (ver Tabela de materiais e usar o protocolo do fabricante). Normalize o DNA genômico purificado no buffer de TE 0,1 μg/μL.
    3. Teste PCR com o protocolo realizado nas etapas 1.1.1 e 1.1.2.
      Nota: O conjunto desejado da primeira demão deve produzir uma única banda em um gel de agarose 1,8%.
  2. Preparação e modificação de 2'-OH da pilha
    Nota: Para aumentar a abundância de pre-mRNA do interesse, um minigene com a sequência correta sob promotor de citomegalovírus (CMV) para expressão constitutiva é transfectada nas células do hospedeiro.
    1. Pré-aquecer o meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1 x antibiótico mistura em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) a 37 ° C. Células de 293T semente a confluência 50% 24 h antes da transfecção em meio de cultura. Mudar o meio em 2% FBS em DMEM sem antibióticos ~ 1 h antes do transfection.
    2. Adicione 10 μg de plasmídeo minigene em 100 μL de mídia soro reduzida (ver Tabela de materiais) em 1 bem de uma placa de 96 poços. Adicionar a solução de subir e descer quatro vezes para misturar.
    3. Adicionar 40 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) em 100 μL de mídia reduzida soro em outro poço da placa. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
    4. Adicione a solução inteira do plasmídeo para a suspensão de reagente de transfeccao. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incube a temperatura ambiente por 30 min.
    5. Adicionar o DNA inteiro / mistura de reagente de transfeccao gota a gota sobre a superfície do meio em todo o prato. Incube a 37 ° C, durante 6-12 h.
    6. Aspire o meio e delicadamente, lave uma vez com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4, sem CaCl2 e MgCl2, consulte a Tabela de materiais). Trypsinize as células com 3 mL de solução de tripsina. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
    7. Bata o prato suavemente para dissociar as células do fundo do prato. Neutralize a tripsina com 6 mL de meio de cultura. Centrifugar a 300 x g durante 4 min e remova o meio.
    8. Ressuspender as células de6 ~ 10 para cada amostra em 199 μL do meio de reação (1% FBS em DMEM) e transferir a suspensão de célula em uma placa de 96 poços. Incube as celulas com 1 μL de solução de trabalho de composto ou 1 μL de DMSO em todos os três controles por 30 min a 37 ° C.
      Nota: Três amostras de controle devem ser incluídas: controle de DMSO com NAI, RNA desnaturado com NAI NAI e controle negativo.
    9. Adicione 10 μL de 2m NAI para cada amostra, exceto para o controle de desnaturação (DC) RNA e controles negativos NAI. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incube a 37 ° C por 15 min. Agite suavemente as placas para re-suspender as células cada 5 min.
    10. Transferi as células nos tubos de 1,7 mL e centrifugar 400 x g por 2 min sem demora. Remova o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
    11. 0,4 ml de tiocianato de guanidínio (ver Tabela de materiais). Vórtice por 15 s para homogeneizar. Incube as amostras à temperatura ambiente por 5 min.
      Nota: As amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até prosseguir para o próximo passo.
  3. Extração de RNA
    1. Adicione 0,2 mL de clorofórmio para cada uma das amostras guanidínio tiocianato homogeneizado. Vórtice de 15 s. Incubar à temperatura ambiente por 2 min.
    2. Centrifugue por 5 min em 12.000 x g e 4 ° C. A camada aquosa incolor superior contém RNA. Transferência de ~ 380 μL de solução aquosa para um novo tubo de 1,7 mL.
      Atenção: Não perturbe a interfase para evitar contaminação.
    3. Adicionar 1,5 x volume de EtOH (~ 570 μL). Vórtice por 15 s para misturar.
    4. Transferir 600 μL de mistura de RNA em uma rotação-coluna de isolamento de RNA (ver Tabela de materiais). Centrifugar a 12.000 x g durante 15 s. descarte o eluente. Repita esta etapa para passar através de todo o líquido para a mesma coluna de rotação.
    5. Lavar a coluna com 0,35 mL de tampão de RW1 (ver Tabela de materiais) girando por 15 s. Adicionar 80 μL de DNase RNase-livre eu no buffer RDD (ver Tabela de materiais). Incube a temperatura ambiente por 20 min.
      Nota: É fundamental para eliminar a contaminação de DNA todas.
    6. Posteriormente, lavar a coluna com 0,35 mL de tampão de RW1 e 0,6 mL de tampão de x RPE 2 (ver Tabela de materiais) por fiação por 15 s em cada etapa. Seque a coluna por centrifugação a coluna de rotação com um tubo vazio coleção a 12.000 x g por 1 min.
    7. Adicione 32 μL de água livre de RNase ao centro da coluna. Incubar durante 1 min. centrifugar a 12.000 x g por 30 s para obter ~ 30 μL de solução de RNA purificada. Coloca as amostras a-20 º C durante o processamento da amostra desnaturada.
  4. Preparação de controle desnaturada do RNA
    1. Lugar 30 µ l do RNA da amostra para DC em um tubo de plástico de 1,7 mL no gelo. Adicionar 50 μL de formamida e 15 μL de tampão de DC contendo 300 mM HEPES (pH 8.0) e 25 mM EDTA no tubo.
    2. Calor para desnaturar o RNA a 95 ° C por 1 min. rapidamente adicionar 5 μL de solução NAI (2 M), então o filme duas vezes para misturar e coloque o tubo de volta para o bloco de aquecimento. Incubar a 95 ° C por um adicional 1 min, em seguida, imediatamente, colocar o tubo no gelo.
    3. Adicione 0,4 mL de tiocianato de guanidínio. Repita as etapas 2.3.1–2.3.4.
    4. Lavar a coluna com 0,6 mL de tampão de x RPE 2 (ver Tabela de materiais) por fiação por 15 s em cada etapa. Seque a coluna por centrifugação a coluna de rotação com um tubo vazio coleção a 12.000 x g por 1 min.
    5. Adicione 32 μL de água livre de RNase ao centro da coluna. Incubar durante 1 min. centrifugar a 12.000 x g por 30 s para obter ~ 30 μL de solução de DC RNA recuperada.
  5. Extensão da primeira demão
    1. Normalize a solução de RNA de 2.3.7 e 2.4.5 em 0.5 μg/μL com água livre de RNase. Na hora prepare 30mm MnCl2 solução de MnCl2∙4H pó de O2.
    2. Transferi 9 μL de solução de RNA para cada amostra em uma tira PCR. Adicione 1 μL de 10mm dNTP e 1 μL de primer de gene-específico 2 μM (GSP) em cada tubo. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incubar a 65 ° C por 5 min em um termociclador e colocar no gelo para > 1 min.
      Nota: Alternativamente, 1 μL de uma nonamer aleatório pode ser usado em substituição do SPG.
    3. Em cada tubo PCR, adicione uma mistura de 2 μL de 10x buffer de RT (ver Tabela de materiais), 4 μL de 30mm MnCl2e 2 μL de 100 mM DTT. Pipetar e descer 4 x para misturar. Incube a 42 ° C por 2 min.
    4. Adicionar 1 μL de transcriptase reversa (ver Tabela de materiais). Pipetar e descer 4 x para misturar. Incube a 42 ° C em um termociclador para 3h.
  6. Preparação de biblioteca e sequenciamento de próxima geração
    1. Configurar uma reação de PCR adicionando 1 μL de DNA polimerase, 5 μL de 10x buffer de DNA polimerase (ver Tabela de materiais), 2 μL de DMSO, 1,5 μL de cada um dos primers (10 μM), 34 μL de H2O e 5 μL de cDNA da etapa 2.5.4.
    2. Configurar o termociclador da seguinte forma: fase 1) 95 ° C por 2 min; fase 2) 95 ° C por 30 s; fase 3) 60 ° C por 30 s; fase 4) 68 ° C por 30 s; loop de fase 5) volta para a etapa 2 para 30 ciclos; fase 6) 68 ° C por 3 min; e a fase 7) infinita segurando a 4 ° C até o passo seguinte.
    3. Purifica o amplicon usando gel de agarose 1,8%.
      Nota: A banda PCR deve aparecer como uma única banda no gel.
    4. Construa a biblioteca usando padrão fragmentação e métodos de ligadura estabelecidos na literatura6,26.
    5. Sequência em um equipamento de sequenciamento de próxima geração, usando 1 x 75 único-extremidade leituras para gerar aproximadamente 10 milhões lê por amostra.
    6. Analisar os resultados usando o software SuperFold e ShapeMapper pacotes desenvolvidos por semanas as grupo26.

