Ressonância magnética avaliação dos tumores de bexiga murino induzida por substância cancerígena

Resumo

Tumores de bexiga murino são induzidas com carcinógeno nitrosamina N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Geração de tumor de bexiga é heterogênea; Portanto, uma avaliação correcta da carga do tumor é necessária antes de randomização para tratamento experimental. Aqui nós apresentamos um protocolo de MRI, rápido e confiável para avaliar o estágio e o tamanho do tumor.

Resumo

Modelos de tumor murino de bexiga são críticos para a avaliação de novas opções terapêuticas. Tumores de bexiga induzidas com N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) carcinógeno nitrosamina (BBN) são vantajosos sobre modelos baseados em linha de celular porque eles estreitamente replicar os perfis genômicos de tumores humanos, e, ao contrário dos modelos de célula e xenografts, eles fornecem um boa oportunidade para o estudo de imunoterapias. No entanto, a geração de tumor de bexiga é heterogênea; Portanto, uma avaliação correcta da carga do tumor é necessária antes de randomização para tratamento experimental. Descrito aqui é um modelo do rato BBN e protocolo para avaliar a bexiga câncer tumor fardo na vivo usando uma sequência rápida e confiável de ressonância magnética (RM) (FISP verdadeiro). Este método é simples e confiável porque, ao contrário de ultra-som, senhor independe do operador e permite o processamento de imagem de pós aquisição direta e revisão. Análise de regiões de interesse ao longo da parede da bexiga e tumor usando imagens axiais da bexiga, permitem o cálculo da área de parede e tumor de bexiga. Esta medida se correlaciona com o ex vivo peso da bexiga (r_s= 0,37, p = 0,009) e estágio do tumor (p = 0.0003). Em conclusão, BBN gera heterogêneos tumores que são ideais para avaliação de imunoterapias, e MRI podem rapidamente e confiantemente avaliar a carga do tumor antes da randomização de braços de tratamento experimental.

Introdução

Câncer de bexiga é o quinto mais comum de câncer em geral, responsável por cerca de 80.000 novos casos e 16.000 mortes nos Estados Unidos em 2017¹. Após cerca de 30 anos sem avanços significativos no tratamento sistêmico do câncer de bexiga², recentes ensaios de inibidor de ponto de verificação anti-PD-1 e anti-PD-L1 demonstraram respostas emocionantes e ocasionalmente duráveis em pacientes com avançado carcinoma urotelial^3,4,5. No entanto, apenas cerca de 20% dos pacientes mostram uma resposta objetiva para estes tratamentos e mais estudos são necessários para expandir o uso eficaz da imunoterapia em pacientes com câncer de bexiga.

Modelos de câncer de bexiga murino são ferramentas essenciais na avaliação pré-clínica de novos tratamentos,^6,7. A fim de controlar para o tamanho do tumor quando randomizar ratos para diferentes tratamentos, fardo de tumor deve ser avaliado e controlado entre os grupos de tratamento. Estudos anteriores usaram ultra-som ou bioluminescência para avaliar ortotópico celular baseado em linha de bexiga câncer modelos^8,9,10,11. No entanto, ambas as técnicas apresentam várias desvantagens. Medições de ultra-som podem ser influenciadas por habilidades do operador e faltam características tridimensionais e alta resolução espacial. Métodos de bioluminescência só podem fornecer avaliação semi-quantitativa das células do tumor e não permitem a visualização da bexiga anatomia e morfologia. Além disso, a bioluminescência só pode ser usada com os modelos de linha de base celular, que expressam genes bioluminescentes em ratos sem pelos ou mouses com jalecos brancos.

Ressonância magnética (RM), por outro lado, oferece flexibilidade original na aquisição de imagens de alta resolução anatômicas, exibindo uma ampla gama de contraste de tecido que permite a visualização precisa e avaliação quantitativa da carga do tumor sem a necessidade de expressar Propriedades bioluminescentes. Imagens do senhor são mais facilmente reproduzíveis com os pipelines de análise adequada e garantidas a visualização em 3D da bexiga. As maiores limitações do MRI são o período de tempo necessário para um exame e custos elevados associados que limitam os ensaios de alto rendimento. No entanto, vários estudos têm mostrado que o Sr. sequências podem fornecer imagens de diagnósticos de alta qualidade que podem ser usadas para efetivamente detectar e monitorar tumores de bexiga baseado em linhas de células; assim, eles podem ser usados para alto throughput análise^9,12.

