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Resumo

O objetivo do presente protocolo é rotular, enriquecer e identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa como um lisado celular ou homogeneizado de tecido. Este método utiliza aspectos únicos da biologia CK2 para essa finalidade.

Resumo

O estudo das relações de quinase-substrato é essencial para uma compreensão completa das funções de enzimas e suas metas a jusante em Estados fisiológicos e patológicos. CK2 é uma quinase serina/treonina evolutivamente conservada com uma lista crescente de centenas de substratos envolvidos em vários processos celulares. Devido a suas propriedades pleiotrópicos, identificando e caracterizando um conjunto abrangente de substratos CK2 tem sido particularmente desafiador e continua a ser um obstáculo no estudo desta importante enzima. Para responder a este desafio, criámos uma estratégia experimental versátil que permite o enriquecimento de alvo e identificação de substratos de CK2 putativos. Este protocolo aproveita a único dual co especificidade de CK2 permitindo lisado thiophosphorylation específica de seus substratos em uma célula ou tecido. Estas proteínas de substrato são posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por espectrometria de massa de tandem/cromatografia líquida (LC-MS/MS). Temos anteriormente usado essa abordagem para identificar com sucesso CK2 substratos de Drosophila ovários e aqui nós estendemos a aplicação do presente protocolo para células de glioblastoma humano, ilustrando a capacidade de adaptação desse método para investigar a papéis biológicos deste quinase em vários organismos modelo e sistemas experimentais.

Introdução

Quinase de proteína é componentes-chave de cascatas de transdução de sinal. Fosforilação de proteínas de substrato por estas enzimas elicia respostas biológicas que regulam eventos críticos, controlando a divisão celular, metabolismo e diferenciação, entre outros. CK2 é uma quinase serina/treonina ubiquitously expressa, acidófilo que é conservada do fermento aos seres humanos e que tem um papel importante em muitos processos celulares, variando de regulamento transcriptional a progressão do ciclo celular a apoptose1 ,2,3. A enzima é uma heterotetramer composta por dois α catalítico (ou α') subunidades e dois de subunidades reguladoras β4. Além de ser altamente pleiotrópicos, CK2 exibe dois outras incomuns características que complicam a sua análise, ou seja, atividade constitutiva5 e especificidade de substrato co dupla6. Esta última Propriedade dota CK2 com a capacidade de usar o GTP, bem como ATP por fosforilação de proteínas de substrato.

Exclusão genética das subunidades catalíticas ou regulamentares da CK2 em camundongos resulta em embrionária letalidade indicando que ele tem um papel crucial durante o desenvolvimento e organogênese7,8. CK2 também é overexpressed em vários tipos de câncer e, portanto, representa um promissor alvo terapêutico9,10,11. Com efeito, inibidores específicos dessa atividade de quinase CK2 alvo estão atualmente sob investigação por este propósito12,13,14. Enquanto a inibição da CK2 é uma opção viável, dada a sua natureza pleiotrópicos, alternativa e talvez a abordagem mais racional seria alvo de substratos CK2 críticos que sustentam a progressão de certos tipos de câncer. Portanto, o abrangente identificação e caracterização das proteínas de substrato CK2 seria um benefício significativo para elucidar as funções específicas deste quinase dentro de um determinado tipo de tecido ou tumor.

Aqui, descrevemos um método bioquímico versátil para identificar substratos CK2 de uma amostra biológica complexa como uma célula ou tecido lisado. Este protocolo aproveita a especificidade de substrato co dual de CK2 pelo uso do análogo de GTP GTPγS (guanosina 5'-[γ-thio]triphosphate) que não podem usar outras cinases endógenas. Efetivamente, isso permite que a quinase de "rotular" seus substratos dentro desta amostra para posterior isolamento e identificação.

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Protocolo

Nota: Certifique-se que os materiais necessários estão disponíveis e devidamente preparados (ver Tabela de materiais).

1. preparação

  1. Lyse mecanicamente a amostra de tecido (1-2 mg de tecido em 100 µ l de tampão de Lise, tabela 1) ou cultura de células (placa de 10 cm que é confluente de 80-90% em 350 µ l de tampão de Lise), com o objetivo de coletar um total de 900 µ l de amostra para o experimento. Note que este volume é em ligeiro excesso do que é necessário para o experimento descrito abaixo.
  2. Gire para baixo as amostras por centrifugação a 17.500 x g durante 3 minutos a 4 ° C. Após a conclusão, transferi 270 µ l do sobrenadante para cada um dos três novos tubos de microcentrifuga 1,7 mL. Haverá aproximadamente 90 µ l restantes. Remova 40 µ l para ser usado como um "controle de entrada" e coloque em um tubo de novo. Coloque todas as amostras no gelo.

