Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar a sobrevivência em uma única célula base e identificar variáveis que predizem significativamente a morte celular.

Resumo

Ensaios de citotoxicidade padrão, que exigem a coleção de lisados ou células fixas em vários pontos de tempo, limitaram a sensibilidade e a capacidade para avaliar os fatores que influenciam o destino neuronal. Estes ensaios exigem a observação de populações isoladas de células em pontos de tempo discreto. Como resultado, as células individuais não podem ser seguidas prospectivamente ao longo do tempo, limitando severamente a capacidade de discriminar se subcellular eventos, tais como formação de partitura ou mislocalization de proteína, são drivers patogênicos da doença, respostas homeostáticas, ou mera coincidência fenômenos. Microscopia de célula única longitudinal supera estas limitações, permitindo que o pesquisador determinar diferenças na sobrevivência entre populações e desenhar relações causais com sensibilidade melhorada. Este guia de vídeo irá delinear um fluxo de trabalho representativo para experimentos de medição única célula sobrevivência de neurônios corticais preliminares rato, expressando uma proteína fluorescente. O espectador vai aprender a alcançar alta eficiência transfections, coletar e processar imagens, permitindo o acompanhamento prospectivo de células individuais e comparar a sobrevivência relativa das populações neuronais usando análise de riscos proporcionais de Cox.

Introdução

Morte celular anormal é um fator determinante em muitas doenças, incluindo câncer, neurodegeneração e derrame¹. Ensaios de robustos e sensíveis para a morte celular são essenciais para a caracterização desses distúrbios, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estender ou reduzir a sobrevivência celular. Atualmente existem dezenas de técnicas para medir a morte celular, diretamente ou através de de marcadores de substituto². Por exemplo, morte celular pode ser avaliado visualmente com a ajuda de corantes vitais que mancham seletivamente células mortas ou vivas³, ou monitorando o aparecimento de específicos fosfolipídios da membrana plasmática,^4,5,6 . Medições de componentes intracelulares ou metabolitos celulares lançados na mídia sob dissolução celular também podem ser usadas como proxies para célula morte^7,8. Alternativamente, a viabilidade celular pode ser aproximada por avaliar a atividade metabólica^9,10. Embora esses métodos fornecem meios rápidos de avaliação de sobrevivência celular, eles não são sem ressalvas. Cada técnica observa a cultura como uma única população, tornando-se impossível distinguir entre células individuais e as suas taxas únicas de sobrevivência. Além disso, tais ensaios baseados em população são incapazes de medir fatores que podem ser importantes para a morte celular, incluindo a morfologia celular, expressão da proteína ou localização. Em muitos casos, estes ensaios são limitados a pontos de tempo discreto, em não permitem a observação contínua de células ao longo do tempo.

Em contraste, a microscopia de fluorescência longitudinal é uma metodologia altamente flexível que diretamente e continuamente monitora o risco de morte em uma única célula base¹¹. Em breve, a microscopia de fluorescência longitudinal permite que milhares de células individuais a serem controladas em intervalos regulares durante longos períodos de tempo, permitindo que as determinações precisas de morte celular e os fatores que melhorar ou suprimem a morte celular. Em sua base, o método envolve a transfecção transiente ou transdução de células com vetores codificação de proteínas fluorescentes. Um fiduciário exclusivo é então estabelecido, e a posição de cada célula transfectada em relação a este marco permite que o usuário para a imagem e a faixa de células individuais ao longo de horas, dias ou semanas. Quando essas imagens são exibidas em sequência, morte celular é marcado por mudanças características em fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular, permitindo a atribuição de um tempo de morte para cada célula. A taxa calculada de morte, determinado pela função do perigo, pode então ser quantitativamente comparada entre condições ou relacionada para selecionar características celulares usando univariada ou de análise de riscos proporcionais de Cox multivariada¹². Juntos, essas abordagens permitem a discriminação precisa e objectiva das taxas de morte celular em populações celulares e a identificação das variáveis que predizem significativamente a morte celular e/ou sobrevivência (Figura 1).