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Resultados

Demonstramos anteriormente que um RNA splicing modulador, SMN-C2, interage com motivo AGGAAG no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2 e usado de forma a avaliar as alterações estruturais do RNA na presença de SMN-C26. O sítio de ligação do SMN-C2 é distinto do FDA-aprovado antisentido do oligonucleotide (ASO) para SMA, nusinersen, que se liga e bloqueia o silenciador emenda intrônicas (ISS) na intron 727,28

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Discussão

Em forma in vitro, é fundamental usar modelo de RNA homogêneo de alta qualidade. Transcrição de T7, no entanto, muitas vezes produz sequências heterogêneas36. Especialmente, sequências com ± 1 nucleotídeo no 3'-terminal com rendimentos não negligenciável36 são geralmente difícil de ser removido pela purificação do gel de polyacrylamide. Modelo de RNA heterogêneo pode resultar em mais de um conjunto do sinal no gel de sequenciamento perfil do produto extensã...

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Divulgações

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi feito possível pela subvenção R01 NIH (NS094721, K.A.J.).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA oligonucleotideIDTgBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kitTakara740609.50
MegaScript T7 transcription kitThermo FisherAM1333Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated waterThermo Fisher750023
2x TBE-urea sample bufferThermo FisherLC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)Bio-Rad1610146
10x TBE bufferThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter UnitThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe dyeThermo FisherS33102
6% TBE-urea mini-gelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying ScreenGE HealthcareRPN1669calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screenMolecular DynamicsBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermo Fisher18090010Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP set (5 mM)SigmaGE27-2045-01
large filter paperWhatman1001-917
Gel dryerHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34Addgene72287
Heat inactivated FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS without Ca/MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini columnQiagen74104Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase SetQiagen79254Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamideThermo FisherAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
random nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway columnThermo FisherAM10070for desalting purpose

Referências

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