Modelo de Mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão Cerebral

Resumo

Para investigar a fisiopatologia do AVC, é criado um modelo do rato de isquémia-reperfusão cerebral. Nós distalmente ligate da artéria cerebral média direita e artéria carótida comum direita e restaurar o fluxo sanguíneo após 10 ou 40 min de isquemia.

Resumo

Neste estudo, um modelo de mouse de oclusão de artéria cerebral média (MCA) é empregado para estudar a isquémia-reperfusão cerebral. Um modelo do rato reprodutível e confiável é útil para investigar a fisiopatologia da isquémia-reperfusão cerebral e determinar potenciais estratégias terapêuticas para pacientes com acidente vascular cerebral. Variações na anatomia do círculo de Willis de C57BL/6 ratos afeta seu volume de infarto após lesão cerebral induzida a isquemia. Estudos têm indicado que oclusão distal do MCA (MCAO) pode superar esse problema e resultar em um tamanho de infarto estável. Neste estudo, podemos estabelecer um modelo de mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão cerebral através da interrupção do fluxo sanguíneo para o MCA certo. Nós distalmente ligate a MCA direita e artéria carótida comum direita (CCA) e restaurar o fluxo sanguíneo após um determinado período de isquemia. Esta lesão de isquemia-reperfusão induz um infarto de tamanho estável e um déficit comportamental. Células imunitárias periféricas infiltrar o cérebro isquêmico no prazo de 24 h infiltração. Além disso, a perda neuronal na área cortical é menor por um longo período de reperfusão. Portanto, este modelo de dois vasos oclusão é apropriado para investigar a resposta imune e recuperação neuronal durante o período de reperfusão após isquemia cerebral.

Introdução

O modelo do rato de isquémia-reperfusão cerebral é uma das abordagens experimentais mais amplamente utilizadas para investigar a fisiopatologia da induzida por isquemia cerebral lesão¹. Porque isquémia-reperfusão cerebral ativa o sistema imunológico periférico, células imunitárias periféricas infiltrarem no cérebro isquêmico e causam dano neuronal². Assim, um modelo de mouse confiável e reprodutível que imita a isquémia-reperfusão cerebral é necessário para compreender a fisiopatologia do acidente vascular cerebral.

C57Bl/6J (B6) ratos são a estirpe mais comumente usada em experimentos de curso porque eles facilmente podem ser manipulados geneticamente. Estão disponíveis dois modelos comuns de MCAO/reperfusão que imitam a condição de isquémia-reperfusão cerebral. O primeiro é o modelo do filamento intraluminal de MCAO proximal, onde um filamento de silício-revestido é empregado para por via intravascular, obstruir o fluxo de sangue na MCA; o filamento de oclusão posteriormente é removido para restaurar o fluxo de sangue³. Uma duração curta de oclusão resulta em uma lesão da região subcortical, Considerando que uma maior duração da oclusão provoca infartos nas áreas corticais e subcorticais. O segundo modelo é o modelo de ligadura de MCAO distal, que envolve a ligadura extravascular do MCA e CCA para reduzir o fluxo de sangue através da MCA, após o qual o fluxo sanguíneo é restaurado através da remoção da sutura e aneurisma clip⁴. Neste modelo, um infarto é causado nas áreas corticais e a taxa de mortalidade é baixa. Porque a ligadura do modelo MCAO/reperfusão requer craniectomia para expor o site do MCA distal, o site pode ser facilmente confirmado, e analisar se o fluxo de sangue na MCA distal é rompido durante o procedimento é simples.

B6 ratos apresentam consideráveis variações na anatomia de seu círculo de Willis; Isto pode afetar o volume de infarto cerebral de isquémia-reperfusão^5,6,7a seguir. Atualmente, este problema pode ser superado através da ligadura do distal MCA⁸. Neste estudo, podemos estabelecer um método para obstruindo o fluxo sanguíneo do MCA e permitindo a reperfusão após um período pré-determinado de isquemia. Dois vasos de oclusão do modelo de isquémia-reperfusão cerebral induz isquemia transitória do território MCA através da ligadura do MCA bem distal e certo CCA, com fluxo de sangue restaurado após um determinado período de isquemia. Este modelo MCAO/reperfusão induz um infarto de tamanho estável, uma massa de células do sistema imunológico cérebro infiltrando no cérebro isquêmico e um déficit comportamental após isquémia-reperfusão cerebral⁴.