Embora esse método pode ser usado para monitorar a sobrevivência em qualquer tipo de célula pós mitóticas em uma variedade de formatos de chapeamento, este protocolo irá descrever condições para transfecting e imaging neurônios corticais de rato cultivados em uma placa de 96 poços.

Protocolo

Animal vertebrado todo o trabalho foi aprovado pelo Comité sobre o uso e cuidado dos animais, da Universidade de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos são cuidadosamente planejados para minimizar o número de animais sacrificados. Grávida fêmea tipo selvagem (WT), ratos de longa Evans não-transgênicos (Rattus norvegicus) são alojados individualmente em câmaras equipadas com enriquecimento ambiental e cuidadas pela unidade de medicina Animal de laboratório (ULAM) da Universidade de Michigan, em acordo com o guia de NIH-suportado para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os ratos foram mantidos em rotina de habitação para tão pouco tempo quanto possível antes da eutanásia, consistente com as recomendações das orientações sobre a eutanásia da associação americana de medicina veterinária e da Universidade de Michigan métodos de eutanásia por Diretrizes da espécie.

1. material preparação

1. Dissecar neurônios corticais de embrionário dia que 19 – 20 filhotes e cultura rato neurônios corticais em 0,5 x 10⁶ células por mililitro na poli-D-lisina placas revestidas para 4 dias em vitro, conforme descrito anteriormente no^{1413,, 15,16,17,18,19}.
2. Preparar o plasmídeo de DNA de interesse, seguindo as etapas descritas por um isolamento de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas kit (veja a Tabela de materiais). Quantificar o DNA resultante usando um espectrofotômetro.
3. In vitro dia 4 (DIV4), filtro de alíquota, esterilizar e incube as seguintes mídias em 37 ° c: 6 mL reduzidos meios de soro (RSM; ex.., OptiMEM), 25 mL neuronal mídia basal (NBM), 40 mL NBKY (NBM + ácido cinurênico de 1 mM + 10 mM MgCl₂, ajustado a um pH de 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronal da pilha suplemento Cultura + 1 x suplemento de L-glutamina + 1 x caneta Strep).
   Nota: Volumes listados são suficientes para transfecting uma placa de 96 poços. Consulte a Tabela de materiais para reagentes específicos.

2. a transfeccao de neurônios corticais de rato

1. Modificar o fornecido folha de Transfeccao de exemplo (ver arquivo suplementar 1) ajustando o tipo de placa, o mapa de placa, o número de DNAs, concentração de DNA e o número de poços (caixas verdes).
   Nota: O DNA total soma de 0,2 µ g por bem, independentemente de se uma (ex.., DNA A) ou múltiplos (por exemplo, DNA-B e C) construções de DNA são adicionadas a cada poço.
2. Trabalhar a partir da planilha, combine a quantidade adequada de RSM e DNA em um tubo. Combine a quantidade adequada de RSM e transfecção reagente (por exemplo, Lipofectamine) em um tubo separado.
3. Incube a temperatura ambiente (RT) por 5 min.
4. Combine os DNA e a transfeccao reagente RSM as misturas e incubar a RT por 20 min.
5. Durante esta etapa de incubação, usar uma pipeta multicanal e bebedouros de plástico estéril para lavar as células 2x com 100 µ l por alvéolo de NBM. Reservar os meios condicionados (CM) e armazenar a 37 ° C. Para ver este e todos os passos a seguir, ter cuidado para minimizar a quantidade de tempo que os neurônios são expostos ao ar.
6. Remova a mídia NBM e substituir com 100 µ l por alvéolo de NBKY.
7. Depois de 20 min, adicione 50 µ l da mistura de DNA/reagente de transfeccao gota a gota a cada poço.
8. Incubar as células com os complexos de DNA/reagente de transfeccao por 20 min a 37 ° C.
9. Lave 2 x com NBKY e substitua com 100 µ l de CM e 100 µ l de NBC por bem.
10. Células transfectadas com sucesso devem ser visíveis por microscopia de fluorescência dentro 16 – 24 h do transfection. Para medir a eficiência, use um microscópio fluorescente para verificar o transfeccao após incubação durante a noite a 37 ° C.
    Nota: Esta técnica resulta em uma eficiência global de Transfeccao de 5 a 10%.