2. quinase: thiophosphorylation e alquilação

  1. Rotular os três tubos contendo 270 µ l da seguinte forma: "quinase rxn", "Só GTPγS", e "PNBM (p-nitrobezyl mesilato) só". Prepare as reações da quinase.
    1. Para o tubo "quinase rxn", adicione 2,7 µ l (equivalente a 1.350 U) de CK2 e, em seguida, adicione 2,7 µ l de 2,5 mM GTPγS.
    2. Para o tubo "Só GTPγS", adicione 2,7 µ l de 2,5 mM GTPγS e adicione 2,7 µ l de tampão de Lise.
    3. Para o tubo "Só PNBM", adicione 5,4 µ l de tampão de Lise. Filme de todos os tubos para misturar e coloque imediatamente no gelo.
  2. Incube a todos os três tubos por 1 min em um banho de água de 30 ° C. Após incubação, adicione 13,5 µ l de 12 mg/mL PNBM para todos os três tubos. Invertido para misturar as amostras. Incube as amostras à temperatura ambiente durante 1 h.
  3. Depois de iniciar a incubação no passo 2.2, prepare as colunas do desalting tão logo possíveis, pois o processo leva aproximadamente 45 min.

3. preparação de dessalinização colunas

  1. Inicialmente prepare colunas (3 para este experimento de exemplo), invertendo-se cada coluna várias vezes para re-suspender o Sephadex G-25 resina no buffer de armazenamento. Permitir que a resina de anexar cada coluna a um carrinho de grampo e deixá-lo sentar-se sem ser perturbado por aproximadamente 5 min.
  2. Após a liquidação da resina Sephadex G-25, remova as tampas de parte superior e inferior da coluna para permitir que o buffer de armazenamento de drenagem por gravidade e ter um tubo colocado sob a abertura do fundo para coletar o escoamento para descarte.
  3. Quandoo buffer de armazenamento, adicione aproximadamente 2,7 mL de tampão de Lise, a fim de equilibrar as colunas. Coletar o escoamento e descarte. Repeti 3 vezes. Após o equilíbrio final, as colunas estão prontas para etapa 4.1.

4. remoção de PNBM

  1. Após a incubação de 1 h (passo 2.2) e preparação de coluna (etapa 3) estão completas, aplicam-se as amostras para as colunas. Etiquete cada coluna como segue: "quinase rxn", "Só GTPγS" e "Só PNBM". Carrega todos de cada amostra para sua respectiva coluna. Recolher e descartar o escoamento.
  2. Lave as amostras adicionando 420 µ l de tampão de Lise para cada coluna. Permitir que o tampão de Lise filtrar a coluna e coletar o escoamento para descarte. Após esta etapa de lavagem, coloque os tubos na posição para coleta de amostras.
  3. Eluir amostras adicionando 500 µ l de tampão de Lise para cada coluna. Colete o escoamento que agora contém thiophosphorylated e substratos de CK2 alquilados.

5. imunoprecipitação: Parte I

  1. Prepare amostras para a imunoprecipitação por µ l 80 removendo primeiro para uma amostra de "controle de entrada de eluição" de cada um dos respectivos elutions ("quinase rxn", "Só GTPγS" e "Só PNBM"), coletados na etapa 4.3. Após a remoção de 80 µ l de cada amostra, haverá cerca de 420 µ l, permanecendo por amostra.
    1. Dividi cada amostra em 2 tubos contendo 200 µ l. Etiquete cada respectivo tubo: "quinase rxn antitiofosfato ester", "quinase rxn IgG", "Éster de antitiofosfato GTPγS", "GTPγS IgG", "Éster de antitiofosfato PNBM" e "PNBM IgG".
  2. Adicione 2,8 µ g de anticorpo antitiofosfato éster cada um dos tubos antitiofosfato éster-etiquetadas e 2,8 µ g do isotipo anticorpo de controle para cada um dos tubos de IgG-rotulados. Coloque os tubos em rotacao a 4 ° C por 2 h.
  3. Começa a preparação do grânulo de A/G de proteína durante o último 15 min de incubação na etapa 5.2 h 2.

6. preparação de grânulo de agarose A/G de proteína

  1. Brevemente o vórtice o tubo de armazenamento para assegurar grânulos são completamente re-suspenso. Cortar a extremidade de um P200 ponta da pipeta usando uma lâmina de barbear limpa para aumentar o medidor de tamanho. Pipetar 100 µ l do chorume grânulo por imunoprecipitação em um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL. Para este exemplo, são necessários um total de 6 tubos.
  2. Centrifugar os tubos a 17.500 x g por 1 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante e descarte. Re-suspenda as contas em 200 µ l de tampão de Lise e brevemente vórtice. Repetir a centrifugação e lavar passos 3 vezes.
  3. Após a lavagem final, coloque as contas no gelo até a incubação na etapa 5.2 está completa.