Protocolo

O cuidado animal institucional e comissões de utilização da Academia Sinica e Universidade de medicina de Taipei aprovaram este protocolo para o uso de animais experimentais.

1. modelo MCAO/reperfusão

1. Fornece os ratos com livre acesso à água e comida até a cirurgia.
2. Autoclave a cirúrgica ferramentas e limpar a mesa de cirurgia e equipamentos utilizando etanol a 70%. Use uma máscara cirúrgica e luvas estéreis. Use um esterilizador de grânulo seco para esterilizar os instrumentos cirúrgicos se múltiplas cirurgias do mouse serão realizadas em um experimento.
3. Anestesiar um rato de 8 a 12 semanas de idade (massa: 25 – 30 g) usando 0.8% hidrato de cloral, através de uma injeção intraperitoneal. Certifique-se que o mouse anestesiado não tem um reflexo de pedal (como os testes com uma pitada de dedo firme) após o anesthetization.
4. Pomada de uso veterinário para evitar ressecamento do olho para o mouse enquanto ele está sob anestesia.
5. Use um sistema de pressão não-invasiva para monitorar a pressão de sangue do rato.
6. Use um sistema de monitorização fisiológico para monitorar sua temperatura retal e gasometria arterial. Manter a temperatura do corpo em 36,5 ± 0,5 ° C.
7. Injecte por via subcutânea o mouse com um antibiótico profilático (cefazolina 25mg/kg)⁸.
8. Posicione o mouse na posição supina na rampa de aquecimento.
9. Use tosquiadeiras elétricas para expor a pele por raspar o pelo do rato na região ventral do pescoço, bem como na região entre o olho direito e o ouvido direito.
10. Use creme de depilação para limpar a pele do corpo do rato e desinfectar o local cirúrgico alternando scrbus com povidione-iodo e etanol a 70%.
11. Use tesoura de íris para cortar uma incisão de 1 cm de comprimento da linha média do pescoço.
12. Use pinça íris para dissecar cuidadosamente o CCA livre de nervos vago sem causar danos físicos.
13. Use as suturas de seda 5-0 para isolar o CCA.
14. Faça uma incisão de 0,3 cm no couro cabeludo no ponto médio entre o olho direito e o ouvido direito.
15. Use micro-tesouras para cortar o músculo temporalis para expor o osso zigomático e esquamosal.
16. Sob um microscópio estéreo de dissecação, use um microdrill para criar um furo de 2 mm de diâmetro diretamente sobre o MCA distal do lado direito.
17. Ligar o porta-malas a MCA distal do lado direito usando uma sutura de 10-0.
18. Ocluir o CCA lado direito usando um clipe de aneurisma não-traumática.
19. Depois de 10 ou 40 min de isquemia, remova os clips de aneurisma e sutura para restaurar o fluxo sanguíneo para a MCA e CCA.
20. Use um clipe de sutura para selar a incisão de pele na cabeça.
21. Sele as incisões na pele do colo do útero usando uma única sutura seguida, fechando a pele do pescoço com sutura ou grampo⁹.
22. Injecte por via subcutânea buprenorfina (0,1 mg/kg) para alívio de dor⁹.
23. Manter a temperatura do corpo do rato a 36,5 ± 0,5 ° C na rampa de aquecimento até recuperou totalmente da anestesia. Não retornam o animal que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente. Não abandone o animal até que ele recupere a consciência suficiente.
24. Posicione o mouse no ringue autoclavados para que livremente pode acessar água e comida depois que ele se recuperou totalmente.