3. imagem latente

1. Colocar a placa em um microscópio fluorescente com um palco motorizado e estabelecer um fiduciário (por exemplo, uma marca na parte inferior da placa) que permitirá que o usuário alinhe a placa de cada vez que é fotografada. Salve uma imagem neste fiduciária para referência.
2. Navegue até um campo de interesse e anote as coordenadas x-y, em relação ao fiduciário.
3. Concentre-se em células transfectadas, expressando uma etiqueta fluorescente.
4. Ter imagens fluorescentes no respectivo canal ou canais (por exemplo, proteína fluorescente proteína fluorescente vermelha [RFP], verde [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), manualmente ou de forma automatizada. Ao tomar várias imagens em intervalos regularmente espaçados, uma montagem do poço pode ser montada durante o processamento de imagem (consulte a etapa 4).
   Nota: O espaçamento depende de vários fatores, incluindo a ampliação, a óptica do microscópio e o tamanho do detector. Em geral, o óptico espaçamento entre imagens adjacentes será entre 90 a 95% do tamanho de cada imagem individual, para permitir um pequeno grau de sobreposição de imagem e apresentam o alinhamento.
5. Repita este processo tantas vezes quantas forem necessárias, alinhando para o fiduciário original cada vez. Para análise de sobrevivência, de imagem ocorre cada 6 – 24 h, dependendo do tipo de célula e a finalidade do experimento.

4. processamento de imagem

Nota: Aquisição de imagem, na sequência de uma série de etapas de processamento são necessários antes da análise de imagem. Estes incluem, mas não estão limitados a, costura, empilhamento e subtração de fundo (Figura 1). O objetivo dessas etapas é produzir uma pilha de imagem, ou séries temporais, em que as células são claramente discerníveis de seus antecedentes e fáceis de seguir sobre vários pontos de tempo. Uma macro dedicada de FIJI (Image_Processing.ijm, ver arquivo suplementar 2), executa costura básica, empilhamento e subtração de fundo. Uma explicação de cada etapa e os parâmetros a considerar ao realizar processamento de imagem é fornecida na seção de discussão.

1. Ajuste os dados brutos ou entrada de diretório para coincidir com a formatação, mostrado na Figura 2.
2. Se os pontos de tempo não são contíguos (i.e., T1, T2, T3), renomear essas pastas para que eles sejam. Esta etapa é fundamental para assegurar que a macro Image_Processing não funcionar durante o empilhamento.
3. Clique duas vezes no ícone para abrir o programa, em seguida, clique e arraste a macro Image_Processing para a barra de Fiji Fiji. Isto irá abrir a macro dentro Fiji.
4. Ajuste linhas 2-7 da macro Image_Processing para especificar o diretório de entrada que contém imagens, o diretório de saída desejada para imagens costuradas e empilhados, o número de momentos de imagem, número de canais fluorescentes e formato da placa.
5. Determine a ordem em que as imagens foram adquiridas. Para testar isso, costure manualmente uma montagem de imagens em FIJI por manobras para Plugins menu drop-down | Costura | Grade/coleção costura. Ajuste os parâmetros dentro dos menus dropdown tipo e ordem até que uma imagem com precisão costurada é produzida.
6. Ajuste as variáveis GRID_TYPE e STITCH_ORDER nas linhas 8 e 9 de Image_Processing macro para coincidir com essas seleções.
7. Especifica o número de imagens por bem, ajustando a linha 10 na macro Image_Processing .
   Nota: Para uma montagem de imagens de 2 x 2, esta linha leria DIM = 2.
8. Se a subtração de fundo é necessária, ajustar a linha 14 na macro Image_Processing para BGSUB = true.
9. Defina o raio de bola rolando, ajustando a linha 15 na macro Image_Processing .
   Nota: Para obter melhores resultados, definir o raio pelo menos o diâmetro o maior objeto de primeiro plano na imagem.
10. Clique em executar para iniciar a macro Image_Processing . Uma vez iniciado, Image_Processing avançará automaticamente através de costura, empilhamento e subtração de fundo.