7. imunoprecipitação: Parte II

  1. Após a incubação de 2h de passo 5.2, spin para baixo as amostras a 17.500 x g durante 3 min a 4 ° C. Após centrifugação adicione 200 µ l de cada amostra para os tubos com os grânulos lavados. Coloque os tubos em rotacao a 4 ° C, durante 1 h.
  2. Após a incubação de 1 h, centrifugar os tubos a 17.500 x g por 1 min a 4 ° C. Em seguida remover 40 µ l do sobrenadante de cada amostra e salve como um controle de"esgotamento" (total de 6 tubos). Remova o restante do líquido sobrenadante e descarte. Tome cuidado para não perturbar os grânulos.
  3. Lave as amostras adicionando-se 200 µ l de tampão de Lise e num Vortex brevemente. Centrifugar a 17.500 x g por 1 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante e descarte. Repita a lavagem e girar passos 3 vezes. Tome cuidado para não perturbar os grânulos durante essas etapas.
  4. Depois de concluir as etapas de lavagem, adicione 50 µ l de tampão de amostra x 2 para cada amostra contendo grânulos. Para todas as outras amostras, adicionar 8 µ l de 6 x amortecedor da amostra: "controle de entrada", "controles de entrada de eluição" e "controles de esgotamento".
  5. Uma vez que a reserva é adicionada aos tubos, pipetar acima e para baixo para misturar e aquecer todas as amostras a 95 ° C por 5 min antes de prosseguir com o SDS-PAGE.

8. análise/validação dos resultados

  1. Valide a alquilação e bem sucedida CK2 dependente thiophosphorylation.
    1. Para determinar a eficácia da thiophosphorylation mediada por CK2 no passo 2.2, execute SDS-PAGE e mancha ocidental por 15-20 µ l de "eluição controles de entrada" coletados na etapa 5.1 em um gel de poliacrilamida de 12,5% em execução.
    2. Sonda de membranas com os seguintes anticorpos: antitiofosfato éster, anti-CK2α e anti-GAPDH (ou outro controle de carregamento apropriado). Se essa etapa foi bem sucedida, um sinal de éster de antitiofosfato reforçada deve ser aparente na faixa "quinase rxn" em comparação com as outras duas pistas (Figura 2).
  2. Visualizar enriquecidos substratos putativos de CK2 e determinar a identidade da proteína.
    1. Para avaliar se as etapas de imunoprecipitação foram bem sucedidas, execute 25-30 µ l das amostras eluída dos grânulos na etapa 7.4 em um gel de poliacrilamida de 12,5% separados. Garantir que todo o equipamento está limpo e usar luvas o tempo todo durante essa etapa para minimizar a contaminação.
    2. Manche o gel com Coomassie blue para visualizar proteínas enriquecidas de vários estágios do protocolo experimental (Figura 3). Usando lâminas novas, cuidadosamente faixas originais de impostos especiais de consumo apresentam na faixa "quinase rxn antitiofosfato éster IP", observando seus pesos moleculares aproximados.
    3. Submeta essas bandas para identificação de proteínas por espectrometria de massa de tandem/cromatografia líquida (LC-MS/MS) (Figura 4). Se os anticorpos contra as proteínas identificadas estão disponíveis, confirmar os resultados da espectrometria de massa por SDS-PAGE e immunoblotting de entrada, esgotado, e frações IP coletados durante o curso do protocolo (Figura 4).

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Resultados

Um diagrama esquemático do procedimento experimental é fornecido na Figura 1. A base subjacente da técnica é a capacidade incomum de CK2 usar GTP para transferência de grupo de fosforilo. Adição de exógenos CK2 holoenzima, juntamente com o análogo de GTP, GTPγS, para um lisado celular resulta em thiophosphorylation de substratos endógenos de CK2. Tratamento subsequente do lisado com o alquilantes reagente p- nitrobenzil mesilato (PNBM) ger...

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Discussão

Aqui, descrevemos um método relativamente simples e bioquímico para identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa. Os passos críticos do presente protocolo são baseados nas propriedades enzimáticas incomuns de CK2 e incluem thiophosphorylation CK2 dependente das proteínas de substrato específico usando GTPγS e sua subsequente imunoprecipitação e identificação. Com estes resultados, nós Demonstramos a utilidade e versatilidade desta abordagem como temos agora apli...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte por uma subvenção da Comunidade Universal do realce de pesquisa do departamento da saúde de Pensilvânia para T.I.S.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mg/mL PNBMAbcamab13891040.5 µL
2.5 mM GTPγSSigma-AldrichG8634-1MG5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-322331:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibodyAbcamab227581:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibodyAbcamab92570Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºCThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-Free Protease InhibitorRoche11836170001
Lysis BufferSee recipe belowSee recipe below30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control)Cell Signaling Technology2729S Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap ColumnGE Healthcare28-9180-103 columns
Protein A/G Plus Agarose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003600 µL
Recombinant human CK2 holoenzymeNew England BiolabsP6010S2.7 µL
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cellsATCCCRL-1690
Water bath pre-set to 30ºCShel LabH20 Bath Series Model# SWB15

Referências

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