2. coloração com cloreto de 2,3,5-triphenyltetrazolium

1. Anestesia o mouse com hidrato de cloral 0,8% através de uma injeção intraperitoneal.
2. Use tesoura operacional para decapitar o animal.
3. Expor o crânio usando uma tesoura de íris para fazer uma incisão na pele da cabeça.
4. Use tesoura manual para cortar anterior do osso frontal.
5. Use tesoura de íris para cortar o crânio ao longo da sutura sagital.
6. Use um osso rongeur para empurrar de lado frontal e osso parietal e expor o cérebro.
7. Use o fórceps de íris para dissecar o cérebro.
8. Use uma matriz de cérebro de rato e lâminas de barbear para obter fatias coronais de 2 mm.
9. Manche as fatias do cérebro durante 10 minutos a 37 ° C, com cloreto de 2,3,5-triphenyltetrazolium de 2% (TTC) em tampão fosfato salino de 1x.
10. Lavar o cérebro 2 x com formol a 10%.
11. Conserte o cérebro em formol a 10% em temperatura ambiente por 24 h.

3. a medição do tamanho do infarto

1. Organizar as seções sobre uma lâmina de plástico limpo e orientar as seções de rostral ao caudal.
2. Digitalize o slide usando um scanner. Coloque uma régua métrica e certifique-se que é visível na imagem digitalizada. Vire o slide e digitalizar o lado reverso.
3. Calcule a área de infarto de cada seção utilizando o software ImageJ.
   1. Abra o arquivo de imagem e configurar a escala da imagem.
   2. Use a seleção à mão livre para selecionar a área de infarto.
   3. Use as regiões de Gerenciador de interesse (ROI) para medir a área de interesse.
4. Soma das áreas de infarto para cada seção e multiplicar o resultado pela espessura de corte para estimar o volume total de infarto.

4. análise estatística

1. Use o GraphPad Prism 6 para determinar a significância estatística com Student t-teste.
   Nota: As barras de erro na barra de gráficos representam erros-padrão da média (SEMs).
2. Uso G * poder 3.1 para calcular o tamanho de amostra adequado e realizar uma análise de poder¹⁰.

Resultados

Este procedimento MCAO/reperfusão produziu um enfarte cortical nas imediações do MCA certo e causou um déficit comportamental. Diferentes graus de isquemia induzida por infarto volume (figura 1AB) e perda neuronal (Figura 1D) foram criados no córtex cerebral da área MCA certo através de um aumento na duração da ligadura. Esta lesão MCAO/reperfusão diminuiu a atividade locomotora do ani...

Discussão

O modelo de rato MCAO/reperfusão é um modelo animal, comumente empregado para imitar a isquemia transitória em seres humanos. Este modelo animal pode ser aplicado para as cepas de camundongos transgênicos e nocaute para investigar a fisiopatologia do acidente vascular cerebral. Várias etapas do protocolo são especialmente críticas. (1) o microdrill deve ser usado com cuidado quando criando um buraco no crânio, com ação inadequada facilmente causando sangramento do MCA. (2) o MCA não deve ser danificado, e sang...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone rongeur	Diener		Friedman
Buprenorphine	Sigma	B-044
Cefazolin	Sigma	1097603
Chloral hydrate	Sigma	C8383
Dissection microscope	Nikon	SMZ-745
Electric clippers	Petpro
10% formalin	Sigma	F5304
Germinator dry bead sterilizer	Braintree Scientific
Iris Forceps	Karl Klappenecker		10 cm
Iris Scissors	Diener		9 cm
Iris Scissors STR	Karl Klappenecker		11 cm
Microdrill	Stoelting	FOREEDOM K.1070
Micro-scissors-Vannas	HEISS	H-4240	blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrix	World Precision Instruments
Non-invasive blood pressure system	Muromachi	MK-2000ST
Operating Scissors STR	Karl Klappenecker		14 cm
Physiological Monitoring System	Harvard Apparatus
Razor blades	Ever-Ready
Stoelting Rodent Warmers	Stoelting	53810	Heating pad
Suture clip	Stoelting
Tweezers	IDEALTEK		No.3
Vetbond	3M	15672	Surgical glue
10-0 suture	UNIK	NT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877