5. marcar a morte celular

Nota: Consulte a seção de discussão para obter mais informações sobre a pontuação morte celular e dados de censurando.

1. Localize as pilhas de imagem produzidas pelo script Image_Processing . Abri-las em FIJI.
2. Use a ferramenta de ponto dentro FIJI rotular individualmente cada célula com um número. Tecla t após cada ponto irá adicionar o identificador da célula para o Gerenciador de ROI (região de interesse).
   Nota: Os identificadores podem ser visualizados clicando as Rótulos e Mostrar todas as caixas de seleção no Gerenciador de ROI.
3. Progresso através de momentos em cada pilha de imagem e registro o commit quando cada célula morre ou precisa ser censurado no arquivo Survival_spreadsheet.csv (ver arquivo suplementar 3).
   1. Cada célula ocupa uma única linha na planilha, onde um identificador exclusivo (ID) para cada célula consiste de seu correspondente bem e número ROI dentro tão bem. tp_death é o último ponto de tempo, que observa-se uma célula de estar vivo, enquanto time_death representa o tempo real da morte em horas. Para cada célula, estes dados de entrada. É fundamental para manter esta estrutura para posterior análise utilizando de sobrevivência. R (ver 4 de arquivo suplementar).
      Nota: Os critérios para determinar a morte celular são cruciais e podem variar dependendo do tipo de célula. Três critérios principais são usados na identificação de neurônios mortos^11,20 (Figura 3): perda da intensidade de fluorescência (por exemplo, neurônio 1 a 69 h), arredondamento do corpo celular (por exemplo, 2 neurônio a 188 h) e a perda do axônio integridade ou blebbing (por exemplo, 2 neurônio a 188 h).
4. Registre o status de censor da célula na última coluna.
   Nota: Aqui, devido à forma peculiar como censurar é tratada por R, censurou as células são marcadas por 0, enquanto as células sem censura são marcadas por 1. Observe que todas as células que vivem para o último ponto do tempo são censuradas e, portanto, marcadas como 0.

6. realização de Cox proporcional perigos, análise e visualização de resultados

1. Se necessário, baixe studio R em https://cran.r-project.org/mirrors.html.
2. Abra o studio R e clique duas vezes no ícone para a sobrevivência de . R script.
3. Coloque o cursor na linha 2 de sobrevivência . R e clique no botão executar na janela principal do studio R para carregar a biblioteca de sobrevivência.
4. Altere a linha 5 da sobrevivência . R script para coincidir com o local do arquivo Survival_spreadsheet.csv. Clique em executar para carregar os dados de sobrevivência como um dataframe.
5. Destacar linhas 8 e 9 e clique no botão executar na janela de console R studio para realizar análise de riscos proporcionais de Cox. Resultados e estatísticas de saída aparecem na janela do console do studio R.
6. Destaca linhas 12-16 de sobrevivência . R e clique no botão executar para produzir um risco cumulativo de trama de morte, que será exibido na guia parcelas no studio R. Este arquivo pode ser salvo, clicando no botão Exportar acima o enredo.
7. Se é desejável para plotar os dados de sobrevivência como uma curva de Kaplan-Meier, destaca linhas 19 a 24 de de sobrevivência. R e aperte o botão executar .

Resultados

Usando o procedimento de transfeccao descrito aqui, DIV4 neurônios corticais de rato foram transfectados com um plasmídeo codificação da proteína fluorescente mApple. A partir do pós-transfection 24 h, células foram fotografadas por microscopia de fluorescência cada 24 h durante 10 dias consecutivos. As imagens resultantes foram organizadas conforme indicado na Figura 2, em seguida, costuradas, empilhadas e marcou para a morte celular (

Discussão

Aqui, é apresentada a metodologia para monitorar diretamente a sobrevivência neuronal em uma base de célula única. Em contraste com os tradicionais ensaios para a morte celular que são limitados a pontos de tempo discreto e populações inteiras de células, este método permite a avaliação contínua de uma variedade de fatores tais como a morfologia celular, expressão da proteína ou localização, e pode determinar como cada fator influencia a sobrevivência celular de forma prospectiva.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876