Aqui, descrevemos um método não invasivo, baseado em senhor de forma confiável e eficiente caracterização de tumores de bexiga induzida por substância cancerígena em ratos. Para fazer isso, usamos uma imagem rápida com estado estacionário precessão senhor técnica (FISP verdadeiro), que garante curtas sessões de digitalização enquanto ainda fornece alta qualidade e alta resolução espacial (~ 100 mícrons) para a detecção e medição da bexiga tumores¹³. Além disso, para confirmar a precisão deste teste não-invasivo de MRI, descrevemos a correlação entre parâmetros derivados de MRI e ex vivo peso na bexiga, bem como palco de tumor patologicamente confirmado.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Northwestern.

1. indução de tumores com BBN

1. Obter camundongos C57/BL6 machos, pelo menos 6 semanas de idade.
   Nota: Camundongos machos desenvolvem câncer de bexiga, mais rápida e consistente do que ratos fêmeas^14,15.
2. Adicione N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) amina (BBN) na dose de 0,05% para a água potável. Armazená-lo em um recipiente opaco e fornecê-la ad libitum como água potável para ratos¹⁶.
   Nota: Armazenar a solução BBN em um recipiente transparente irá degradar o carcinógeno¹⁷.
3. Mude a água do BBN 0,05% duas vezes por semana.
4. Monitore os animais por meio da inspeção de sinais de perigo associado com tumores de bexiga, incluindo massas, firme na bexiga e hematúria. Inspecione os ratos duas vezes por semana ou de acordo com orientações IACUC locais.
5. Espero que os tumores desenvolver entre 16 e 24 semanas de exposição¹⁸.

2. instalação MRI

1. Realizar uma injeção subcutânea de solução salina estéril (0,1-0,2 mL, utilizando uma seringa de 1 mL e agulha de 25-27 G) 10 min antes da ressonância magnética para facilitar o enchimento da bexiga.
2. Anestesia a cada rato com uma mistura de gás de 100% O₂ e isoflurano (2-4% conforme necessário). Verifique se um plano adequado de anestesia por testar o reflexo de retirada (pitada de dedo do pé) antes de prosseguir. Aplica a pomada estéril para o animal.
3. Transferi o mouse para o titular da imagem latente, equipado com um cone de nariz para entrega de inalado isoflurano (0,5 – 3%).
4. Monitorar a temperatura corporal e respiração usando uma sonda de temperatura retal conectada ao computador de gravação fisiológica.
   Nota: A temperatura Normal do corpo (36 – 37 ° C) é mantida usando o circuito de água quente recirculação incorporado o animal titular Sr. Temperatura é medida através de um sensor retal e gravada no computador monitoramento fisiológico usando software de monitorização fisiológico dedicado. O mesmo sistema é usado para gravar os sinais de respiração e eletrocardiograma, medidos através de um travesseiro pneumático colocado sob a caixa torácica e através de eletrodos de eletrocardiograma de 3 derivações. O sinal de respiração também é usado para acionar a aquisição de MRI e reduzir artefatos associados com o movimento de respiração.

3. aquisição de imagens de MRI

1. Utilize uma bobina de corpo de quadratura para a excitação.
2. Coloque uma bobina do receptor de 4 canais na parte inferior do abdome do mouse sendo digitalizado para habilitar a detecção de otimizado dos sinais da região de interesse.
3. Inicie os ajustes automáticos através do software de imagem integrado para adquirir um conjunto tri-axial de imagens do corpo inteiro do mouse. Este conjunto de referência de imagens, identifica a região de interesse (no caso, a região da bexiga).
4. Adquira três conjuntos de imagens ortogonal cortado ao longo das planos axiais, coronais e sagitais, usando referenciais radiológicas.
5. Utilizar o verdadeiro FISP imagem sequência (incluída como uma das características do software de imagem integrado) com os seguintes parâmetros de senhor: TR = 900 ms, TE = 2 ms, FA = 70, 14 médias.
   Nota: Este conjunto de parâmetros permite a rápida geração de imagens com alta qualidade de diagnóstica, incluindo a ponderação T1/T2 em < 10 min por rato.
6. Espessura de resolução e fatia espacial são determinados pelos parâmetros geométricos selecionados pelo usuário através da interface gráfica de plataforma de imagem. Isso resulta em uma série de fatias em toda a bexiga toda de 0,5 mm de espessura, com uma resolução no plano de 0,148 mm.

4. análise de imagem do senhor

1. Identifica o conjunto de fatias de 0,5 mm de espessura e resolução no plano de 0,148 mm, cobrindo a bexiga toda.
2. Exportar para o software de análise de imagens médicas, selecionando a pasta com as imagens correspondentes em formato ANALYZE.
3. Selecione "vista axial representativa" no centro da bexiga para análise quantitativa percorrer as imagens geradas e identificando uma fatia no ponto médio da bexiga, que permite a visualização da parede da bexiga e lúmen.
   Nota: A fatia do centro deve ser o escolhido com o maior diâmetro.
4. Cuidadosamente, delinear a região de interesse (ROI) traçando manualmente as fronteiras em torno da borda exterior da bexiga (BLA_{para fora}) e em torno do lúmen interno da bexiga (BLA_em) (ver figuras representativas e esquemáticas na Figura 2) na vista axial representante selecionada.
5. Subtrai o lúmen interno da borda exterior para calcular a área de superfície da parede da bexiga.
   BLA_parede = BLA_fora - BLA_em
   Nota: A área da superfície de uma bexiga de controle com nenhum tumor deverá ser menor do que com um tumor na bexiga.

5. eutanásia e dissecação da bexiga

1. Após 20 semanas de exposição BBN, eutanásia os ratos usando procedimentos habituais de funcionamento em conformidade com diretrizes IACUC locais.
2. Limpe a área da incisão com etanol a 70%, em seguida, segure e levante a pele da parede abdominal com fórceps.
3. Fazer uma incisão da sínfise púbica ao processo xifoide.
4. Incise agudamente a cavidade peritoneal, segurando com fórceps e incisão com uma tesoura.
5. Identifica a bexiga, que está localizada na parte inferior do abdome na linha média.
6. Identificar e cortar o ligamento umbilical mediano, conectando a cúpula da bexiga ao umbigo e parede abdominal.
7. Agarre a cúpula da bexiga com fórceps para fornecer aonde e dissecar a bexiga longe em torno de estruturas, incluindo as vesículas seminais, reto e gordura.
8. Identificar os ureteres entram na bexiga e corte com tesoura perto da bexiga.
9. Levantamento da bexiga cefálica, corte da uretra com uma tesoura e remover a bexiga.
10. Pese imediatamente a bexiga após enxaguá-lo com PBS.

6. histologic examinação de tecido da bexiga

1. Fixar o tecido da bexiga em formol tamponado neutro de 10% para 36-48 h à temperatura ambiente (RT).
2. Incorporar o tecido em blocos de parafina, cortar as lâminas para exame posterior e manchar os slides com hematoxilina e eosina para exame microscópico conforme descrito anteriormente,^19,20.
3. Realizar um exame microscópico da bexiga em baixo do mouse (2.5 x e x 10) e ampliações de alta (20x e 40x), examinando para lesões macroscópicas, hiperplasia, carcinoma em situ, papilomas, papilas tumores e neoplasias invasivas^{19 , 21}.

Resultados

Usando o protocolo descrito (Figura 1), tumores de bexiga foram induzidas em camundongos C57/B6 do sexo masculino. MRI foi feito em 16 semanas, e os ratos foram sacrificados às 20 semanas. Ex vivo bexiga pesos (BW) para cada mouse foram gravados. Lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina, e todas as lâminas de histologia foram analisadas para a fase do tumor.

Para analisar o fardo ...

Discussão

Imagem exata dos modelos de tumor é necessária para o adequado estadiamento pré-eutanásia e randomização animal antes do início do tratamento experimental. Usando o procedimento aqui apresentado, demonstramos a metodologia para (1) gerar tumores de bexiga, usando o carcinógeno BBN e (2) estratificar o fardo de tumor de bexiga com o uso de derivados de um senhor Mr área medida (BLA_parede) correlaciona-se significativamente com ex vivo peso na bexiga e está associada com a fase patológica do ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	664	Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)	TCI American	B0938	Carcinogen
0.9% normal saline	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
Isoflurane	Piramal HealthCare	60307-120-25	Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI	Bruker	NA	Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo	Siemens	NA	MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System	Small Animal Instruments, Inc. (SAII)	NA	Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%	Sigma	HT501128	Fixative
Eosin Y	Fisher Scientific	NC1093844	Histologic staining agent
Hematoxylin	Fisher Scientific	23-245651	Histologic staining agent
Jim7	Xinapse Systems	NA	Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	Graphing software
R v3.4.2	The R Project for Statistical Computing	NA	Statistical software
R package pROC v1.10.0.	The R Project for Statistical Computing	NA	ROC analysis